Caractérisation génomique et développement d’outils de construction de clones infectieux pour l’étude de flexivirus, Genomic characterization and development of tools for the construction of infectious full-lngth cDNAs for the study of flexiviruses

De
Publié par

Sous la direction de Olivier Le Gall
Thèse soutenue le 21 décembre 2010: Bordeaux 2
La famille des Flexiviridae a été créée en 2004 et regroupe plusieurs genres viraux affectant particulièrement des espèces ligneuses dont des arbres fruitiers. Grâce à diverses approches plusieurs nouveaux Flexiviridae ont été partiellement caractérisés au cours de ces dernières années. En revanche la position taxonomique précise de certains d’entre eux et leur contribution à des pathologies particulières restent encore incertaines du fait de difficultés inhérentes à l’étude de ces agents. Dans le présent travail, nous avons obtenu les séquences génomiques complètes pour quatre agents proches de l’Apricot latent virus. Ceci a permis de préciser l’organisation génomique de ces virus et d’en déterminer la position taxonomique. Cette étude a également permis de montrer que la partie C-terminale de la capside et la protéine TGBp1 sont soumises à une pression sélective particulièrement forte. Dans un second volet de ce travail, plusieurs approches permettant l’obtention simple et rapide d’ADNc infectieux, sous forme clonée ou non ont été développées. Travaillant sur plusieurs Flexiviridae, dont le virus des taches foliaires chlorotiques du pommier (Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV), nous avons mis au point l’amplification d’ADNc génomiques complets en une seule étape à partir d’extraits d’acides nucléiques totaux obtenus à partir de plantes infectées. Des amplifiats comportant l’ADNc viral sous le contrôle du promoteur 35S du CaMV ou du promoteur de la RNA polymérase du phage T7 ont été obtenus et utilisés pour infecter des plantes directement par biolistique (promoteur 35S) ou pour obtenir des ARN infectieux par transcription in vitro (promoteur T7). Ces données ont mis en évidence des différences importantes dans le comportement de deux hôtes de l’ACLSV, Chenopodium quinoa et Nicotiana occidentalis 37B. Nous avons également utilisé le système de recombinaison homologue de la levure Saccharomyces cerevisiae simplifier le clonage d’ADNc complets amplifiés par PCR ou pour réaliser en une seule étape la construction d’un vecteur navette ternaire levure-E. coli-A. tumefaciens et l’obtention d’un clone ADNc de l’ACLSV inoculable par agroinfiltration. Ces différentes stratégies devraient trouver une large application, en particulier pour tester plus rapidement des hypothèses d’étiologie pour les virus de plantes réputés difficiles, tels que ceux infectant des hôtes ligneux.
-Flexiviridae
-Apricot latent virus
-ADNc infectieux
-Promoteur 35S
-Promoteur T7
-Recombinaison homologue
-Saccharomyces cerevisiae
The Flexiviridae family was created in 2004 and contains several viral genera affecting in particular woody hosts, including fruit trees. Using various strategies several new Flexiviridae have been partially characterized in the past few years. However, due to difficulties inherent in studying these agents, the precise taxonomic position of some of them and their contribution to particular diseases are still uncertain. In the present work, the complete genomic sequences of four Prunus-infecting Apricot latent virus (ApLV) like isolates have been determined. This has allowed to determine the genomic organization and the taxonomic position of these viruses. The results obtained also indicate that the C-terminal half of the coat protein and the TGBp1 are the genomic regions under the strongest purifying selection pressure. In the second part of this work, a set of approaches to simplify and streamline the construction of cloned or uncloned infectious full-length viral cDNAs were developed. working with several Flexiviridae and, in particular, with the Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV), we have developed protocols allowing the one-step amplification from total nucleic acids extracts of full-length cDNAs. under the control of the CaMV 35S or phage T7 RNA polymerase promoters. Successful inoculation of plants with these uncloned amplification products was obtained by biolistic bombardment (35S promoter) or using in vitro synthesized RNA transcripts (T7 promoter). Results obtained showed significant differences in the behavior of the two ACLSV hosts, Chenopodium quinoa and Nicotiana occidentalis 37B. We also used the yeast homologous recombination system for the efficient cloning of full-length cDNAs and for the simultaneous one-step construction of a ternary yeast-E. coli-Agrobacterium tumefaciens shuttle vector and generation of an agroinfiltrable infectious ACLSV construct. These various strategies should find broad applications, in particular for the validation of etiological hypotheses in the case of “difficult” plant viruses, such as those infecting woody hosts.
-Infectious cDNA
-35S promoter
-T7 promoter
-Homologous recombination
Source: http://www.theses.fr/2010BOR21798/document
Publié le : vendredi 28 octobre 2011
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UNIVERSITÉ VICTOR SEGALEN BORDEAUX 2
École Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé

Année 2010 Thèse n° 1798



THÈSE

pour le

DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE BORDEAUX 2


Mention : Sciences, Technologie, Santé

Option : Microbiologie

Présentée et soutenue publiquement
le 21 Décembre 2010
par
Fater YOUSSEF


Caractérisation génomique et développement d’outils de
construction de clones infectieux pour l’étude de flexivirus




Membres du jury :

M. Michel HERNOULD Professeur à l’université Bordeaux 2 Président
Mme Véronique BRAULT Directeur de recherche INRA Rapporteur
M. Benoît MOURY Directeur de recherche INRA Rapporteur
M. Emmanuel JACQUOT Chargé de recherche INRA Examinateur
M. Olivier LE GALL Directeur de recherche INRA Directeur de thèse


















ﺕﺪ ﺟﻭ ﺪ ﻗ ﻲﻨﻜﻟﻭ ،ﹰﺎﻧﻮﻨﺠ ﻣ ﺖﺤ ﺒﺻ ﺃ ﺍﺬﹶﻜﻫ...
...ﹰﺎﻌﻣ ﹶﺓﺎﺠﻨﻟﺍﻭ ﹶﺔﻳﺮ ﺤﻟﺍ ﺍﹶﺬﻫ ﻲﻧﻮﻨﺠﺑ
" ...C’est ainsi que je suis devenu fou, mais grâce à ma folie
j’ai trouvé la liberté et la paix…
Bénis, bénis soient les voleurs qui m’ont
volé mes masques "
Gibran Khalil Gibran
ﻥﺍﺮﺒﺟ ﻞﻴﻠﺧ ﻥﺍﺮﺒﺟ

Remerciements
ﺮﻳﺪﻘﹾ ﺗ ﻭ ﺮﻜﹾ ﺷ

Ce travail a été réalisé au sein de l’équipe Virologie de l’UMR Génomique, Diversité
et Pouvoir Pathogène de l’INRA-Bordeaux et l’Université Victor Segalen Bordeaux 2.

Je tiens à remercier tout d’abord M. Thierry Candresse de m’avoir accueilli dans son
laboratoire au cours de mon stage M2 et mes quatre années de thèse. La qualité de son
encadrement, ses connaissances, sa rigueur scientifique font que je me sens très honoré
d’avoir appris à ses côtés. Thierry, je ne te remercierai jamais assez pour tout…et je
n’oublierai jamais ton passage tardif et régulier le soir et les week-ends dans le bureau
« Stagiaires » pour m’apporter ton soutien, les idées et les solutions aux problèmes quotidiens
de labo, sans toi je ne serais jamais arrivé là… Choukran aussi de m’avoir fait connaitre et
savourer tant de musiques diverses…

Je remercie également Mme Armelle Marais, codirectrice de thèse et de stage M2, un
immense et sincère merci pour ton soutien précieux pendant ces quatre années. Merci Armelle
tout particulièrement pour ta disponibilité et ton implication durant ces derniers mois pour tes
conseils et pour la correction de ce manuscrit.

Je souhaite exprimer toute ma reconnaissance au professeur Michel Hernould pour me
faire l’honneur de présider ce jury. Je remercie également Mme Véronique Brault, et M.
Benoît Moury pour avoir accepté d’examiner et de juger cette thèse. Mes remerciements vont
aussi à M. Emmanuel Jacquot (également remercié d’avoir participé au comité de thèse, pour
nos discussions et ses suggestions très utiles) pour participer à ce jury.

Je n’oublie pas de remercier Olivier dit OL, notre chef de département, la première
personne que j’ai contactée à Bordeaux et qui m’a accueilli. C’était un honneur pour moi que
tu sois mon directeur de thèse même si c’était juste administrativement et je suis très heureux
également que tu participes à ce jury.

Merci à Chantal, pour ta gentillesse et ton aide technique précieuse surtout pendant la
dernière année.

Merci à tous les thésards, qui m’ont précédé et avec qui j’ai partagé des moments
inoubliables : à Ophélie (je me rappelle toujours de tes plats marocains délicieux), à Grégoire
(après ton départ Dr.G, je n’ai plus fait de longues balades à vélo !!), à Anne-So (surtout pour
le week-end à Saint-Jean-de-Luz), à Anas, grâce à qui je n’ai pas encore oublié l’arabe, pour
ton soutien, nos discussions scientifiques et politiques.

À Sylvie, pour tes conseils, nos discussions, tes encouragements, ton amitié et d’avoir
enfin choisi une brésilienne, mais c’est trop tard ! Merci pour tes plats délicieux (tu cuisines
trop bien !!!!).

À Laurence, pour ta gentillesse, tes encouragements, et ton aide.

À Maryline pour ta gentillesse, nos discussions, nos échanges à propos de la flore et la
faune, et pour les deux journées mémorables de bienvenue à la ferme.

À Yannick, mon premier ami ici à Bordeaux, grâce à qui les moments très difficiles de
M2 ont été remplacés par des beaux souvenirs.

Aux amis ici à Bordeaux ou ailleurs pour tous les moments que nous avons pu passer
ensemble, pour nos soirées, sorties, plages, piscine… j’avais de la chance de vous avoir près
de moi : à Béné, Gérald (grâce à qui nous avons passé des bons moments à Bordeaux et à
Nantes). À Gaëlle, Carole, Stéphanie (un grand merci pour nos discussions et tes
encouragements, heureux d’avoir fait ta connaissance, je te souhaite la meilleure des choses
parce que tout simplement tu le mérites…) et à David (c’est à toi maintenant de prendre ma
place pour la piscine). Aux deux gentils Brésiliens Nelson et Flavio. À Darein, Labib, Saossan,
Karim, Randa, Evlin, et Riad. À Nsrein et Manu (je vous souhaite une vie pleine d’amour).
Enfin à Daniela, tu es venue au bon moment, en si peu de temps tu es devenue une amie très
chère, merci pour tes encouragements.

À Luc, l’ami des étrangers, merci pour toutes les soirées que nous avons organisées
chez toi, pour nos discussions et tes encouragements tout au long de cette thèse, un très grand
choukran pour ton amitié M. Qualité « chou hal faoda ».

À Claire et Christophe (choukran famille Garcion), c’est vraiment un grand plaisir
pour moi de vous avoir connus et d’avoir le premier cadeau de Noël de la belle Clémentine,
un grand merci.

Merci aux familles Breton, Sofer, Svanella, et Retana avec qui j’ai senti, même avec le
peu de temps que j’ai passé avec vous, que j’ai de la famille ici.

Merci à tous ceux qui ont partagé le bureau avec moi à travers ces années, Hien, Salma,
Pauline, Ann, Germain (le surfeur fou), Julie (pour les points divers des matins), Sylvain et
Maud (vous êtes les meilleurs, vous allez y arriver …).

À l’ensemble de l’équipe Virologie : à Véro, Timi, Geneviève, Jos, Fred, Marie
Mension, Mélodie, Patrick, Valérie, Claudine, Ye’chan, Noëlle, Michel, Pascal, Thierry
Aurélie, Marie-Christine, et à Marie-Lou. Merci à vous tous pour vos encouragements et votre
sympathie. Merci également à Pascal de m’avoir aidé à faire quelques manips au Ctifl.

Ma gratitude va également envers la Syrie, mon pays qui m’a tout offert pour faire
cette formation et passer une période mémorable de ma vie. Que toutes les personnes qui ont
contribué à réaliser cette étude dans les meilleures conditions possibles trouvent ici le
témoignage de ma sincère reconnaissance. Un grand merci également à tous les membres de
l’ambassade de la Syrie à Paris, à Mlles Mazina et Mourshida du ministère de l’enseignement
supérieur en Syrie, pour leur disponibilité, sympathie et aide, à tous les personnels du service
BGF du Crous de Bordeaux et en particulier à Mme Laué pour leur aide et leur disponibilité.

Et par-dessus tout, mes remerciements vont à mes parents, mes frères et sœurs, à mon
oncle Firass et à mes amis en Syrie qui ont cru en moi et qui ont su me soutenir et
m’encourager même à trois milles kilomètres de distance. Production scientifique

Production scientifique

Publication dans des journaux à comité de lecture

Youssef, F., Marais, A. and Candresse, T. (2008). Partial genome sequence of Bidens mottle
virus sheds light on its taxonomy. Archives of Virology 153, 227-228.

Youssef, F., Marais, A., Faure, C., Barone, M., Gentit, P. and Candresse, T. Characterization
of Prunus-Infecting Apricot latent virus–like foveaviruses: Evolutionary and taxonomic
implications. Virus research In Press.

Youssef, F., Marais, A., Faure, C., Gentit, P. and Candresse, T. Strategies to facilitate the
development of uncloned or cloned infectious full-length cDNAs : Apple chlorotic leaf spot
virus as a case study. To submit in Journal of virological methods.

Youssef, F., Liberti, D., and German-Retana,. S. Trichovirus-Betaflexiviridae. Submitted for
Springer Index of Viruses, 2nd edition.

Communications orales

Marais, A., Youssef, F., Faure, C., Barone, M., Gentit, P. and Candresse, T. (2009). Towards
the elucidation of the taxonomic position of Prunus-infecting viral agents belonging to the
Foveavirus genus and their relationship with Apple stem pitting virus. In 21st International
Conference on Virus and other Graft Transmissible Diseases of Fruit Crops. Neustadt (DEU).

Youssef, F., Marais, A., Faure, C. and Candresse, T. (2009). Infectious uncloned full-length
stcDNA as a tool for the study of the etiology of fruit tree viral diseases. In 21 International
Conference on Virus and other Graft Transmissible Diseases of Fruit Crops. Neustadt (DEU).

Youssef, F., Marais, A., Faure, C. et Candresse, T. (2009). ADNc viraux : un outil d’étiologie
des maladies virales des arbres fruitiers. Dans 1ères journées des doctorants du département
SPE. Rennes.

Candresse, T., Marais, A., Youssef, F., Faure, C., Svanella, L., Arous Ben Amor, S. et
Couture, C. (2010). Approches pour l'identification sans à priori de nouveaux virus
phytopathogènes : application à l'étude de l'étiologie de maladies des plantes et à l'étude du
métagénome viral. Dans XIIèmes Journées Francophones de Virologie, Paris.









Production scientifique


Posters

Youssef, F., Marais, A. et Candresse, T. (2008). Un outil de génétique inverse d'étiologie de
l'Apricot pseudo-chlorotic leaf spot virus. Dans 8ème Journée Scientifique de l’École
Doctorale SVS. Arcachon.

Youssef, F., Marais, A. et Candresse, T. (2009). Un outil de génétique inverse pour l'étiologie
de l'Apricot pseudo-chlorotic leaf spot virus. Dans 12èmes Rencontres de virologie végétale.
Aussois. Prix du meilleur poster

Youssef, F., Marais, A. et Candresse, T. (2009). Un outil de génétique inverse pour l'étiologie
de l'Apricot pseudo-chlorotic leaf spot virus. Dans 9ème Journée Scientifique de l’École
Doctorale SVS. Arcachon. Table des matières

Table des matières

Table des matières 1
Index des figures 6
Index des tableaux 7
Liste des abréviations 8
Liste des virus cités 10

INTRODUCTION

I. L’étiologie : la science des causes des maladies.................................................................13
I.1. La construction des clones complets infectieux pour les virus ARN à génome simple
brin de polarité positive : stratégies, problèmes, et solutions............................................... 17
I.1.1. Stratégie utilisant la synthèse in vitro d’ARN transcrits infectieux........................ 18
I.1.2. Clones ADNc viraux permettant la synthèse de transcrits in planta...................... 24
I.1.3. Techniques n’impliquant pas de clonage................................................................ 25
I.2. Transfection des acides nucléiques infectieux dans les cellules de la plante hôte......... 26
I.3. Conclusion ..................................................................................................................... 28
II. Les flexivirus...................................................................................................................... 30
II.1. Les Flexiviridae : des virus à la taxonomie en évolution ............................................. 30
II.2. Morphologie et structure des virions des Flexiviridae ................................................. 36
II.3. Organisation génomique............................................................................................... 38
II.3.1. La réplicase virale ................................................................................................. 38
II.3.2. La ou les protéines de mouvement......................................................................... 38
II.3.3. La protéine de capside et les protéines variables encodées sur le génome de
certains Flexiviridae ........................................................................................................ 39
II.4. Gamme d’hôte et phytopathogénicité........................................................................... 40
II.5. Modes de transmission des Flexiviridae ...................................................................... 43
II.6. Construction de clones ADNc complets infectieux chez les Flexiviridae ................... 44
III. Les virus étudiés............................................................................................................... 52
III.1. Apricot latent virus :.................................................................................................... 52
III.2. Les trichovirus............................................................................................................. 54
III.2.1. Apple chlorotic leaf spot virus ............................................................................. 54
III.2.2. Apricot pseudo-chlorotic leaf spot virus .............................................................. 56

IV. Plan de la thèse................................................................................................................. 58
CHAPITRE I

Characterization of Prunus-Infecting Apricot latent virus–like foveaviruses :
Evolutionary and taxonomic implications (Soumis)...............................................61

Abstract ................................................................................................................................ 62
1. Introduction ........................................................................................................................ 63

1 Table des matières

2. Materials and Methods ...................................................................................................... 66

2.1. Virus isolates ................................................................................................................ 66
2.2. Long distance RT-PCR amplification of the 5’ and 3’-terminal parts of the
genome of ApLV-like agents ........................................................................................... 66
2.3. Sequence comparisons and phylogenetic analyses ...................................................... 67

3. RESULTS............................................................................................................................ 67

3.1. Partial sequence analysis of representative ApLV-like agents .................................... 67
3.2. Determination and analysis of the complete genomic sequence of the four
ApLV-like agents ........................................................................................................ 69
3.3. Analysis of individual proteins and evidence for strong differential selection
pressures in the C-terminal half of the CP and in the TGBp1 of ApLV and of ASPV....
...................................................................................................................................... 72

4. DISCUSSION ..................................................................................................................... 74

References ............................................................................................................................... 78

CHAPITRE 2

Introduction 90

Strategies to facilitate the development of uncloned or cloned infectious full-length
viral cDNA: Apple chlorotic leaf spot virus as a case study......................................91
Abstract ................................................................................................................................. 92

1. Introduction ........................................................................................................................ 93

2. Materials and Methods ...................................................................................................... 97

2.1. Virus source and RNA extraction ................................................................................ 97
2.2. Full-length ACLSV cDNA amplification using Long Distance (LD) RT-PCR and the
Megaprimer strategy .......................................................................................................... 97
2.3. Full-length ACLSV cDNA amplification using Long Distance (LD) RT-PCR and the
T7 promoter strategy .......................................................................................................... 99
2.4. T7 RNA polymerase in vitro transcription of ACLSV FL-cDNAs ............................ 99
2.5. Inoculation of plants................................................................................................... 100
2.6. ACLSV detection in inoculated plants....................................................................... 101
2.7. One step cloning of ACLSV FL-cDNAs by homologous recombination in
Saccharomyces cerevisiae................................................................................................ 101
2.8. One step construction of an agroinoculable ACLSV FL-cDNA in a ternary yeast-E.
coli-A. tumefaciens vector ................................................................................................ 102
2.9. Inoculation of plants using agroinfiltration................................................................ 103

3. Results ............................................................................................................................... 104

3.1. Megaprimer amplification and infectivity in various hosts of uncloned ACLSV FL-
cDNA under the control of the CaMV 35S promoter and of the Nos terminator ......... 104
2

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