Contribution à l'étude des P450 impliqués dans la biosynthèse des furocoumarines, Study of P450 involved in furocoumarin biosynthesis

De
Publié par

Sous la direction de Frédéric Bourgaud
Thèse soutenue le 30 mai 2006: INPL
Les furocoumarines sont des phytoalexines offrant un potentiel thérapeutique important. Les travaux présentés ici portent sur les cytochromes P450 participant à leur voie de biosynthèse. Une étude «structure-fonction» de la cinnamate-4-hydroxylase (C4H) a été réalisée pour identifier les déterminants de la faible sensibilité de la C4H de Ruta graveolens (CYP73A32) au psoralène. Deux régions protéiques semblent impliquées dans l’inactivation différentielle entre CYP73A32 et CYP73A1. L’une, entre les résidus 31 et 58, est responsable de l’affinité pour le psoralène. L’autre, entre les résidus 229 et 379, contrôle la vitesse d’inactivation. La caractérisation de nouveaux P450 de la biosynthèse des furocoumarines a été entreprise. D’une part, plusieurs ADNc partiels ont été clonés chez Ruta graveolens. D’autre part, CYP71AJ1 isolé chez Ammi majus, a été caractérisé comme étant une psoralène synthase. La spécificité de CYP71AJ1 pour la marmésine a été approchée par l’étude d’un modèle 3D. Mots clés : cytochrome P450, psoralène synthase, cinnamate-4-Hydroxylase, C4H, métabolite secondaire, Ruta graveolens, Ammi majus, inactivation autocatalytique, furocoumarines, psoralène, (+)-marmésine, Modélisation 3D, (+)-columbianetine
-cytochrome P450
-columbianetine
-Ammi majus
-Modélisation 3D
-furocoumarines
-psoralène synthase
-marmésine
-inactivation autocatalytique
-cinnamate-4-Hydroxylase
-psoralène
-Ruta graveolens
-C4H
-métabolite secondaire
Furocoumarins are phytoalexins known as efficient therapeutic agents. The work reported here focuses on cytochromes P450 involved in their biosynthesis pathway. A “structure-function” study was realized to understand how C4H from Ruta graveolens (CYP73A32) can resist to psoralen mechanism-based inactivation. Two parts of the protein seems involved in the differential susceptibility of CYP73A32 and CYP73A1 to psoralen. The first, between amino acids 31 and 58, defines differential affinity to psoralen. The second between residues 229 and 379 controls inactivation kinetic. The second part of this work was devoted to cloning and identification of new P450 involved in furocoumarin biosynthesis. On the one hand, several partial cDNA were cloned from Ruta graveolens. On the other hand, CYP71AJ1, cloned from Ammi majus, was identified as a psoralen synthase. The specificity of CYP71AJ1 for marmesin was approached by the study of a 3D model.
-cytochrome P450
-psoralen synthase
-cinnamate-4-Hydroxylase
-C4H
-secondary metabolite
-site directed mutagenesis
-Ruta graveolens
-Ammi majus
-mechanism-based inactivation
-furocoumarins
-psoralen
-marmesin
-homology models
-columbianetin
Source: http://www.theses.fr/2006INPL020N/document
Publié le : lundi 24 octobre 2011
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Unité mixte de recherche INPL-INRA
Agronomie et environnement
Thèse
en vue de l’obtention du grade de
Docteur de l’INPL
mention sciences agronomiques
Présentée par
Romain Larbat
Contribution à l’étude des P450
impliqués dans la biosynthèse des
furocoumarines
Mémoire soutenu publiquement le 30-05-2006 devant un jury composé de :
- Dr. D. Werck-Reichhart (CNRS- IBMP, Strasbourg ) Rapporteur
- Pr. C. Jay-Allemand (Université Montpellier II)
- Pr. P. Dizengremel (INRA-UHP, Nancy) Examinateur
- Pr. J.L. Goergen (CNRS-INPL, Nancy) Examinateur
- Pr. F. Bourgaud (ENSAIA-INRA, Nancy) Directeur de thèse
- Dr. E. Gontier (ENSAIA-INRA, Nancy) Co-directeur de thèse
Remerciements
Je tiens à remercier le Pr. Sylvain Plantureux, directeur du laboratoire
agronomie et environnement, de m’avoir accueilli au sein de son équipe
Je remercie bien évidemment le Pr. Frédéric Bourgaud qui m’a accordé
toute sa confiance en me proposant ce projet de thèse en dépit d’un
classement en DEA « assez moyen ». Durant ces trois ans et demi, j’ai
énormément apprécié sa façon d’encadrer, me laissant une grande autonomie
dans mon travail, tout en se rendant disponible en cas de besoin. Je le remercie
en particulier de m’avoir fait confiance et avoir soutenu financièrement le
développement d’une plate-forme de modélisation au laboratoire.
Je remercie également le Dr. Éric Gontier et le Pr. Jean-Louis Goergen,
mes deux co-directeurs de thèse, pour leurs conseils avisés et leur disponibilité.
J’aimerais exprimer toute ma reconnaissance à Madame Danièle Werck-
Reichhart, directrice de recherche à l’IBMP de Strasbourg, à Monsieur Christian
Jay-Allemand, professeur à l’université de Montpellier II, ainsi qu’à Monsieur
Pierre Dizengremel, professeur à l’UHP de Nancy, pour avoir accepté de juger
mon travail.
Un grand merci au Dr. Alain Hehn, le « Monsieur bio mol » du labo, pour
tous ces coups de main, tous ces conseils, ainsi que sa disponibilité d’écoute et
son positivisme qui m’ont souvent permis de repartir de l’avant lors de mes
instants de doute.
Je remercie tous les stagiaires avec qui j’ai pu travailler : Cuong Nguyen
et Vincent Sauveplane, dans le cadre d’un stage de DEA, ainsi que Terence
Courbariaux et Violaine Raffot, lors de stages d’orientation professionnel et de
BTS, qui ont contribué à la caractérisation de mutants de CYP73A32 et aux
développement des modèles 3D.
Je tiens également à remercier l’ensemble des personnes que j’ai pu
côtoyer au cours de ces trois ans et demi passés au laboratoire, en particulier le
Dr. Emmanuel Guédon pour ces discussions sur notre beau pays rochefortais
et pour ces nombreux conseils en biologie moléculaire, Thamara Olivier et
Catherine Larrière mes deux secrétaires préférées ainsi que Chantal et Denise
les tornades blanches du mercredi matin.
J’adresse un grand merci à tous mes amis de la Thésard Valley et
d’ailleurs, pour tous ces bons moments de franches rigolades avant, pendant et
surtout après le boulot :
1
- Cinzia et Reine, toutes deux fraîchement diplômées qui m’ont fait
découvrir les merveilleux paysages et les délices culinaires du
Piémont et du Liban.
- Les « tout jeunes » : Camille, Flore, Robert, Grand Seb, Michael,
Boris et Dao à qui j’adresse tous mes vœux de réussite.
- Tous les jet-setters de la rue Drouin : David, Jim, Rami, P’tit Ben,
Fredo et les autres…
- Un merci tout particulier à Sandrine et Seb, mes deux collocs, pour
ces deux années de vie en communauté pleine de complicité et de
bonne humeur.
J’exprime enfin, mes plus tendres remerciements à mes parents et mes
amis saint laurentais pour leur soutien constant et leur générosité sans limite.
2
Table des matières
Remerciements……………………………………...……………………...1
Table des matières…………………………………………...……………..3
Abbréviations…………………………………………………...………….8
Nom vernaculaire des espèces citées………………………......…………10
Chapitre I : Synthèse bibliographique et présentation des
objectifs de recherche………………………....…………11
1 LES FUROCOUMARINES ...................................................................11
1.1 Nature................................................................ 11
1.2 Distribution....................... 12
1.3 Rôle écologique................ 12
1.4 Propriétés biologiques.... 13
1.4.1 Interaction avec les macromolécules ..........................................13
1.4.2 Photooxydation et photolyse.......................16
1.4.3 Activation de la mélanogenèse...................16
1.4.4 Activité antiproliférative ...............................................................17
1.4.5 Phototoxicité ...............................................................................17
1.5 Biosynthèse et stockage des furocoumarines linéaires 19
1.5.1 Voie de synthèse des phénylpropanoïdes..19
1.5.2 Voie de synthèse des furocoumarines linéaires..........................21
1.5.3 Stockage dans la plante..............................................................22
1.5.4 Inductibilité de la synthèse23
2 RUTA GRAVEOLENS ET AMMI MAJUS : DEUX PLANTES PRODUCTRICES DE
FUROCOUMARINES.............................................................................25
2.1 Description botanique..... 25
2.1.1 Ruta graveolens..........25
2.1.2 Ammi majus................26
2.2 Intérêt de ces deux modèles pour l’étude de la voie de
synthèse des furocoumarines................................................................. 26
2.3 Synthèse des furocoumarines par les cultures in vitro................ 27
3 LES CYTOCHROMES P450...............................29
3.1 Définition........................................................... 29
3.2 Classification.................................................... 29
3.3 Cycle catalytique.............. 30
3.4 Origine du pouvoir réducteur.......................... 32
3.5 Diversité et évolution des P450....................... 33
3.6 Rôles des P450 végétaux................................................................. 35
3.6.1 Rôles des P450 dans les voies de biosynthèse35
3.6.2 P450 et dégradation de composés exogènes .............................38
3.7 Structure des P450........... 39
3.8 Etude des relations structure-fonction des P450 .......................... 42
3
3.8.1 Modélisation par homologie ........................................................43
3.8.2 Mutagenèse dirigée.....................................44
3.9 P450 et inactivation autocatalytique............... 45
3.9.1 Les inactivateurs autocatalytiques : définition .............................45
3.9.2 Caractérisation d’un MBI................................46
3.9.3 MBI de P450 ...............................................47
4 LA CINNAMATE-4-HYDROXYLASE.....................48
4.1 Description de la famille des CYP 73.............................................. 49
4.2 Les C4H de type II............ 49
4.3 Expression et régulation de la C4H................ 50
4.4 Modification de l’activité C4H in vivo............. 51
4.5 Caractérisation biochimique ........................................................... 54
4.6 Inhibition de la C4H.......................................... 55
5. OBJECTIF DE THESE : ETUDE FONCTIONNELLE ET CLONAGE DE P450 DE
LA VOIE DE BIOSYNTHESE DES FUROCOUMARINES55
Chapitre II: Matériel et méthodes……………………….59
1 MATERIEL ......................................................................................61
1.1 Matériel végétal................ 61
1.2 Souches bactériennes..................................... 61
1.3 Souches de levure............ 61
1.4 Vecteurs ............................................................ 61
1.5 Plasmides recombinants ................................. 64
2 MILIEUX DE CULTURE......................................65
2.1 Milieux de culture pour bactéries................... 65
2.2 Milieux de culture pour levures....................... 66
3 METHODES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE............66
3.1 Amplification d’un fragment d’ADN par PCR................................. 66
3.2 Électrophorèse d’ADN sur gel d’agarose....... 67
3.3 Extraction d’ADN à partir d’un gel d’agarose 67
3.4 Digestion par des enzymes de restriction...... 67
3.5 Ligations ........................................................................................... 68
3.6 Précipitation d’ADN.......................................... 68
3.7 Préparation de bactéries compétentes 68
3.8 Transformation de bactéries par électroporation.......................... 69
3.9 Extraction d’ADN plasmidique ........................................................ 69
3.10 Séquençage .................................................... 71
3.11 Construction de banque d’ADNc.................. 71
3.11.1 Extraction d’ARN total :.............................71
3.11.2 Synthèse des ADNc simple brin par reverse transcription ........72
3.11.3 Amplification des ADNc par PCR..............................................72
3.11.4 Digestion par la protéinase K....................73
3.11.5 Digestion des ADNc bicaténaires par l’enzyme Sfi I .................73
3.11.6 Fractionnement des ADNc sur colonne Chroma 400................74
4
3.11.7 Ligation des ADNc dans le vecteur TriplEx2 ...........................75
3.11.8 Encapsidation des vecteurs recombinants................................75
3.11.9 Titration de la banque ...............................................................76
3.11.10 Amplification de la banque......................76
3.12 Criblage d’une banque d’ADNc..................... 77
3.12.1 Synthèse des sondes marquées...............................................77
3.12.2 Étalement de la banque d’ADNc77
3.12.3 Transfert et fixation des ADN sur membrane ............................77
3.12.4 Hybridation................................................79
3.12.5 Révélation.................................................79
3.12.6 Récupération des plages de lyse..............80
3.12.7 Excision des plasmides.............................80
4 METHODES DE BIOCHIMIE ................................................................81
4.1 Transformation de levures.............................. 81
4.2 Expression des P450 dans les levures et préparation des
microsomes ................................ 82
4.3 Dosage de protéines........ 83
4.4 Quantification des P450 par spectre CO ........................................ 83
4.5 Mesure d’activités enzymatiques.................... 84
4.5.1 Substrats.....................................................84
4.5.2 Détermination des constantes catalytiques.84
4.5.3 Mesure de l’inhibition par le psoralène........................................85
4.6 Détection des produits formés par HPLC...... 85
4.7 Spectrométrie de masse.................................. 86
5 MODELISATION DE CYP73A32 ET CYP71AJ186
Chapitre III: Recherche des déterminants moléculaires de
l'inactivation différentielle des C4H de rue et de
topinambour……………………………………………..89
1 INTRODUCTION ...............................................................................89
2 RESULTATS....................93
2.1 Caractérisation de l’inactivation autocatalytique de la C4H
d’Arabidopsis par le psoralène............................... 93
2.2 Recherche des acides aminés responsables de la sensibilité
différentielle des C4H vis à vis des furocoumarines............................. 95
2.2.1 ............... Première approche : Mutagenèse dirigée sur les résidus
conservés de CYP73A32, A10 et A41 .................................................95
2.2.2 Deuxième approche : Étude de protéines chimères de CYP73A32
et CYP73A1 .......................................................101
2.2.3............... Construction d’un modèle 3D de CYP73A32 et étude de
l’orientation du psoralène dans le site actif ........................................107
3 DISCUSSION .................................................................................112
3.1 Origine évolutive de la résistance de CYP73A32, A10 et A41
5
à l’inactivation par le psoralène........................................................... 112
3.2 Expression hétérologue dans les levures WAT 11...................... 113
3.3 Impact de la modification de l’extrémité N-terminale sur l’affinité
de CYP73A32 pour le psoralène 115
3.4 Recherche des résidus contrôlant la vitesse d’inactivation par
le psoralène ............................................................................................ 117
4 CONCLUSION................120
Chapitre IV: Recherche de P450 de la voie de biosynthèse
des furocoumarines : identification et caractérisation
fonctionnelle de la psoralène synthase d'Ammi
majus……….…………………………………………..123
1 INTRODUCTION .............................................................................123
2 RESULTATS..................126
2.1 Résumé de l’isolement des séquences réalisé par l’équipe
du Pr. Matern.......................... 126
2.2 Expression hétérologue des P450 d’Ammi majus et identification
de la psoralène synthase....................................................................... 127
2.2.1 Séquences et classification des 3 P450 étudiés .......................127
2.2.2 Clonage des ADNc dans le vecteur pYeDP60 ..........................129
2.2.3 ....... Introduction des plasmides pYe71AJ1, pYe76B8 et pYe82H1
dans les levures WAT 11 ...................................................................131
2.2.4 Mise au point des conditions d’expression dans WAT 11 .........131
2.2.5 Modification de l’extrémité N-terminale de CYP71AJ1..............134
2.2.6 Expression de CYP71AJ1-NT dans WAT 11 ............................135
2.2.7 Criblage fonctionnel de CYP71AJ1, CYP76B8 et CYP82H1 ....137
2.3 Caractérisation enzymatique de la psoralène synthase ............. 141
2.3.1 Détermination du pH optimal d’activité......................................141
2.3.2 Détermination de la température optimale143
2.3.3 Linéarité de la réaction..............................................................143
2.3.4 Constantes cinétiques de la psoralène synthase ......................143
2.3.5 Mesure de la sensibilité de CYP71AJ1-NT à l’inactivation
autocatalytique par les furocoumarines .............................................144
2.3.6 .... Recherche d’une inhibition compétitive des furocoumarines sur
CYP71AJ1-NT ...................................................145
2.3.7... Bioconversion de la (+)-marmésine en psoralène par les levures
exprimant les formes natives et modifiées de CYP71AJ1..................147
2.3.8.Test de la métabolisaton de la (+)-columbianetine par CYP71AJ1-
NT ......................................................................................................149
2.4 Etude in silico de la psoralène synthase...... 151
2.4.1 Création d’un modèle tridimensionnel de CYP71AJ1 ...............151
2.4.2.................. Simulation d’ancrage de la (+)-marmésine et de la (+)-
columbianetine...................................................................................153
6
3 DISCUSSION .................................................................................155
3.1 Clonage de P450 de la voie des furocoumarines par
differential display.................. 155
3.2 Expression hétérologue des CYP d’Ammi majus dans WAT 11 156
3.3 Identification et caractérisation de la psoralène synthase......... 158
3.4 Comportement de la psoralène synthase vis à vis de l’inhibition
par les furocoumarines.......................................................................... 162
3.5 Spécificité de CYP71AJ1 dans la voie de synthèse des
furocoumarines linéaires....... 163
4 CONCLUSION................................................................................163
Chapitre V : Recherche de P450 de la voie de biosynthèse
des furocoumarines : clonage de P450 candidats à partir de
tissus élicités de Ruta graveolens……………………...165
1 INTRODUCTION .............................................................................165
2 RESULTATS..................169
2.1 Recherche de fragments de gènes codant des P450 chez
Ruta graveolens à l’aide de la stratégie CODEHOP ............................ 169
2.1.1 Choix des amorces CODEHOP ................................................171
2.1.2 PCR CODEHOP sur ADN génomique......172
2.2 Elicitation de la production de furocoumarines dans les feuilles
de Ruta graveolens ................................................ 173
2.2.1 Impact des UV sur la quantité en furocoumarines ....................175
2.2.2 Impact des UV sur l’expression des P450 isolés ......................176
2.3 Recherche des ADNc complets des P450 isolés à partir d’une
banque de feuilles de Ruta graveolens traitée aux UV ....................... 177
2.3.1 Marquage des sondes...............................................................177
2.3.2 Criblage de la banque177
2.3.3 Nature des séquences isolées par criblage de la banque.........179
2.3.4 Tentative d’isolement des séquences entières .........................180
3 DISCUSSION .................................................................................181
3.1 Tentative d’élicitation de plantes de rue par les UV.................... 181
3.2 Clonage de P450 candidats pour la synthèse des
furocoumarines chez Ruta graveolens................ 182
4 CONCLUSION................................................................184
Conclusion générale et perspectives…………………...185
Références bibliographiques……………………………………...……..193
Listes des figures et tableaux………………………………...………….211
Annexes………………………………………………………...……….217
7
Abbréviations
2EN : 2-éthynylnaphtalène
2HN : 2-hydroxy-1-naphtoate
3PA : trans-3-(pyrid-4-yl)-acrylic acid
4CL : 4-coumarate ligase
4PB : acide 4-propynyloxybenzoique
5-MOP : 5-méthoxypsoralène ; bergaptène
5-8-MOP : 5-8- ; isopimpinelline
8-MOP : 8- ; xanthotoxine
ADN : acide désoxyribonucléique
ADNc : ADN complémentaire
ARN : acide ribonucléique
ATP : adénine tri-phosphate
BCIP : 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-phosphate
C2H : cinnamate/p-coumarate-2-hydroxylase
C3’H : p-coumaroyl-3’-hydroxylase
C4H : cinnamate-4-hydroxylase
CO : monoxyde de carbone
CYP : cytochrome P450
DAG : diacylglycérol
DIMBOA : 2,4-dihydroxy-7-methoxy-2H-1,4-benzoxazin-3(4H)-one
DIG : digoxygénine
DMAPP :diméthyl-allyl-pyrophosphate
DMS : déméthylsubérosine
DMSO : diméthylsulfoxyde
DO : Densité optique
EDTA : acide ethylène diamine tétraacétique
EGF : epidermal growth factor
EOR : espèce oxygénée réactive
EST : expressed sequence tag : étiquette de séquneces exprimées
F2H : Férulate-2-hydroxylase
F3’H : flavonoïde-3’-
F3’5’H -3’-5’-hydroxylase
F5H : férulate-5-hydroxylase
F6H : flavonoïde-6-
FAD : flavine adénine dinucléotide
FMN : flavine mononucléotide
8
GC-MS : chromatagraphie gazeuse-spectrométrie de masse
HPLC : High performance liquid chromatography / chromatographie liquide
haute performance
IPP : isopentényl-pyrophosphate
IPTG : isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside
LB : Luria Bertani
MBI : mechanism based inactivation
NADH : nicotinamide adénine dinucléotide, forme réduite
NADP : nicotinamide adénine dinucléotide phosphate, forme oxydée
NADPH : nicotinamide adénine dinucléotide phosphate, forme réduite
NBT : 4-nitro-blue-tetrazolium
N O : protoxyde d’azote 2
NO : oxyde d’azote
PA : acide pipéronylique
PAL : phénylalanine ammonia-lyase
PCR : polymerase chain raction
PDB : protein data bank
PEG : polyéthylène glycol
pI : point iso-électrique
P-UVA : psoralène-UVA-thérapie
RMN : résonance magnétique nucléaire
SDS : sodium dodécyl sulfate
SRS : substrate recognition site. site de reconnaissance du substrat
TAL : tyrosine ammonia-lyase
TEA : tris acétate EDTA
UV : ultra-violet
9

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