Eloutassi, Cystosiera tamariscifolia

Dr Noureddine Eloutassi, Bouchra Louasté

Description

effet antimicroorganisme de l'algue brune cystosiera tamariscifolia

Informations

• Publié par: bionour
• Publié le: 20 septembre 2012
• Nombre de lectures: 167
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 3 Mo

Extrait

Etude in vitro de l’activité anti-Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici de l’algue marine Cystoseira tamariscifolia

Auteur :Noureddine ELOUTASSI et Bouchra LOUASTE

Catégorie : Environnement > Biologie

ScienceLib Editions Mersenne : Volume 4 , N ° 120908 ISSN 2111-4706

Publié le: 2012-09-11

www.sciencelib.fr

  Etude in vitro de l’activité anti-Fusarium   oxysporum f. sp. lycopersici de l’algue marineCystoseira   tamariscifolia   In vitro study anti- Fusarium   oxysporum  f. sp. lycopersici from Cystoseira   t fo   amarisci lia

  Noureddine ELOUTASSI 1.#  et Bouchra LOUASTE 1   1   Laboratoire de Biotechnologie des Plantes Aromatiques, Département de Biologie, Faculté des Sciences, Université sidi Mohamed Ben Abdellah, Fès, Maroc. #   Auteur de correspondance : ELOUTASSI Noureddine. Centre régional des métiers et d’éducation (CREMEF), Fès. Maroc. E-mail : [e-mail]                                

 

1

RESUME :  Ce travail s’intéresse à la valorisation pharmacologique et biologique de l’algue bruneCystoseira tamariscifolia des côtes marocaines. Différents extraits de cette algue ont été testés pour leurs pouvoirs anti-microorganismes. Nous avons déterminé l’activité antifongique de l’extrait chloroformique, éthanolique, hexanique, méthanolique et aqueuse sur la croissance du champignon phytopathogéneFusarium   oxysporum f. sp lycopersici   (F.O.L) responsable de la fusariose et sur la formation des mycotoxines par ce champignon. Les résultats ont montré que l’inhibition totale de la croissance deF.O.L est obtenue par l'extrait éthanolique à la concentration 5% et éventuellement par l’extrait méthanolique. Alors qu’aucune activité n'a été observée pour les extraits, chloroformique, hexanique et aqueux. Aussi les mycotoxines formées parF.O.L ont été inhibées par les extraits éthanolique à la concentration 1%. Mots clés : Activité antifongique, Cystoseira   tamariscifolia, Fusarium   oxysporum f. sp. Lycopersici. ABSTRACT:  In this work, pharmacological and biological acivities of the brown algaCystoseira tamariscifolia Moroccan coast has been evaluated. Antimicroorganisms effect of several extracts of this alga has been tested. Thus, antifungal activity of chloroform, ethanol, hexane, methanol and aqueous extracts has been determineted onFusarium oxysporum f. sp lycopersici (F.O.L.) wish is a phytopathogenic fungus responsible of training and Fusarium mycotoxins. The results showed a complete inhibition of growth of F.O.L. with ethanol extract at 5% and possibly by methanol extract, whereas, no activity was observed for chloroform, hexane and aqueous extracts. Werehever, mycotoxins formed by F.O.L. were inhibited with 1% of ethanol extract. INTRODUCTION :  Les algues marines s'étalent sur les côtiers des continents. Les recherches réalisées sur ces algues se focalisent sur leurs aspects chimiques (Valls etal.,, 1993; Culioli etal., 2000; Daoudi etal., 2001; Culioli etal., 2001) et sur leurs activités anti-microorganismes (Hellioet al., 2000). Au Maroc, l’algue brune marineCystoseira   tamariscifolia est répandue sur la côte océanique atlantique entre Tanger et Eljadida et sur les côtes méditerranéennes. Quelques études ont été portés sur cet espèce (Chaib, 1997 ; Bennamara et al., 1999; Abourriche etal.,   2001 ; Souhailiet al., 2004 ; Zinedine et al., 2004).

 

2

 D’autre part, les phytopathogènes et leurs mycotoxines sont considérées des contaminants alimentaires les plus significatifs en termes d’impact sur la santé publique, la sécurité alimentaire et notamment l’économie de nombreux pays (Katiyar etal., 2000, Pitt et   al.,2000., Ouhdouch et al., 2004., Ruppol etal., 2004, Atoui 2006). En matière de protection, on peut utiliser plusieurs types d’approches soient la lutte chimique, la lutte biologique, la lutte physique, les biopesticides et les facteurs humains. (Vincent etal., 2001). D’après Paul B. etal., 1998, Kouassi M., 2001, Hibar etal., 2005 et beaucoup autres auteurs la lutte biologique est les formes non chimiques de contrôle des ravageurs des récoltes et des mauvaises herbes pour assurer la protection phytosanitaire la plus performante (Gapillout et al., 1996 ; Smiley et Draughon 2000; Champeil 2004 ; Trung 2005).  Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à la fusariose, causée parFusarium   oxysporum f. splycopersici (F.O.L), comme exemple d’agents phytopathogènes. Au Maroc, ce champignon cause des dégâts économiques très considérables. De nombreuses méthodes chimiques de lutte contre cette maladie cryptogamique ont été essayées. L’utilisation répétée des produits de synthèse comme le benomyl, le captafol, le méthylthiophanate, le méthoxybifurcarénone, le thiabendazole, le pesticide AJ1629-34EC et autres, ont donné des résultats limités à moyen et à long terme. Ils entraînent souvent la pollution de l’environnement, le ralentissement de la progression de pathogène et non leur disparition totale, l’apparition de souches résistantes et l’augmentation de la quantité des résidus sur les fruits (Chaib N 1997., Hilali etal., 2002., Didier etal., 2004., Ozbay et Newman, 2004., Yates etal., 2004, Daami-Remadi et El Mahjoub 2006., Hibar etal., 2006. 2007., Ainane. 2011).  Devant cette situation, l’intégration d’autres stratégies efficaces et respectueuses à l’environnement semble être nécessaire. La présente étude encourage l’utilisation des produits biologiques et naturels comme l’extrait de l'algue marineCystoseira tamaricifolia pour lutter contre ce champignon pathogène. MATERIEL ET METHODES 1. Récolte  L’algueCystoseira   tamariscifolia a été récoltée au moment de la marée basse (Photo 1). Le lieu et la période de la récolte influencent l’activité anti- microorganismes de l’algue (Farid etal., 2012). Pour éviter ce problème, on a effectué plusieurs récoltes pendant plusieurs périodes de l’année au sud de Rabat à coté de Harhoura (Oued Ykem) et au nord de Rabat à coté de Sidi bouqnadel (Figure 1).

 

3

      Figure 1 : Stations de la récolte de l’algue         Photo1: Photo de l’algue brune brune marineCystoseira tamariscifolia marineCystoseira tamariscifolia.        Pour chaque récolte, l'algue fraîche est transportée au laboratoire, triée et rincée avec l'eau distillée et congelée à -80°C. Juste avant l’utilisation, tous les échantillons ont été mélangés et séché à 40°C pendant 48 heurs et broyé au mortier. Le broyat sec obtenu et stocké à 4°C. 2. Extraction  10 g du broyat de l’algue est mélangé avec 90 ml d'eau chaude (90°C). L’ensemble est mené à un agitateur pendant 15 min. Le mélange est filtré par papier Whatman n°4. Le filtrat est laissé 15 min à la température ambiante puis à -18°C et à l’obscurité jusqu'à usage. Même quantité d’algue est extraite au sorxclet en présence d’éthanol, du chloroforme, d’hexane et du méthanol. Nous avons adopté qu’à 2 % les solvants organiques n’ont aucun effet. 3. Isolement et culture de l’agent pathogène  - Origine : L’isolat provient de fragments des plants de tomate présentant des symptômes de fusariose causée parF.O.L. Les fragments récoltés ont été placés dans des sacs en plastique stérile et humide pour favoriser leur développement.  - Mise en culture :   Le prélèvement des organes de fructification et le mycélium aérien est réalisé sous une loupe binoculaire directement à partir des fragments récoltés. Nous avons utilisé pour l’isolement et le développement du champignon le milieu Potato Dextrose Agar (PDA). Les cultures sont conservées à l’obscurité et à une température de 25°C pendant une semaine.  - Purification :   La purification est réalisée par passage successif sur milieu frais à l’aide d’un scalpel stérile. Des petits blocs du milieu solide sont prélevés dans les périphéries des

 

4

colonies. Ils sont transplantés sur des boites de Pétri contenant le milieu PDA fraîchement préparée. La purification est répétée plusieurs fois. 4. Testes biologiques  Préparation du filtrat :Afin d’absorber l’excès de l’humidité et d’éviter ensuite une- dessiccation trop rapide du milieu, un disque de papier filtre est placé dans le couvercle des boites de Pétri contenant le milieu PDA. Les boites de Pétri sont scellées au parafilm et conservées à l’obscurité et à une température de 25°C. Ensuite un disque de 5 mm de diamètre est découpé stérilement de la culture des champignons. Il est transféré dans des erlenmeyers de 250ml contenant 100 ml du milieu Czapeck stérile. L’incubation est réalisée pendant 21 jours à 25°C et avec une agitation de 150 tours/min. Après trois semaines d’incubation, le mycélium est séparé du filtrat par double filtration (Papier Whatman 2µm et membrane millipore de 0,45 mm). Le filtrat brut obtenu est gardé à une température de -18°C jusqu’à son utilisation.  - Tests antifongiques :Nous avons réalisé les tests antifongiques par la méthode de diffusion et la méthode de dilution.    Méthode de diffusion :   Le produit est déposé sur des disques de papier filtre de 5mm de diamètre imprégnés par la solution à tester et déposés ensuite à la surface des boites de Pétri. Les boites sont ensemencées par des cultures deF.O.L. préalablement préparés. Le témoin solvant et le témoin blanc ont été préparés de la même manière.    Méthode de dilution :   Le produit à tester est dispersé dans le milieu de culture liquide. Un disque de mycélium de 3mm de diamètre pris dans la marge de croissance du thalle de la culture mère sert à l’ensemencement. Le développement du champignon sera comparé à celui d’un témoin durant son incubation. Dans le cas d’utilisation d’un milieu de culture solide, le produit à tester ; stérilisé par filtration à travers des membranes filtrantes de porosité 0,22µm, afin d’éviter la dégradation du principe actif par la chaleur. Il est additionné aux boites de Pétri dans le milieu de culture en surfusion stérilisé par autoclavage. Après homogénéisation, les boites de Pétri, séchées à l’étuve à 25°C pendant 30mn, seront ensemencées par des cultures deF.O.L. et incubées à 25°C et à l’obscurité.  - Effet des extraits sur la croissance mycélienne :La technique consiste à placer simultanément, dans la même boîte de Pétri contenant le milieu PDA, une pastille gélosée (6 mm de diamètre) portant leF.O.L.   et 100 μl de différents extraits de l’algue déposés dans un puits (6 mm de diamètre). La pastille et le puits sont diamétralement opposés et équidistants de 3 cm du centre de la boite. Cet essai est réalisé de deux façons. L’incubation est réalisée à

 

5

25°C pendant six jours. La notation du diamètre moyen des colonies traitées est réalisée lorsque les filaments mycéliens atteignent la périphérie de la boite dans les lots témoins.  - Inhibition, extraction et quantification des mycotoxines de F.O.L.:Différentes concentrations des extraits ont été ajoutés au milieu YES (yeast extract sucrose) dans des flacons Erlenmeyer qui ont été inoculés parF.O.L. L’incubation est faite pendant une semaine dans le shaker à 25°C. Le témoin négatif a été emporté dans les mêmes conditions. Ensuite, le milieu est filtré par papier Watman N° 4). L’extraction est réalisée par des solvants organiques sur le filtrat. Le choix du solvant dépend de la polarité des toxines à extraire. Nous avons adopté la technique préconisée par Chakrabarti etal., (1987 ) et Souhaili etal., (2004). Les mesures de l’absorbance sont effectuées sur spectrophotomètre UV visible (PERKIN ELMER- Lmbda 1100-190nm). La séparation des fractions protéique phytotoxiques des filtrats bruts a été réalisée par chromatographie sur plaque de silice et la révélation a été faite par l’acide acétique-ninhidrine. On a utilisé le Butanol + Eau + acide acétique (4/1/1) comme le meilleur solvant de séparation (Chaib, 1997). RESULTATS  1. Inhibition de la croissance  Les résultats des tests préliminaires montrent que tous les extraits sauf l'extrait éthanolique ne présentent pas d'effet sur la croissance deF.O.L. Ce ci est peut être expliquée par l’absence ou la faible concentration de l’effet anti- F.O.L. dans les extraits.     Tableau I : Inhibition de la croissance deF.O.L. par les différents extraits testés   Extraits (1%) Chloroformique Méthanolique Héxanique Ethanolique Aqueux   Croissance de   A C A C A C A C A C F.O.L. (%)   100 100 80 100 100 100 0 100 100 100  A :Assai ;C :Contrôle.    Le tableau I montre une activité unique par l'extrait éthanolique ce qui indique que les principes actifs de l’algue sont solubles dans l’éthanol plus que dans les autres solvants. En termes de pourcentage, le pouvoir inhibiteur de l’extrait éthanolique est significativement élevé, il est de 100% pour la concentration de 1%. Alors il est de 20% pour l’extrait méthanolique et 0% pour les autres extraits.

 

6

 Une faible inhibition a été aussi observée avec l'extrait méthanolique (20%). Il peut renforcer l'hypothèse que l'inhibition est due à une extraction partielle des composés actifs extractibles par l’éthanol que par méthanol.  L'activité fongicide a été aussi étudiée dans le milieu liquide. L’inoculation deF.O.L. a été réalisée à différentes concentrations de l'extrait éthanolique. Les résultats rapportés dans le tableau II ont montré une activité inhibitrice de l'extrait éthanolique à la concentration 5%.   Tableau II : Inhibition de la croissance deF.O.L. par différentes concentrations de l’e xtrait éthanolique     Extrait éthanolique Concentration 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8% 9% 10%      Croissance de            F.O.L + + + ± – – – – –   –  + :croissance ; ± :faible croissance ;– :i   nhibition de croissance.   2. Croissance diamétrale des thalles  Durant l’incubation, nous avons mesuré deux diamètres perpendiculaires de chaque thalle deFusarium oxysporum f. sp. lycopersici sur les différentes cultures (Figure2). 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10   Figure 2 : Effets de l’extrait éthanolique deCystoseira   tamariscifolia sur la croissance des thalles deFusarium   oxysporum f. sp. lycopersici.   

 

 

7

 

 La figure révèle la variation de la croissance des thalles deF.O.L. en fonction des concentrations de l’extrait éthanolique de l’algue durant 30 jours de la culture. Les extraits de l’algue agissent sur la croissance des thalles en provoquant un retard de croissance des filaments mycéliens par rapport au témoin. On remarque en générale trois phases principales de croissance commencé par une phase d’adaptation très lente (2J à 8J). Les concentrations 2% et 4% permettent un démarrage très rapide et une grande croissance par rapport au témoin blanc. Il pourrait y avoir une stimulation des enzymes qui président la croissance mycélienne. C’est la phase de latence qui correspond à la période durant laquelle le champignon synthétiserait les enzymes supplémentaires indispensable à la biosynthèse de ses métabolites essentiels. Suivie d’une deuxième phase très rapide où la durée se diffère d’une concentration à l’autre. Ensuite une troisième phase caractérisée par la constance diamétrale des thalles. Le thalle atteint son maximum et son diamètre reste constant pour toutes les concentrations. Les courbes montrent aussi que la vitesse de croissance diminue considérablement en présence des fortes concentrations utilisées (notamment 8% et 10%). On observe donc des effets différents de l’extrait testés. Aux faibles concentrations on remarque un effet stimulateur. Alors, il est inhibiteur aux concentrations moyennes. Tendis qu’aux fortes concentrations, l’effet est létal., 3. Effets de l’extrait éthanolique sur la sécrétion des toxines  La sécrétion des toxines a été analysée en chromatographie sur couche mince. Le support utilisé est le gel de silice de 0.22 mm d’épaisseur. Les systèmes utilisés ont été choisis dans la littérature et adaptés en fonction des mycotoxines à séparer.  L’analyse des plaques de chromatographie montre que les molécules phytotoxiques ont migré à des distances différentes, mais ceci n’exclut pas la présence de molécules apolaires qui sont restées au niveau des dépôts des gouttes.  La culture deF.O.L en présence des extraits éthanolique a montré une inhibition totale des mycotoxines (Figure 3). A 1% d’extrait éthanolique peut indiquer une faible concentration des mycotoxines dans le milieu. Cette concentration est comparée à la concentration 2%. Cela nous a fait supposer qu’au delà de 1% l'éthanol stimule la formation des mycotoxines. La formation des mycotoxines dansF.O.L a été inhibée par les extraits éthanolique à la concentration 5%. C’est la concentration inhibitrice de la croissance de F.O.L.  

 

8

 Les résultats exposés au tableau III montrent que la concentration des protéines augmente parallèlement avec l’augmentation du poids frais et sec de la masse mycélienne. Il existe donc une relation étroite entre le développement mycélien et la sécrétion des toxines.   Tableau III : Concentration des protéines en fonction du poids frais et sec de la masse mycélienne   Concentration de Volume du Poids frais Poids sec Concentration en l’antifongique (%) filtrat brut (ml) (10 3 mg) (10 3 mg) protéine (mg/ml)   1 100 20.50 4.1 1.75   2 100 11.75 2.75 1.2   3 100 9.55 1.9 1.05   4 100 8.95 1.75 0.9     Extrait 5 100 7.45 1.6 0.8 éthanolique  5.5  100 6.25 1.05 0.8 6 100 1.25 0.25 0.4 6.5 100 0.25 0.05 0.1 7 100 0.05 0.01 0.1 8 100 0.05 0.01 -ε (indétectable)   9 100 0.05 0.01 -ε (indétectable)   10 90 0.05 0.01 -ε (indétectable)   Témoin solvant 90 22 4.8 1.8 Témoin blanc 90 22 4.8 1.8

     Les réactions d’identification utilisées indiquent uniquement la concentration des protéines dans les cultures (Figure 3).

  Figure 3 : Mycotoxines deF.O.L. en cultures et en présence de différentes concentrations de l'extrait éthanolique détectées par chromatographie sur couche mince.

 

9

 Il est possible de déterminer l’abondance relative de chaque composé, en comparant nos résultats avec des réactions d’identification des extraits de référence (molécules commercialisés). La chromatographie sur couche mince des échantillons nous a permis de détecter certains mycotoxines. L’analyse des taches sur la chromatographie sur couche mince des échantillons et la comparaison avec les références ont permis d’identifier quatre types de mycotoxine isolée. On a trouvé le trichothécène (0.78mg/kg), l’acide Fusarique (0.52mg/kg) et le zéaralénone (0.15/kg). DISCUSSION   Des recherches similaires sur les extraits de l’algueCystoseira tamariscifolia ont montré des activités sur des bactéries (Hellio etal., 2000). Pareillement, différents extraits de l'algue marine ont été testé par Souhaili et al., (2004), Zinedine et al., (2004)   et par Badea (2009) pour leurs activités antimicrobiennes (bactéries, champignons et levures) et sur la formation des mycotoxines par les moisissures. Ces études ont présentés des résultats complémentaires pour notre étude. Seul l'extrait éthanolique a montré une activité antifongique contre les levures et les moisissures étudiées. En 2011 Ainane a largement étudié la valorisation de deux algues brunesCystoseira tamariscifoliaetBifurcaria bifurcatade la côte atlantique marocaine (région du Casablanca). Dans ses études, les potentialités pharmacologiques et les applications environnementales ont été investiguées.  D’autres travaux ont été réalisés afin d’éclaircir l’importance des constituants et des propriétés majeures des principes actifs dans les extraits de l’espèce Cystoseira. Bennamara et al., (1999) a trouvé une activité antimoisissures par un composé purifié de cette algue, c’est le methoxybifurcarenone. Également, Culioli etal., (2000) a identifié un dérivé des diterpènes (le geranylgeraniol). Ensuite, Quatre autres diterpènes ont été identifiés (Culioli etal., 2001). Ces composés pourraient être parmi les principes actifs de l’espèce mais leur effet anti- microbien et la formation de la mycotoxine a été insuffisamment étudiée. Daoudi etal.,   (2001) et Bennamara etal., (1999) ont aussi isolés des diterpenes acyclique et des stérols à partir de genre Bifurcaria et Bifurcariopsis et tamariscifolia. Ces principes actifs ont montrés une activité fongicide sur des champignons phytopathogènes. En fin, Salvador etal., (2007) ont réussis d’utiliser des extraits frais et lyophilisés de plusieurs espèces de Cystoseira comme agents de conservation naturels dans l'industrie cosmétique. Marfaing etLerat (2007), Souhaili etal., (2008) et Hongayo (2011) ont étudié le plusieurs espèces de Cystoseira par ses valorisations nutritionnelles en vue d’une exploitation économique comme valeur ajoutée aussi bien en alimentation humaine qu’animale.

 

10