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Etude pharmacologique de la voie de signalisation impliquée dans l'apoptose des péricytes rétiniens

De
64 pages
RESULTATS 119 120 121 L?objectif de ce travail de thŁse a consistØ dans un premier temps tester l hypothŁse que les produits avancØs de glycation (AGE) peuvent induire l apoptose des pØricytes rØtiniens en culture et dans l affirmative explorer la voie de signalisation intracellulaire mise en jeu au cours de ce processus apoptotique. Nous avons ainsi utilisØ des cultures primaires de pØricytes rØtiniens purifiØs partir de microvaisseaux de b uf. Nous avons utilisØs des cultures primaires et non des lignØes cellulaires afin de conserver la morphologie et la fonction des cellules natives. Pour les mŒmes raisons, les pØricytes ont ØtØ utilisØs jusqu au deuxiŁme passage seulement. En effet, ? partir du troisiŁme passage, des changements morphologiques (cellules gØantes) et un ralentissement de la prolifØration ont ØtØ observØs. Nous avons analysØ les effets cellulaires d AGE prØparØs partir d albumine de sØrum de b uf modifiØe par le mØthylglyoxal. La concentration de mØthylglyoxal utilisØe pour la rØaction de glycation de l albumine a ØtØ choisie de sorte induire des modifications sur les (des) rØsidus arginine et lysine, menant la formation de divers adduits d AGE, comme argpyrimidine, des imidazolones, la CEL et MOLD ...
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      Lobjectif de ce travail de thèse a consisté dans un premier temps à tester lhypothèse que les produits avancés de glycation (AGE) peuvent induire lapoptose des péricytes rétiniens en culture et dans laffirmative à explorer la voie de signalisation intracellulaire mise en jeu au cours de ce processus apoptotique. Nous avons ainsi utilisé des cultures primaires de péricytes rétiniens purifiés à partir de microvaisseaux de buf. Nous avons utilisés des cultures primaires et non des lignées cellulaires afin de conserver la morphologie et la fonction des cellules natives. Pour les mêmes raisons, les péricytes ont été utilisés jusquau deuxième passage seulement. En effet, à partir du troisième passage, des changements morphologiques (cellules géantes) et un ralentissement de la prolifération ont été observés. Nous avons analysé les effets cellulaires dAGE préparés à partir dalbumine de sérum de buf modifiée par le méthylglyoxal. La concentration de méthylglyoxal utilisée pour la réaction de glycation de lalbumine a été choisie de sorte à induire des modifications sur les (des) résidus arginine et lysine, menant à la formation de divers adduits dAGE, comme argpyrimidine, des imidazolones, la CEL et MOLD (Westwood et al., 1994; Shiponava et al., 1997). Ces différents AGE dérivant du méthylglyoxal ont été décrits comme les modifications chimiques majeures observées dans les protéines tissulaires chez le diabétique (Degenhardtet al., 1998; Shamsiet al., Au cours de ce travail, nous avons donc utilisé des AGE- 1998). MGX représentatifs dAGE qui saccumulentin vivoau cours du diabète. Les effets des AGE-MGX ont été testés sur des cellules en prolifération pendant deux passages, soit environ 15 jours. Une limitation de notre modèle de culture est que le renouvellement des péricytes dans les microvaisseaux rétiniens est très faible (Engermanet al.,1967). Néanmoins ce modèle, déjà utilisé par nous-même (Pagetet al.,1998) et dautres (Portaet al., 1994),été choisi afin de reproduire une certaine chronicité de lenvironnement diabétique des péricytes rétiniens.     
 
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 CHAPITRE I  EFFETS D'AGENTS IMPLIQUES DANS LE DIABETE (AGE ET GLUCOSE) SUR L’APOPTOSE DES PERICYTES RETINIENS   Lune des premières altérations structurales observées au cours de la rétinopathie diabétique est la disparition sélective des péricytes. Les travaux réalisés à partir de rétines humaines prélevéespost-mortemchez des diabétiques ont permis de montrer que les péricytes mourraient par apoptose (Mizutaniet al.,1996, Li W.et al.,1997, Podestaet al.,2000), mais les agents inducteurs dun tel mécanisme nont pas été clairement identifiésin vivo. De nombreux travaux ont mis en évidence la toxicité des AGE sur les péricytesin vitro (Yamagishiet al., 1995; Chibberet al., 1997; Ruggiero-Lopezet al., et 1997)in vivo (Hammeset al.,1991). Lobjectif de létude a été de tester dans un premier temps si les AGE-MGX induisent lapoptose des péricytes en culture et si ce phénomène est associé à une production accrue de diacylglycérols (DAG) et de céramides.  I- EFFETS DES AGE-MGX SUR LES PERICYTES RETINIENS  1- L'apoptose des péricytes  Les péricytes rétiniens ont été cultivés de façon chronique durant deux passages (environ 15 jours) en présence de 3µM dAGE-MGX et de son contrôle. Lapoptose des péricytes a été détectée et quantifiée selon deux méthodes.  Dans un premier temps, nous avons observé et quantifié les cellules apoptotiques par un marquage à lannexine V et à liodure de propidium. Cette technique met en évidence la translocation de la phosphatidylsérine du feuillet interne vers le feuillet externe de la membrane plasmique, phénomène biochimique observé au cours de la nécrose et de lapoptose. Lannexine V, marquée à la fluorescéine, colore ainsi en vert les membranes plasmiques des cellules nécrotiques et apoptotiques, mais seules les cellules nécrotiques, dont la membrane plasmique a perdu son intégrité, sont perméables à liodure de propidium colorant ainsi leur noyau en rouge (Figure 24-A). La proportion des cellules apoptotiques
 
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 représente 8,9 ± 1,1% (n = 10) du total des péricytes cultivés avec 3 µM dAGE-MGX contre 2,9 ± 0,34% des cellules cultivées avec la BSA-contrôle (Figure 24-B). Ainsi, les AGE-MGX induisent une augmentation dun facteur 3 du taux dapoptose dans les péricytes. Aucune cellule nécrotique na été observée (<0,1%).  
A)
*
B) 12 10 8 6 4 2 10 µM 0 BSA-contrôle AGE-MGX  Figure 24: Effet des AGE-MGX (3 µM) sur lapoptose des péricytes, détectée par un marquage à lannexine V.  Les cellules ont été cultivées pendant deux passages avec 3 µM dAGE-MGX, ajoutés directement dans le milieu de culture. Lapoptose des péricytes a été détectéeA)et quantifiéeB)par un marquage à lannexine V, comme décrit dans la section Matériel et Méthodes. Les résultats sont exprimés en % de cellules apoptotiques et sont la moyenne ± SD de 10 expériences indépendantes. * p<0,05.   Lapoptose des péricytes induite par les AGE-MGX a également été évaluée qualitativement par un dosage ELISA des oligonucléosomes cytoplasmiques. Au cours de la phase finale du processus apoptotique, lADN génomique subit un clivage internucléosomal, générant des complexes ADN-histones de taille variable, nommés oligonucléosomes, qui migrent du noyau vers le cytoplasme. La quantité de complexes ADN-histones, libérés dans le cytoplasme des péricytes cultivés pendant deux passages avec 3 µM dAGE-MGX, est supérieure à celle détectée dans les cellules contrôles. Dans ces conditions, lenrichissement spécifique en oligonucléosomes cytoplasmiques (R) est de 2,53 ± 0,59 (n = 4) (Figure 25).  Leffet dose-dépendant des AGE-MGX sur lapoptose des péricytes a également été examiné. Les péricytes ont été ainsi cultivés pendant deux passages avec les AGE-MGX (ou son contrôle) aux concentrations de 1, 3, 10 et 20 µM. Lapoptose des péricytes a été détectée et quantifiée par une coloration à lannexine V. Les résultats montrent une réponse apoptotique dose-dépendante des péricytes aux AGE-MGX (n = 3) (Figure 26). Le facteur 3
 
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 daugmentation de lapoptose dans les péricytes cultivés avec 3µM dAGE-MGX est reproduit au cours de cette expérience, bien que les taux dapoptose soient plus faibles (BSA-contrôle: 2,5 ± 0,2% et AGE-MGX: 7,4 ± 0,3%) que ceux observés dans la figure 24. Pour chacune des concentrations testées, aucune cellule nécrotique na été observée (<0,1%).  
 
 
 
 
350 300 250 200 150 100 50 0 BSA-contrôle AGE-MGX Figure 25: Effet des AGE-MGX (3 µM) sur lapoptose des péricytes, évaluée par un dosage des oligonucléosomes cytoplasmiques.  Les cellules ont été cultivées pendant deux passages avec 3 µM dAGE-MGX, ajoutés directement dans le milieu. Lapoptose a été évaluée par un dosage ELISA des oligonucléosomes (voir Matériel et Méthodes). Les résultats, exprimés en % du contrôle, sont la moyenne ± SD de 4 expériences indépendantes. 
BSA-contrôle AGE-MGx
21 18 15 12 9 6 3 0 0 5 10 15 20 25 concentration (µM) Figure 26: Effet concentration-dépendant des AGE-MGX sur lapoptose des péricytes rétiniens.  Les péricytes ont été cultivés pendant deux passages avec des AGE-méthylgloxal (1, 3, 10 et 20 µM). Lapoptose a été détectée et mesurée par un marquage à lannexine V (voir Matériel et Méthodes). Les résultats, exprimés en % de cellules apoptotiques, sont la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes.  
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 2- La production de DAG et de céramides dans les péricytes  Afin de déterminer si les DAG et les céramides pouvaient être impliqués dans le signal de transduction menant à lapoptose, ces deux composés ont été dosés dans les péricytes incubés pendant deux passages avec 3 µM dAGE-MGX ou son contrôle. La technique de dosage employée est basée sur la phosphorylation des DAG et des céramides par la DAG-kinase dEscherichia colien présence de [γP32Nous avons pu mettre en évidence une]ATP. stimulation de la production des DAG (+ 94 ± 9%, n = 10) et des céramides (+ 85 ± 12 %, n = 10) dans les péricytes rétiniens en réponse aux AGE-MGX (Figure 27).  
*
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BSA-contrôle AGE-MGX
240 200 160 120 80 40 0 DAG céramides  Figure 27: Effet des AGE-MGX (3 µM) sur la production des céramides et des DAG dans les péricytes.  Les cellules ont été cultivées pendant deux passages avec 3 µM dAGE-MGX. Les céramides et les DAG ont été mesurés par la méthode enzymatique de la DAG-kinase, comme décrit dans la section Matériel et Méthodes. Les résultats sont exprimés en % du contrôle et sont la moyenne ± SD de 10 expériences indépendantes. La quantité de céramides mesurées dans les cellules contrôles (100 %) est de 704 ± 170 ng de céramides/mg de protéines. La quantité de DAG mesurée dans les cellules contrôles (100 %) est de 618 ± 141 µg de DAG/mg de protéines. * p<0,05.  II- EFFETS DU GLUCOSE SUR LES PERICYTES RETINIENS  Afin de vérifier si de fortes concentrations de glucose induisent également lapoptose des péricytes, les cellules ont été cultivées pendant deux passages dans un «milieu contrôle» (contenant 5 mM de glucose), un milieu contenant 25 mM de glucose total ou 20 mM de mannitol (control osmotique). Lapoptose a été mesurée par un marquage à lannexine V. Cette méthode, fiable et quantitative, fournit une mesure de lapoptose comparable au dosage des oligonucléosomes (Figures 24 et 25). Un traitement des péricytes na pas altéré le taux basal dapoptose observé dans le «milieu contrôle» (Figure 28-A). La proportion de cellules  126
 apoptotiques dans les péricytes incubés avec le glucose (2,7 ± 0,25%, n=3) ou le mannitol (2,4 ± 0,13%, n=3), est en effet comparable à celle mesurée dans les péricytes cultivés avec le «milieu contrôle» (2,3 ± 0,1%, n=3). Le dosage des DAG et des céramides a permis de mettre en évidence que le niveau endogène de ces deux médiateurs lipidiques na également pas été affecté. Les quantités de DAG et de céramides mesurées dans les péricytes cultivés avec le glucose (108 ± 7,4% et 102 ± 4,7% respectivement) et avec le mannitol (102 ± 1,5% et 98 ± 4,4%) ne sont pas différentes de celles dosées dans les cellules contrôles (Figure 28-B).  
 
 
 
A)
Glucose 25 mM
Mannitol 20 mM
DAG CERAMIDES
3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Contrôle 5 mM B)140 120 100 80 60 40 20 0 Contrôle Glucose Mannitol 5 mM 25 mM 20 mM Figure 28: Effets dune forte concentration de glucose sur lapoptose et la production de céramides et de DAG dans les péricytes.  Les péricytes ont été cultivés pendant deux passages (15 jours environ) avec 5 mM de glucose (contrôle 5mM), 25 mM de glucose total (glucose 25 mM) ou 20 mM de mannitol (Mannitol 20 mM).A)Lapoptose a été détectée et mesurée par un marquage à lannexine V, comme décrit dans la section Matériel et Méthodes. Les résultats, exprimés en % de cellules apoptotiques, sont la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes.B) Les céramides et les DAG ont été dosés par la méthode de la DAG-kinase (voir Matériel et Méthodes). Les résultats, exprimés en % de variation du contrôle, sont la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes. La quantité de céramides mesurés dans les cellules contrôles (100 %) est de 690 ± 110 ng de céramides/mg de protéines. La quantité de DAG mesurés dans les cellules contrôles (100 %) est de 640 ± 126 µg de DAG/mg de protéines. 
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 III- IMMUNODETECTION DU RECEPTEUR AUX AGE, RAGE, SUR LES PERICYTES RETINIENS  Nous avons examiné par immunodétection si le récepteur aux AGE, RAGE, est bien présent dans les péricytes rétiniens bovins et si son niveau dexpression est modifié en présence des AGE-MGX. Des protéines de lysats cellulaires de péricytes traités par les AGE-MGX (ou son contrôle) ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide puis transférées sur membrane de nitrocellulose. Celle-ci a été révélée à laide dun anticorps anti-RAGE, préincubé ou non avec son peptide bloquant, afin de mettre en évidence une reconnaissance antigénique spécifique. Lintensité des bandes a été standardisée en quantifiant lα-actine contenue dans chaque piste. Lutilisation de cette protéine comme standard interne est fiable, puisquelle nest pas clivée par des caspases dans les péricytes apoptotiques (Shojaeeet al., 1999), comme c'est le cas dans d'autres types cellulaires (Mashimaet al.,1997). Les résultats montrent la détection de trois bandes dans les pistes 1 et 2, une bande migrant comme une protéine de masse apparente de 50 kDa de forte intensité et deux bandes de plus faible intensité migrant comme des protéines de masses apparentes de 36 et 37 kDa (Figure 29), reconnues spécifiquement. En effet, la pré-incubation de lanticorps anti-RAGE avec son peptide bloquant abolit la reconnaissance antigénique (pistes 4 et 5) de ces trois protéines. Lintensité des bandes de 36 et 37 kDa (piste 2), ramenée à la quantité protéique déposée (α-actine) pour chaque échantillon, est augmentée de 30% par rapport à celle des bandes dans la piste 1. En revanche, le niveau de révélation de la protéine de 50 kDa reste inchangé lorsque les péricytes sont soumis aux AGE-MGX.            
 
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130 90 55 43 34
- - - + +Peptide bloquant
p50 RAGE (p37 et p36)
42α-actine 1 2 3 4          5 Figure 29: Immunodétection de RAGE des péricytes rétiniens Les péricytes ont été cultivés pendant deux passages avec 3 µM dAGE-MGX (pistes 3 et 5) ou son contrôle (pistes 2 et 4). Les cellules ont été lysées dans un tampon dénaturant contenant des inhibiteurs de protéases (voir Matériel et Méthodes). Les standards de masse moléculaire (MM) (1 µl) (piste 1), les protéines de lysats cellulaires (20 µg) (pistes 2, 3, 4, 5) ont été séparés par SDS-PAGE sur des gels de polyacrylamide de 12% et transférés sur une membrane de nitrocellulose (voir Matériel et Méthodes). La membrane de nitrocellulose a été révélée à laide dun anticorps primaire polyclonal de chèvre anti-RAGE humain, préincubé ou non avec le peptide bloquant, et un anticorps secondaire anti-chèvre de singe couplé à la peroxydase de raifort et révélée par chimioluminescence (voir Matériel et Méthodes). Puis la membrane a été lavée et de nouveau révélée à laide de lanticorps anti-α-actine de souris et un anticorps anti-souris couplé à la peroxydase de raifort (voir Matériel et Méthodes). Les masses moléculaires des protéines sont estimées à laide d'un mélange de protéines de masse moléculaire connue (MM). Limmunodétection présentée ici est représentative de 2 expériences indépendantes.   IV- DISCUSSION  Nous avons analysé les effets des AGE-MGX sur lapoptose des péricytes au moyen de deux techniques mettant en évidence des altérations biochimiques induites au cours du processus apoptotique: lexpression de la phosphatidylsérine (PS) à la surface externe de la membrane plasmique (Brattonet al., 1997) et la dégradation de lADN génomique générant des fragments doligonucléosomes de tailles variables (Wyllie, 1980).
 
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