Spectroscopic and Functional Characterization of the Heme Proteins Nitrophorin 4, Nitrophorin 7, and Selected Site-Directed Mutants: Studies of Their Nitrite Reactivity and of the Ferroheme Forms [Elektronische Ressource] / Chunmao He

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• Publié le: 01 janvier 2012
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• Langue: English
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Extrait

Spectroscopic and Functional Characterization of the
Heme Proteins Nitrophorin 4, Nitrophorin 7, and Se-
lected Site-Directed Mutants: Studies of Their Nitrite Re-
activity and of the Ferroheme Forms
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
vorgelegt von
Chunmao He
aus Chenzhou, P.R.China
Mülheim an der Ruhr, December 2011 Aus dem Max-Planck-Institut für Bioanorganische Chemie, Mülheim an der Ruhr
Gedruckt mit der Genehmigung der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
Referent: Prof. Dr. Wolfgang Lubitz
Koreferent: Prof. Dr. Henrike Heise
Tag der mündlichen Prüfung: 13.12.2011 Acknowledgements
The work presented here would not have been possible without the enormous support
from the following people.
First of all, I would like to thank Professor Dr. Wolfgang Lubitz for his kind support of this
project and being my supervisor. Professor Dr. Henrike Heise is also acknowledged for
being the co-supervisor of my PhD study, and her critically reading of this thesis.
Dr. Markus Knipp, who guided me through the whole project, is such a nice tutor show-
ing me not only how experiments are running, but also how interesting it is to run the ex-
periments. His broad scientific background and attitudes towards science have great in-
fluence on this work and also on me in developing my way of doing science.
Mrs. Johanna J. Taing is gratefully acknowledged for her endless and beautiful work on
the expression of the nitrophorins, which made my life much easier in the lab. We al-
ways had trainees and students from time to time in the lab, namely Mr. Fabian Kal-
veram, Ms. Alina Steinbach, Ms. Robyn L. Kosinsky, and Mrs. Katrin Wrede. Their con-
tributions to this work should also be acknowledged.
Dr. Hideaki Ogata is gratefully acknowledged for his nice work on the crystallization of
nitrophorins, without which most of our work would be much more difficult. Dr. Koji Nishi-
kaw and Ms. Yvonne Brandenburger joined his team later on. I would also like to thank
Dr. Martin Fuchs (Swiss Light Source at Paul Scherrer Institut), who helped us measur-
ing the combined diffraction and UV/vis absorption spectra on the crystals of
NP4(L130R).
Dr. Maria-Eirini Pandelia and Mr. Ian McPherson (University of Oxford) are gratefully ac-
knowledged for their critically reading of part of this thesis. Mr. Thomas Lohmiller is
gratefully acknowledged for his translation of the abstract into zusammenfassung.
iThe technical assistance from Mr. Jan Hanis, Mrs. Marion Stapper, Mr. Leslie Currell,
Mrs. Gudrun Klihm, Mr. Frank Reikowski, and Mr. Norbert Dickmann was essential to my
experimental work.
I would like to thank Mrs. Gülümse Koç, Mrs. Rita Gröver, Mrs. Birgit Deckers and Mr.
Stephan Kempkes who helped me with the office and personnel cases, so that adaption
to Germany became much easier.
We had a long time collaboration with Professor Dr. Cristiano Viappiani (University of
Parma, Italy) and his team (Dr. Stefania Abbruzzeti, Dr. Stefano Bruno, and Mr. Ales-
sandro Tinozzi) on the laser flash photolysis of the CO complexes. I would like to thank
them for their kindness during my stay in Parma.
Finally, my dad and mom not only gave me my life, brought me up, more importantly
they also show me how to be a kind human being with their examples. They always pro-
vide me a warm, safe, and supportive harbor. My wife Juan Liu is always there listening
to me, giving suggestions to me, and accompanying me.


iiZusammenfassung
Hämproteine sind sehr wichtig für lebende Organismen, wo sie an verschiedenen meta-
bolischen Funktionen wie Katalyse, Elektronentransfer sowie der Erkennung und dem
Transport gasförmiger Moleküle beteiligt sind. Nitrophorine (NP) bilden eine Familie von
Ferrihäm b-Proteinen aus dem Speichel des blutsaugenden Insekts Rhodnus prolixus.
Diese Hämproteine sequestrieren und stabilisieren NO, das von der Stickstoffmonoxid-
Synthase (NOS) in den Endothelialzellen der Speicheldrüsen produziert wird. Während
das Insekt Blut saugt, injiziert es gleichzeitig seinen Speichel in das Gewebe des Opfers,
wo das an das Häm-Eisen koordinierte NO freigesetzt wird. Es existieren mindestens
fünf Isoformen innerhalb der NP-Proteinfamilie, NP1-4 und NP7. Von diesen ist NP7 am
wenigsten gut untersucht, obwohl es äußerst interessant im Hinblick auf seine einzigar-
tige Phospholipidmembran-Bindefähigkeit und seine, verglichen mit den anderen NP
sehr verschiedene Häm-Bindestelle ist. Daher behandelt diese Arbeit insbesondere
NP7, wenngleich zu Vergleichszwecken auch NP4 untersucht wurde, da es die am bes-
ten charakterisierte Isoform ist und hochaufgelöste Strukturen davon existieren. Wo nö-
tig, wurden sequenzspezifisch mutierte Proteinvarianten von NP4 und NP7 hergestellt
und verwendet.
Erst kürzlich wurde die Hypothese aufgestellt, dass NP auch katalytische Eigenschaften
–besitzen. In der vorliegenden Arbeit wurde NO als Substrat von NP4 und NP7 in Be-2
tracht gezogen. Obwohl es oft vorwiegend als physiologisch unerwünschte Verbindung
–angesehen wird, ist NO in großen Mengen (500 nM – 10 μM) im menschlichen Blut-2
plasma und Gewebe vorhanden. Vor Kurzem wurde es als die häufigste intravaskuläre
–Speicherform von NO beschrieben. Nach Inkubation von NO mit NP4 oder NP7 bei 2
neutralem pH wurde beobachtet, dass NO gebildet wird und das andere Produkt als
–NO identifiziert. Die Stöchiometrie wurde als die der Nitrit-Disproportionierungsreaktion 3
iiibestimmt. Durch Absorptions- und EPR-Spektroskopie wurde außerdem gezeigt, dass
NP4 und NP7 in Anwesenheit des NO- Reaktanden Phenyl-4,4,5,5-
tetramethylamidazolin-1-oxyl-3-oxid (PTIO) als Katalysatoren dieser Reaktion wirken, da
mehrere Formelumsätze möglich sind.
–Um den Reaktionsmechanismus zu verstehen, wurden die Ausgangskomplexe von NO2
mit NP4 und NP7 mittels UV/Vis Absorptionsspektroskopie, Resonanz-Raman- (RR-),
EPR-Spektroskopie und Stopped-Flow-Kinetik untersucht. Diese Studien ergaben zu-
– 1sammen mit kristallografischen Untersuchungen von Wildtyp-NP4-NO einen -N-2
–Bindungsmodus, wie er für die meisten NO -Komplexe von Ferrihäm-Modellen und -2
Proteinen typisch ist. In einer anderen Versuchsreihe wurde eine Proteinmutante durch
Austausch von Leuzin-130 in der distalen Häm-Bindestelle von NP4 gegen eine Arginin-
Seitenkette erzeugt. Verglichen mit wildtyp-NP4 zeigte diese Mutante eine sehr viel ge-
–ringere Reaktivität gegenüber NO . Der signifikanteste Unterschied dabei ist, dass das 2
–Netzwerk von Wassermolekülen, das im Wildtyp Aspartat-30 mit NO verbindet, in 2
NP4(L130R) unterbrochen ist. Es wird angenommen, dass Aspartat-30 einen außerge-
wöhnlich hohen pK (5,6 – 7,4) besitzt. Daher erscheint es plausibel, dass Aspartat-30 a
als Protonendonor dient, der essentiell für die Nitrit-Disproportionierungsreaktion ist.
Dies wird zusätzlich durch eine weitere Proteinmutante NP4(D30N), die ebenfalls eine
–verringerte Reaktivität gegenüber NO aufweist, gestützt. 2
Überraschenderweise zeigt die Röntgenkristallstruktur von NP4(L130R), gemessen bei
100 K, eine Koordination von Arginin-130 zum Häm-Zentrum, wohingegen UV/Vis-, RR-
und EPR-Spektren, die sowohl bei Raumtemperatur als auch in gefrorener Lösung auf-
genommen wurden, einen sechsfach koordinierten High-Spin- (6cHS-) Häm-Komplex
mit Wasser als sechstem Liganden ergaben. Durch dosisabhängige Röntgenbestrahlung
von Kristallen, die mittels Mikroabsorptionsspektroskopie beobachtet wurden, konnte
gezeigt werden, dass das Ferrihäm schon durch eine sehr niedrige Dosis (0.45 MGy)
iv
der Röntgenstrahlung reduziert wird. Daher wird eine Koordination von Arginin-130 an
das Ferrohäm bei niedriger Temperatur vorgeschlagen, was zusätzlich durch das RR-
Spektrum bei 77 K des chemisch reduzierten Proteins, unterstützt wird das ein sechs-
fach koordiniertes Low-Spin- (6cLS-) Häm zeigte. NP4(L130R) ist somit das erste Bei-
spiel einer Koordination von Arginin an ein Metalloporphyrin.
IIDer Fe -Oxidationszustand der NP wurde ebenfalls untersucht. Obwohl nicht der natürli-
IIche Oxidationszustand, rückte er vor Kurzem in den Fokus, als das Fe –CO-Derivat als
6isoelektronisches Modell für den {FeNO} -Komplex herangezogen wurde, zum Beispiel
in FT-IR- und Laserblitzlichtphotolyse-Experimenten. Zunächst jedoch wurde der Effekt
des routinemäßig benutzten Reduktionsmittels Na S O auf die Disulfide der NP unter-2 2 4
sucht. Im Überschuss eingesetztes Na S O ist in der Lage, die Disulfidbrücken zu öff-2 2 4
13nen, wie durch C-NMR-Spektroskopie, Reversed-Phase-Chromatographie und Mas-
senspektrometrie nachgewiesen wurde. Ferro-NP4 und -NP7 und ihre NO-Komplexe
wurden dann mittels UV/Vis- und RR-Spektroskopie im Detail charakterisiert. Überra-
schenderweise wurde nur im Fall von NP7 beobachtet, dass die Reduktion zum Aufbre-
IIchen der Fe –N –Bindung