Développement et application de méthodes bioinformatiques pour la recherche de gènes de sRNA à boîtes H/ACA dans les génomes d’archaea et étude fonctionnelle des ARN et sRNP H/ACA correspondants, Development and application of computational methods dedicated to the identification of H/ACA box sRNAs within archaeal genomes and functional study of the corresponding RNAs and H/ACA sRNPs

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Sous la direction de Christiane Branlant
Thèse soutenue le 27 novembre 2007: Nancy 1
La conversion des résidus U en pseudouridine (Y) est la modification la plus fréquente dans les ARN. Cette réaction est catalysée par des ARN:Y-synthases qui fonctionnent soit seules, soit au sein de particules snoRNP H/ACA composées de 4 protéines et d’un snoRNA. Celui-ci assure la reconnaissance de l’ARN cible par appariement de bases. Les pseudouridylations des ARNr eucaryotes sont catalysées par des snoRNP alors que les modifications des ARNt sont catalysées par des enzymes dépourvues de guide. Aucun snoRNA H/ACA n’est décrit chez les Bactéries. Trois équivalents des snoRNA H/ACA (sRNA H/ACA) avaient été découverts chez les Archaea lorsque j’ai débuté ma thèse, mais leur contribution aux modifications des ARNr n’avait pas été démontrée. Nous avons développé une approche bioinformatique permettant l’identification exhaustive de gènes de sRNA H/ACA et de leurs cibles. Nous avons ainsi identifié 7 sRNA H/ACA chez Pyrococcus abyssi et détecté 14 Y dans les ARNr. Nous avons réussi la reconstitution de particules H/ACA actives in vitro, ce qui nous a permis d’étudier leur mode d’assemblage et d’assigner 12 des Y détectées aux 7 sRNA. L’application à d’autres espèces d’archaea de l’approche bioinformatique développée nous a permis d’identifier environ 90 sRNA, nous avons ainsi pu étudier leur évolution. De plus, nous avons expérimentalement démontré pour la première fois qu’un sRNA H/ACA est impliqué dans la modification d’un ARNt. Enfin, nous avons montré que l’enzyme aCBF5 des sRNP H/ACA peut catalyser la pseudouridylation en position 55 des ARNt sans utilisation de sRNA et nous avons identifié des résidus de aCBF5 impliqués dans les activités guidée et/ou non guidée.
-Pyrococcus abyssi
The conversion of U into Pseudouridine (Y) residue is the most prevalent RNA modification. This reaction is catalysed either by stand-alone RNA:Y-synthases or by H/ACA snoRNPs composed of 4 proteins and a snoRNA. In snoRNPs the recognition of the U residue is carried out by base-pair interactions between the snoRNA and the RNA target. SnoRNPs are involved in eukaryal rRNA modifications whereas stand-alone RNA:Y-synthase are involved in tRNA and bacterial rRNA modifications. Three counterparts of the H/ACA snoRNAs had been discovered in Archaea when I started my PhD work, but their contribution to rRNA modification was not demonstrated. We developed a computational approach to identify the H/ACA sRNA genes and their rRNA targets. Its application to the Pyrococcus abyssi genome revealed 7 candidate genes. We verified their expression and experimentally identified 14 Y in the P. abyssi rRNAs. We succeeded in the in vitro reconstitution of active H/ACA sRNPs and thereby studied the sRNP assembly mechanism, identified important H/ACA sRNA structural features and assigned 12 of the identified Y residues to the 7 sRNAs. The application of the computational approach to the other archaeal genomes revealed 90 sRNA genes. This repertoire shed new light on the function and the evolution of this ncRNA class. In addition, we experimentally demonstrated for the first time that a few H/ACA sRNAs are involved in tRNA modification. We also showed that the enzyme of the H/ACA sRNP (aCBF5) is involved in Y55 formation in all archaeal tRNAs without the use of an H/ACA sRNA. We compared the guided and non-guided CBF5 activities and identified aminoacids which are important for these activities.
Source: http://www.theses.fr/2007NAN10110/document
Publié le : mardi 25 octobre 2011
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FACULTE DES SCIENCES & TECHNIQUES

U.F.R. Sciences et Techniques Biologiques
Ecole Doctorale Biologie, Santé, Environnement


Thèse

présentée pour l’obtention du titre de
Docteur de l’Université Henri Poincaré, Nancy-I
en Biologie Moléculaire

par Sébastien MULLER


Développement et application de méthodes bioinformatiques pour la
recherche de gènes de sRNA à boîtes H/ACA dans les génomes
d’archaea et étude fonctionnelle des ARN et sRNP H/ACA
correspondants



Soutenance publique le 27 Novembre 2007



Membres du Jury :


Président du Jury : M. Alain JACQUIER Directeur de Recherche CNRS, Paris
Rapporteurs : M. Daniel GAUTHERET Professeur, Université Paris XI, Orsay
M. Yves HENRY Directeur de Recherche CNRS, Toulouse
Examinateur : M. Bruno CHARPENTIER Professeur, Université Henri Poincaré, Nancy
Directeur de thèse : Mme Christiane BRANLANT Directeur de Recherche CNRS, Nancy

_______________________________________________________________________________

Laboratoire de Maturation des ARN et Enzymologie Moléculaire, UMR 7567 CNRS-UHP
Faculté des Sciences & Techniques – 54506 Vandoeuvre-lès-Nancy
Remerciements


Je tiens à remercier Christiane Branlant, pour m’avoir accueilli dans son laboratoire et
permis de réaliser ce travail dans les meilleures conditions. Sa rigueur scientifique et son énergie
m’ont considérablement stimulé tout au long de cette expérience formatrice. J’ai été
particulièrement honoré de la confiance qu’elle a toujours eue en moi et mon travail. Elle a
toujours su m’orienter vers les meilleures pistes de recherche et collaborations internes au sein
du laboratoire. Elle m’a toujours témoigné son soutien lors des moments difficiles.

Je suis très sensible au grand honneur que me font Messieurs Daniel Gautheret et Yves
Henry, d’accepter d’être rapporteurs de ce mémoire. Je remercie aussi sincèrement Messieurs
Alain Jacquier et Bruno Charpentier qui ont accepté d’examiner cette thèse.

Je suis particulièrement reconnaissant envers Fabrice Leclerc, Bruno Charpentier et Yuri
Motorin qui ont su me communiquer leur passion pour la recherche, leur savoir-faire dans des
domaines aussi divers que la bioinformatique, la biochimie des protéines et la biologie
moléculaire mais aussi pour leur rigueur. Les conseils qu’ils m’ont prodigués m’ont permis
d’avancer efficacement dans mes travaux. J’espère, dans ma vie professionnelle à venir, pouvoir
à mon tour atteindre ce niveau et pouvoir le transmettre.

J’exprime ma reconnaissance aux post-docs, thésards ou anciens thésards avec lesquels j’ai
pu collaborer au cours de ces travaux : merci tout particulièrement à Isabelle qui m’a appris à
manier la technique RT-CMCT, à Emmanuel, à Alan et Jean-Baptiste qui ont pu poursuivre des
expériences quand j’ai débuté la rédaction de ce manuscrit. Nos discussions, scientifiques ou
non, m’ont beaucoup apporté et j’espère que nos routes se recroiseront.

Merci à tous ceux qui m’ont aidé à rédiger ce manuscrit: principalement mes collaborateurs
déjà cités, en particulier Isabelle et Bruno, et mon épouse dont les facilités en langue m’ont été
très profitables.

Merci à tous ceux qui ont contribué à la bonne ambiance et au merveilleux environnement
dans lequel j’ai eu la chance d’évoluer. Je pense notamment à Tadek, Zdenek, Benoit, Alan,
Aileen, Nath MG, Nath R, Isabelle, Arnaud, Mathias, François, Bruno, Athanase, Lionel,
François G, Sylvain, Claude, Denise, Valérie, Magali, Karine, Rémi, Hadidja, Jackie, Corinne,
Delphine, Xavier M, Christophe G, Christophe C, Séverine B, Manu et les autres que je n’oublie
pas.

Je tiens aussi à remercier Benoit, Alex O, Sylvain, Bruno, Alan, Xavier R, Laure, Nico,
Christophe et les autres qui m’ont permis de me défouler grâce au Tennis, Badminton, Foot et
autres sports.

IRemerciements
Je remercie également mes amis exilés : Christophe, Franck, Jean-Thomas, les membres du
cercle « Fear » dont tonton Jean-Paul et Ronan, et tous ceux qui se reconnaîtront sous
l’appellation « mes amis ». Ils ont contribué à leur façon à cet ouvrage.

Je suis immensément reconnaissant envers mes parents. Ils m’ont toujours soutenu et
encouragé en formidables et parfaits parents qu’ils sont. C’est certainement ma mère qui,
inconsciemment, m’a guidé vers le monde de la recherche et ses longues études. Je ne sais pas
pourquoi, et je ne chercherai pas à y répondre ici. Mon père lui, m’a toujours fait croire que la
vie était un jeu et en cela je le remercie de me rappeler qu’il faut aussi en profiter.

Enfin, cette liste ne serait pas complète et juste si j’oubliais ma petite famille qui, tout au
long de ma thèse, m’a toujours soutenu et encouragé. Mon épouse, Eline, par sa compréhension,
son intelligence, sa patience et son amour a su créer un environnement dans lequel j’ai pu
accomplir cette lourde tâche. Elle m’a supporté pendant ces années, et ce même si cela n’était
pas facile. J’ai bien conscience des sacrifices consentis et je ne l’oublierai jamais.
C’est avec elle que j’ai réalisé la plus belle « chose » de ma vie : ma fille Mina. Elle est née
pendant ce travail de thèse et constitue donc, en quelque sorte, mon travail de thèse. Cependant,
cet aspect ne sera pas abordé dans la suite de l’exposé. C’est son incroyable joie de vivre et son
amour qui m’ont apporté la confiance qui me manquait au début de cette thèse. Etant donné que
cette confiance a été essentielle à la concrétisation de mes convictions scientifiques et, par
conséquent, à la réalisation de ces travaux, je dois avouer que je n’aurais jamais réussi à mener
aussi bien ma recherche sans elles. Par conséquent, je dédie cet ouvrage à Eline & Mina.

Je remercie également le reste de ma famille et de ma belle-famille. Malgré tous mes
efforts, mes grands-parents n’ont toujours pas compris ce que je faisais en thèse, et ce n’est pas
grave… Ce qui compte pour eux, et donc ce qu’ils espèrent, est que je commence enfin à
travailler ! Ainsi, ce manuscrit ne serait pas le fruit d’un long et difficile travail mais plutôt le
résultat d’une passion qui m’a pris quelques unes de mes soirées. Après tout, c’est peut-être la
meilleure manière de considérer ces travaux…







II Abréviations & Anglicismes

Abréviations & Anglicismes

A : adénine
aa : acide aminé
ADN : acide désoxyribonucléique
ADNc : acide désoxyribonucléique complémentaire
ARN : acide ribonucléique
ARNm : acide ribonucléique messager
ARNnc : ARN non codant
ARN pol : ARN polymérase
ARNr : acide ribonucléique ribosomique
ARNt : acide ribonucléique de transfert
ATP : adénosine 5' triphosphate
C : cytosine
°C : degré celsius
Ci : curie
CB : « Cajal Bodies », corps de Cajal
CMCT : 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoéthyl) carbodiimide métha-p-toluène
cpm : coups par minute
cps : coups par seconde
C-ter : extrémité C-terminale
Da, KDa : dalton, kilodalton
db : double brin
ddNTP : didésoxyribonucléotide triphosphate
DNase : désoxyribonucléase
dNTP : désoxyribonucléotide triphosphate
DO : densité optique
DTT : dithiothréitol
EDTA : éthylène diamine tétraacétate
5FU : 5-fluoro-uridine
g/ mg/ µg/ ng : gramme/ milligramme/ microgramme/ nanogramme
G : guanine
h : heure
I : inosine
IPTG : isopropyl β-D-thiogalactoside
kanr : gène de résistance à la kanamycine
Kb : kilobase
l/ ml/ µl : litre/ millilitre/ microlitre
LB : Luria Bertani
M/ mM/ µM/ nM : molaire/ millimolaire/ micromolaire/ nanomolaire
min : minute
NMP : ribonucléotide monophosphate
NTP : ribonucléotide triphosphate
nt : nucléotide
N-ter : extrémité N-terminale
pb : paire de base
PEG : polyéthylène glycol
pGalS : promoteur galactose dépendant
pré-ARNm : précurseur de l'ARN messager
pré-ARNr ARN ribosomique
pré-ARNt : précurseur de l'ARN de transfert
IIIAbréviations & Anglicismes

qsp : quantité suffisante pour
R : purine
RMN : résonance magnétique nucléaire
RNase : ribonucléase
RNasin : inhibiteur des ribonucléases
rNTP : ribonucléotide triphosphate
RT : reverse transcriptase
RX : rayons X
s : seconde
S : Svedberg
sb : simple brin
SDS : sodium dodécylsulfate
structure 2D : structure secondaire
structure 3D : structure tertiaire
T : thymine
TLC : chromatographie sur couche mince
U (UE) : unité enzymatique
Ψ : pseudouridine
Y : pyrimidine

Anglicisme: certains termes ne sont pas ou sont rarement traduits :

ETS : external transcribed sequence
GST : glutathione S-transferase
LUCA : Last Universal Common Ancester ou dernier ancêtre commun universel
LSU : large subunit
ORF : phase ouverte de lecture (Open Reading Frame)
PCR : amplification en chaine par une polymérase (polymerase chain reaction)
SSU : small subunit
SELEX : Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment
gRNA : ARN guide
sRNA : petit ARN (Small RNA)
sRNP : particule ribonucléoprotéique contenant un ou des petits ARN (Small
ribonucleoprotein particule)
scaRNA : petit ARN contenu dans les Cajal Bodies (Small Cajal Bodies RNA)
scaRNP : particule ribonucléoprotéique contenant un ou des petits ARN contenus dans
les Cajal Bodies (Small Cajal Bodies ribonucleoprotein particule)
snoRNA : petit ARN nucléolaire (Small nucleolar RNA)
snRNA : petit ARN nucléaire (Small nuclear RNA)
snoRNP : particule ribonucléoprotéique contenant un ou des petits ARN nucléolaires
(Small nucleolar ribonucleoprotein particule)
snRNP RN nucléaires
(Small nuclear Ribonucleoprotein Particule)
UsnRNA : « uridine rich small nuclear ribonucleic acid »
UsnRNA all nuclear ribonucleoprotein particle »
spliceosome : complexe nucléaire ribonucléoprotéique dans lequel ont lieu les réactions
d'épissage
UTR : untranslated region

IV Résumé


Résumé

La conversion des résidus U en pseudouridine ( Ψ) est la modification la plus fréquente dans les ARN.
Cette réaction est catalysée par des ARN: Ψ-synthases qui fonctionnent soit seules, soit au sein de
particules snoRNP H/ACA composées de 4 protéines et d’un snoRNA. Celui-ci assure la
reconnaissance de l’ARN cible par appariement de bases. Les pseudouridylations des ARNr
eucaryotes sont catalysées par des snoRNP alors que les modifications des ARNt sont catalysées par
des enzymes dépourvues de guide. Aucun snoRNA H/ACA n’est décrit chez les Bactéries.
Trois équivalents des snoRNA H/ACA (sRNA H/ACA) avaient été découverts chez les Archaea
lorsque j’ai débuté ma thèse, mais leur contribution aux modifications des ARNr n’avait pas été
démontrée. Nous avons développé une approche bioinformatique permettant l’identification
exhaustive de gènes de sRNA H/ACA et de leurs cibles. Nous avons ainsi identifié 7 sRNA H/ACA
chez Pyrococcus abyssi et détecté 14 Ψ dans les ARNr.
Nous avons réussi la reconstitution de particules H/ACA actives in vitro, ce qui nous a permis
d’étudier leur mode d’assemblage et d’assigner 12 des Ψ détectées aux 7 sRNA.
L’application à d’autres espèces d’archaea de l’approche bioinformatique développée nous a permis
d’identifier environ 90 sRNA, nous avons ainsi pu étudier leur évolution. De plus, nous avons
expérimentalement démontré pour la première fois qu’un sRNA H/ACA est impliqué dans la
modification d’un ARNt.
Enfin, nous avons montré que l’enzyme aCBF5 des sRNP H/ACA peut catalyser la pseudouridylation
en position 55 des ARNt sans utilisation de sRNA et nous avons identifié des résidus de aCBF5
impliqués dans les activités guidée et/ou non guidée.

Mots-Clés : archaea, Pyrococcus abyssi, sRNA H/ACA, pseudouridine, ARN guide, ARN: Ψ-
synthase


Title :

Development and application of computational methods dedicated to the identification of
H/ACA box sRNAs within archaeal genomes and functional study of the corresponding RNAs
and H/ACA sRNPs.

Summary

The conversion of U into Pseudouridine ( Ψ) residue is the most prevalent RNA modification. This
reaction is catalysed either by stand-alone RNA:Ψ-synthases or by H/ACA snoRNPs composed of 4
proteins and a snoRNA. In snoRNPs the recognition of the U residue is carried out by base-pair
interactions between the snoRNA and the RNA target. SnoRNPs are involved in eukaryal rRNA
VRésumé


modifications whereas stand-alone RNA: Ψ-synthase are involved in tRNA and bacterial rRNA
modifications.
Three counterparts of the H/ACA snoRNAs had been discovered in Archaea when I started my PhD
work, but their contribution to rRNA modification was not demonstrated. We developed a
computational approach to identify the H/ACA sRNA genes and their rRNA targets. Its application to
the Pyrococcus abyssi genome revealed 7 candidate genes. We verified their expression and
experimentally identified 14 Ψ in the P. abyssi rRNAs.
We succeeded in the in vitro reconstitution of active H/ACA sRNPs and thereby studied the sRNP
assembly mechanism, identified important H/ACA sRNA structural features and assigned 12 of the
identified Ψ residues to the 7 sRNAs.
The application of the computational approach to the other archaeal genomes revealed 90 sRNA
genes. This repertoire shed new light on the function and the evolution of this ncRNA class.
In addition, we experimentally demonstrated for the first time that a few H/ACA sRNAs are involved
in tRNA modification.
We also showed that the enzyme of the H/ACA sRNP (aCBF5) is involved in Ψ55 formation in all
archaeal tRNAs without the use of an H/ACA sRNA. We compared the guided and non-guided CBF5
activities and identified aminoacids which are important for these activities.


Key Words: archaea, Pyrococcus abyssi, H/ACA sRNA, pseudouridine, RNA guide, RNA: Ψ-
synthase.
VI












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