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Informations
Publié par | goethe_universitat_frankfurt_am_main |
Publié le | 01 janvier 2009 |
Nombre de lectures | 35 |
Langue | Deutsch |
Poids de l'ouvrage | 5 Mo |
Extrait
SynthesisandenzymatictestingSynthesisandenzymatictesting
ofreversibleterminators
forsequencingbysynthesis(SBS)
Dissertation
ZurErlangungdesDoktorgrades
derNaturwissenschaften
vorgelegtbeimFachbereichChemie
derJohannWolfgangGoethe–Universität
inFrankfurtamMain
vonAngelikaChristinaKeller
ausErlangen
FrankfurtamMain,Juni2009
Dekan: Prof.Dr.D.Steinhilber
1. Berichterstatter: Prof.Dr.J.W.Engels
2. Berichterstatter: Prof.Dr.A.Heckel
TagdermündlichenPrüfung:
MMeeiinneerr FFaammiilliiee ggeewwiiddmmeett
“Of the three main activities
involved in scientific research
thinking, talking, and doing I
much prefer the last and I am
probablybestatit.Iamallright
at the thinking, but not much
goodatthetalking.”
Frederick Sanger (*1918), biochemist Danksagung Danksagung
Die vorliegende Dissertation wurdeim Zeitraum von April 2006 bis Juni 2009
unter der Anleitung von Herrn Prof. Dr. Joachim W. Engels am Institut für
Organische Chemie und Chemische Biologie der Johann Wolfgang Goethe
UniversitätinFrankfurtamMainangefertigt.
MeinemDoktorvaterHerrnProf.Dr.JoachimW.Engelsmöchteichbezüglich
dersehrinteressantenThemenstellung,derfachlichenUnterstützungsowieder
gewährten akademischen Freiheit zur Anfertigung dieser Arbeit herzlichst
danken.BesondersbedankenmöchteichmichbeiProfessorEngelsauchfürdie
großartigeGelegenheitineineminternationalenArbeitskreistätiggewesenzu
sein, wodurch ein kultureller und fremdsprachlicher Austausch nicht nur im
RahmenvonzahlreichenTagungenimAusland,sondernauchdurchdiedirekte
ZusammenarbeitmitausländischenPostdoktorandensehrgefördertwurde.
Ein ganz besonderer Dank gilt auch meinen EUProjektLaborkollegen und
kolleginnen Frau Dipl.Chem. Diana Knapp, Frau Dr. Dipl.Chem. Jennifer
D’Onofrio und Herrn Dr. Dipl.Chem. Yangzhou Li bezüglich der ausgezeich
netenZusammenarbeitundengagiertenUnterstützungmeinerArbeitinRatund
Tat.DenArraySBSProjektmitgliedernderkollaborierendenFirmen,HerrnProf.
Dr.AntsKurgderFirmaAsperBiotech(Tartu,Estland),HerrnDr.SauliusServa
undDr.ArvydasLubysvonFermentas(Vilnius,Litauen)sowieHerrnProf.Dr.
MaidoRemmderUniversitätTartumöchteichfürdreieinhalbJahreintensiver
Zusammenarbeitdanken.
BesondersherzlichmöchteichauchbeimeinenLaborkollegenundkolleginnen
Frau Dipl.Chem. Nedeljika Seethaler, Frau Dipl.Chem. Olga Frolow, Frau
Dipl.Chem.LenaWicke,FrauB.Sc.ManuelaFichteundHerrnDr.Dipl.Chem.
RomualdasSmiciusfürdreieinhalbJahregroßartigerZusammenarbeitmitviel
Freude, fachlicher Unterstützung und Freundschaft danken. Herrn Stefan
BernhardtdankeichfürdieAnfertigungzahlreicherHPLCAnalytikenundHPLCTrennungen,diedanklustigerUnterhaltungendenArbeitsalltagmitvielSpaß
erfüllthaben.
Meinen Mitarbeitern Frau Dr. Dipl.Chem. Jelena Bozilovic, Frau Dr. Dipl.
Chem.AleksandraZivkovic,FrauDipl.Chem.AlmaSokocevic,FrauDipl.Chem.
Gerda Wittel, Frau Dipl.Chem. Nadja Nikolaus, Frau Dipl.Chem. Juliane
Seufer, Frau Dipl.Chem. Silke Brüß, Herrn Dr. Dipl.Chem. Jens Haas, Herrn
Dipl.Chem.DaliborOdadzic,HerrnDr.Dipl.Chem.SigengHanundHerrnDr.
Dipl.Chem.TaewooKwondankeichfürdasausgezeichneteArbeitsklimaund
die stete Hilfsbereitschaft während der gesamten Promotion, was im
WesentlichenzumGelingendieserArbeitbeigetragenhat.UnsererSekretärin
Frau Ewa Rheinberger danke ich für die Unterstützung in allen
organisatorischen Fragen, von der Beschaffung einfacher Büromaterialien bis
hinzurfachlichenUnterstützungbeiderArraySBSProjektabrechnung.
Ein herzliches Dankeschön gilt auch meinen ehemaligen Praktikanten Daniela
Wirth,AlexanderKrah,MelaniePaetzoldundFlorianMüllerfürdiefreundliche
undtatkräftigeUnterstützungimLaborbeidersynthetischenArbeit.
DesweiterengiltmeinDankdemTeamumHerrnDr.J.G.Zimmermannfürdie
MessungderNMRSpektren,FrauIlonaPrießsowieFrauHanneloreBrillfürdie
schnelle und zuverlässige Messung von ESI/MALDIMassenspektren, die
geduldige Interpretation der Spektren sowie wertvolle Tipps zu meiner
Synthese. Frau Marianne Christof danke ich für zügige Anfertigung der
ElementaranalysenmeinerSubstanzen.
Zu guter Letzt möchte ich besonders meiner Familie, meinem Lebenspartner
RobertundmeinenFreundendanken,diewährenddergesamtenArbeitimmer
fürmichdawarenundohnederenLiebe,FreundschaftundUnterstützungdiese
Arbeitnichtmöglichgewesenwäre.Table of contents
1 Theinventionofnewsequencingtechnologies.................10
1.1 Fromfirsttosecondgenerationsequencing................................10
1.1.1 Historicalbackground.........................................................10
1.1.2 Theneedforsecondgenerationsequencing..............................12
1.2 Sequencingbyhybridization....................................................13
1.3 Pyrosequencing...................................................................16
1.4 Sequencingbysynthesis.........................................................20
1.4.1 TheinventionofreversibleterminatorsforSBS..........................20
1.4.2 ThearraybasedSBStechnology.............................................23
1.4.3 TheEUproject“ArraySBS”anditsaim....................................29
2 DevelopmentofanarraybasedSBSmethod.....................31 2
2.1 SelectionofanappropriatepolymeraseforSBS.............................31
2.1.1 Functionandpropertiesofapolymerase..................................31
2.1.2 Polymeraseselectionwithunlabeledreversibleterminators...........37
2.2 Polymeraseacceptancetests...................................................38
2.2.1 Materialsandmethods........................................................38
2.2.2 Incorporationof3′OCEMdTTP.............................................39
2.2.3 Incorporationof3′OCEdTTP...............................................40
2.2.4 Concludingremarks...........................................................42
33 GoalofthisPhDthesis................................................43
4 SynthesisofreversibleterminatorsforSBS......................45
4.1 Retrosynthesisofthefour3′Omodifiedkeycompounds..................45
4.1.1 RetrosynthesisofthekeycompoundfortheAterminator..............45
4.1.2 RetrosynthesisofthekeycompoundfortheGterminator.............46
4.1.3 RetrosynthesisofthekeycompoundfortheCterminator..............48
4.1.4 RetrosynthesisofthekeycompoundfortheTterminator..............49
4.2 Strategyforselective3′alkylationof2′deoxyguanosine..................50
4.2.1 Dialkylationofpartiallyprotected2′deoxyguanosine...................50
4.2.2 Selective3′alkylationoffullyprotected2′deoxyguanosine...........51
4.3 Synthesisofthe3′modifiedkeycompounds.................................56
4.3.1 Synthesisofthepyrrolo[2,3d]pyrimidinemoiety:Strategy1..........56
4.3.2 Synthesisofthepyrrolo[2,3d]pyrimidinemoiety:Strategy2..........59
4.3.3 Synthesisof4amino7[2deoxyβDerythropentofuranosyl]5iodo7Hpyrrolo[2,3d]pyrimidine........................................................60
4.3.4 Synthesisof4amino5[3aminoprop1ynyl]7[3O(2cyanoethyl)2
deoxyβDerythropentofuranosyl]7Hpyrrolo[2,3d]pyrimidine............64
4.3.5 Synthesisof2amino7[2deoxyβDerythropentofuranosyl]5iodo
7Hpyrrolo[2,3d]pyrimidin4one:Strategy1....................................67
4.3.6 Synthesisof2amino7[2deoxyβDerythropentofuranosyl]5iodo
7Hpyrrolo[2,3d]pyrimidin4one:Strategy2....................................71
4.3.7 Synthesisof2amino5iodo7[3O(2cyanoethyl)2deoxyβD
erythropentofuranosyl]7Hpyrrolo[2,3d]pyrimidin4one....................74
4.3.8 Synthesisof5[3aminoprop1ynyl]3′O(2cyanoethyl)2′
deoxycytidine.........................................................................77
4.3.9 Synthesisof5[3aminoprop1ynyl]3′O(2cyanoethyl)2′
deoxyuridine...........................................................................81
5 Monophosphatesasmodelcompounds............................83
5.1 Cleavageexperimentinaheterogeneoussystem...........................83
5.2 Synthesisof3′modifiedmonophosphates....................................83
5.2.1 Synthesisof3′O(2cyanoethoxy)methyl2′deoxythymidine5′
phosphate..............................................................................83
5.2.2 Synthesisof3′O(2cyanoethyl)2′deoxythymidine5′phosphate.....89
5.2.3 Synthesisof3′O(2cyanoethyl)2′deoxyadenosine5′phosphate.....94
5.3 Cleavabilityofthe3′modifiedmonophosphates............................