RNA interference in livestock [Elektronische Ressource] : knockdown of the porcine whey protein beta-lactoglobulin and the tumor suppressor protein p53 / Claudia Merkl

Claudia Berger

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• Publié par: technische_universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 18
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 16 Mo

Extrait

Abstract 1
TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN
Lehrstuhl für Biotechnologie der Nutztiere

RNA Interference in livestock
Knockdown of the porcine whey protein
Beta-Lactoglobulin
and the tumor suppressor protein p53

Claudia Merkl

Vollständiger Abdruck der von der Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan
für Ernährung, Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München zur
Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
genehmigten Dissertation.

Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. J. Bauer

Prüfer der Dissertation: 1. Univ.-Prof. A. Schnieke, Ph.D.
2. Univ.-Prof. Dr. M. Klingenspor


Die Dissertation wurde am 09.12.2009 bei der Technischen Universität München
eingereicht und durch die Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für
Ernährung, Landnutzung und Umwelt am 19.04.2010 angenommen.
Abstract 2






Für meine Eltern





"Two things are necessary for our work:
inexhaustible stamina and
the readiness to throw away something
in which one has invested a lot of time and work.”
Albert Einstein

“Nothing shocks me. I’m a scientist.”
Indiana Jones







Abstract III
Abstract
RNA interference (RNAi) is a mechanism for sequence-specific gene silencing. It is initiated
by short double stranded RNAs within a cell, leading to degradation of homologous mRNAs.
This results in a reduction of the corresponding protein within the cell, mimicking loss-of-
function mutations. RNAi is a routine technology in mice but application in large animals is
not yet well established. In this work, RNAi mediated knockdown in pigs should be evaluated
as an alternative to gene knockout by gene targeting.
Two target genes, the porcine milk whey protein Beta-Lactoglobulin (BLG) and the porcine
tumor suppressor protein p53 were downregulated by RNAi. Moreover, two widely used
RNAi vector systems, based on short hairpin RNAs (shRNAs) and artificial microRNAs
(miRNAs), were compared.
The porcine milk whey protein Beta-Lactoglobulin (BLG) was chosen as a first target. The
function of this protein is unknown and the bovine BLG protein is a major factor involved in
cows’ milk allergy and intolerance in children. ShRNAs were designed for the knockdown of
porcine BLG and in preliminary experiments, two sequences leading to efficient
downregulation were identified. These RNAi sequences were then also inserted into an
artificial miRNA expression vector with different promoters (CMV, PGK, ovine BLG
promoter). Cell lines expressing recombinant porcine BLG were established for the
evaluation of knockdown efficiencies and the most promising shRNA and artificial miRNA
construct used for the generation of RNAi transgenic porcine fetuses by somatic cell nuclear
transfer. The obtained fetuses were transgenic for artificial miRNA constructs. However
analysis of the RNAi transgenic fetuses by small RNA northern blot did not show detectable
expression of the artificial miRNA.
The porcine tumor suppressor protein p53 was chosen because of its importance in cancer
biology. Knockdown of p53 might serve as an alternative to gene knockout for the creation of
an animal model for Li-Fraumeni syndrome, an inherited human cancer syndrome. ShRNAs
and artificial miRNAs were designed against similar sequence positions of porcine p53
mRNA. The knockdown of porcine p53 was evaluated in a variety of assays and not all
sequences showed the same knockdown potential. The most reliable prediction of the in vivo
knockdown level is most likely provided by the downregulation of endogenous p53 in primary
porcine cells. In these cells, two shRNAs and two artificial miRNAs showed up to 85%
knockdown of endogenous p53. It was shown that shRNA and artificial miRNA were equally
effective, depending on the target sequence. Additionally, the downregulation of porcine p53
by one artificial miRNA resulted in an enhanced resistance to the chemotherapeutic drug
doxorubicin indicating a functional knockdown of porcine p53.
Zusammenfassung IV
Zusammenfassung
RNA Interferenz (RNAi) ist ein Mechanismus zur sequenz-spezifischen Stilllegung von
Genen. Er wird durch kurze doppelsträngige RNAs in Zellen ausgelöst und führt zum Abbau
von homologen mRNAs. Dadurch wird ein Effekt ähnlicher einer loss-of-function Mutation
erzielt. Die RNAi Technologie ist in Nutztieren bisher kaum etabliert. Im Rahmen dieser
Arbeit sollte ermittelt werden, ob RNAi vermittelte Herabregulierung von Genen als
Alternative zu gene knockout mittels gezielter Genmodifikation in Schweinen dienen kann.
Zu diesem Zweck wurden zwei porzine Zielgene, das Molkeprotein Beta-Lactoglobulin (BLG)
und das Tumorsuppressor Protein p53, ausgewählt. Zudem wurden zwei Vektorsysteme für
RNAi, short hairpin RNAs (shRNAs) und künstliche mikroRNAs (miRNAs), verglichen.
Das porzine Molkeprotein Beta-Lactoglobulin wurde als erstes Zielgen ausgewählt. Die
Funktion dieses Proteins ist unbekannt und bovines BLG ist einer der Auslöser für
Kuhmilchallergie und -intoleranz bei Kindern. Für erste Untersuchungen wurden shRNAs
gegen porzines BLG konstruiert und zwei Sequenzen mit effektiver Herabregulierung
identifiziert. Diese Sequenzen wurden dann auch in einen Expressionsvektor für künstliche
miRNAs mit unterschiedlichen Promotoren (CMV, PGK, oviner BLG Promotor) eingefügt. Für
die Beurteilung der knockdown Effizienzen der Konstrukte wurden Zelllinien mit Expression
von rekombinantem BLG etabliert. Die Vektoren mit der höchsten Effizienz wurden
verwendet um durch somatischen Kerntransfer transgene Schweine zu erzeugen. Die
erhaltenen Föten trugen künstliche miRNA Konstrukte, allerdings konnte mittels Northern
Blot keine Expression von miRNAs gegen BLG nachgewiesen werden.
Das Tumorsuppressor Protein p53 wurde als Zielgen ausgewählt, da es eine wichtige Rolle
in der Krebsentstehung spielt. Es sollte ermittelt werden, ob eine Herabregulierung von p53
als Alternative zu einem gene knockout für die Erstellung eines Großtier-Modells für eine
menschliche Erbkrankheit, das Li-Fraumeni-Syndrom, dienen kann. Zu diesem Zweck
wurden shRNAs und künstliche miRNAs gegen ähnliche Sequenzpositionen der p53 mRNA
ausgewählt. Diese Sequenzen wurden in verschiedenen Testsystemen untersucht und nicht
alle Sequenzen zeigten in diesen Untersuchungen das gleiche Potential. Die verlässlichste
Aussage bezüglich eines in vivo Effekts ist sehr wahrscheinlich die Herabregulierung von
endogenem porzinem p53 in Primärzellen. In diesen Zellen konnten je zwei shRNAs und
künstliche miRNAs die Menge an p53 Protein unabhängig vom verwendeten Vektorsystem
um bis zu 85% reduzieren. Zudem führte die Herabregulierung von p53 mit einer künstlichen
miRNA Sequenz zu einer erhöhten Resistenz gegenüber dem Chemotherapeutikum
Doxorubicin. Dies deutet auf einen funktionalen knockdown von p53 hin.
Table of contents V
Table of contents
1 INTRODUCTION ..................................................................................................................... 1
1.1 GENETICALLY MODIFIED ANIMALS IN SCIEN C.E................................................................................ 1
1.2 RNA INTERFERENCE .................................................................................................................. 8
1.2.1 OVERVIEW OFR NA MEDIATED GENE SILENCING ........................................................... 8
1.2.2 MECHANISMS OF RNA INTERFERENCE MEDIATED GENE SILENCIN G................................ .1.0 ................
1.2.3 APPLICATIONS OF RNA MEDIATED GENE SILENCING .................................................... 16
1.3 TARGET GENES AND PROTEINS FORRN A INTERFERENCE ................................................................... 17
1.3.1 BETA-LACTOGLOBULIN (BLG) ........................................................... .1.8 .............
1.3.2 TUMOR SUPPRESSOR PROTEIN 5P3 .................................................. .2.2 .......................
1.4 AIM ................................................................................................................................... 26
2 MATERIAL AND METHODS ................................................................................................. 28
2.1 MATERIALS .......................................................................................................................... 28
2.1.1 EQUIPMENT ................................................................................ 28
2.1.2 CONSUMABLES .............................................................................................................................. 29
2.1.3 CHEMICALS ................................................................................. 30
2.1.4 KITS ........................................................................................... 31
2.1.5 REVERSE TRANSCRIPTASE AND POLYMERASES ............................................................ 3