Effet thérapeutique du cetuximab administré par aérosol dans un modèle animal de tumeur broncho-pulmonaire : importance du récepteur Fc Rn dans la réponse anti-tumorale à cet anticorps.

De
Publié par

Sous la direction de Etienne Lemarié
Thèse soutenue le 27 novembre 2008: Tours
Le but de cette étude a été d’analyser l’intérêt de l’aérosolthérapie d’anticorps monoclonaux (AcM) dans le traitement du cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules (CBNPC) en utilisant le cetuximab, un AcM anti-EGFR. L’expression du récepteur FcRn, essentiel dans la pharmacocinétique et la biodistribution des IgGs thérapeutiques a été étudiée dans le CBNPC. Nos résultats montrent que l’AcM peut résister aux contraintes physiques de la nébulisation. Les données de biodistribution et pharmacocinétique, obtenues dans un modèle animal, indiquent que l’Ac administré par aérosol, s’accumule de façon prolongée au niveau pulmonaire. De plus, les tumeurs chez la souris paraissent sensibles à l’aérosolthérapie avec l’AcM. Par ailleurs, le récepteur FcRn est moins exprimé au niveau transcriptionnel et protéique dans le tissu tumoral que dans le tissu sain adjacent à la tumeur dans le CBNPC. Cette altération de l’expression pourrait être due à l’hyperméthylation du promoteur de ce gène.
-Cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules
-Aérosolthérapie
-Anticorps thérapeutiques
-Récepteur FcRn
The project aims at determining whether aerosoltherapy is well suited for monoclonal antibodies (Mab), in Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC). In addition, exploration of the expression of FcRn, an IgG receptor contributing to increased half-life and biodistribution of Mab, has been studied in NSCLC. Using cetuximab, an anti-EGFR Mab, we showed that Mab resist the physical constraints of nebulization. Biodistribution and pharmacokinetic analyses, using a murine model, revealed that cetuximab is highly and durably accumulated within the lungs and slowly and weakly released into the bloodstream following airways delivery. Moreover, animal tumors seem sensitive to cetuximab aerosoltherapy. Expression analysis of FcRn at both the transcript and protein levels showed that the receptor is downregulated in NSCLC. FcRn alteration of expression in the tumor might be due to hypermethylation of the gene promoter as often found in cancer.
-Non small cell lung cancer
-Aerosoltherapy
-Therapeutic antibody
-FcRn receptor
Source: http://www.theses.fr/2008TOUR3104/document
Publié le : mercredi 26 octobre 2011
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UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS
DE TOURS


ÉCOLE DOCTORALE Santé, Sciences, Technologie
INSERM U618

THÈSE présentée par :
Agnès MAILLET

soutenue le : 27 novembre 2008


pour obtenir le grade de : Docteur de l’Université François - Rabelais
Discipline/ Spécialité : Sciences de la Vie et de la Santé


EFFET THÉRAPEUTIQUE DU CETUXIMAB ADMINISTRÉ
PAR AÉROSOL DANS UN MODÈLE ANIMAL DE TUMEUR
BRONCHO-PULMONAIRE

Importance du récepteur FcRn dans la réponse anti-tumorale à
cet anticorps


THÈSE dirigée par :

M. LEMARIÉ Etienne Professeur, Université François - Rabelais, Tours

Co-encadrement par :

ème Mme HEUZÉ-VOURC’H Nathalie Chargée de Recherche 2 classe - INSERM, Tours

RAPPORTEURS :

M. CADRANEL Jacques Professeur, Université Paris VI
M. BARBET Jacques Directeur de Recherche - CNRS, Université de Nantes


JURY :

M. BARBET Jacques Directeur de Recherche - CNRS, Université de Nantes
M. BERHENS Christian Chef de projet, LFB Biotechnologies, Les Ulis
M. CADRANEL Jacques Professeur, Université Paris VI
M. DIOT Patrice Professeur, Université François - Rabelais, Tours
M. LEMARIÉ Etienne Professeur, Université François - Rabelais, Tours
M. OHRESSER Marc Ingénieur de Recherche - CNRS, Université François - Rabelais, Tours


UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS
DE TOURS


ÉCOLE DOCTORALE Santé, Sciences, Technologie
INSERM U618

THÈSE présentée par :
Agnès MAILLET

soutenue le : 27 novembre 2008


pour obtenir le grade de : Docteur de l’Université François - Rabelais
Discipline/ Spécialité : Sciences de la Vie et de la Santé


EFFET THÉRAPEUTIQUE DU CETUXIMAB ADMINISTRÉ
PAR AÉROSOL DANS UN MODÈLE ANIMAL DE TUMEUR
BRONCHO-PULMONAIRE

Importance du récepteur FcRn dans la réponse anti-tumorale à
cet anticorps


THÈSE dirigée par :

M. LEMARIÉ Etienne Professeur, Université François - Rabelais, Tours

Co-encadrement par :

ème Mme HEUZÉ-VOURC’H Nathalie Chargée de Recherche 2 classe - INSERM, Tours

RAPPORTEURS :

M. CADRANEL Jacques Professeur, Université Paris VI
M. BARBET Jacques Directeur de Recherche - CNRS, Université de Nantes


JURY :

M. BARBET Jacques Directeur de Recherche - CNRS, Université de Nantes
M. BERHENS Christian Chef de projet, LFB Biotechnologies, Les Ulis
M. CADRANEL Jacques Professeur, Université Paris VI
M. DIOT Patrice Professeur, Université François - Rabelais, Tours
M. LEMARIÉ Etienne Professeur, Université François - Rabelais, Tours
M. OHRESSER Marc Ingénieur de Recherche - CNRS, Université François - Rabelais, Tours



REMERCIEMENTS


Cette thèse a été réalisée au sein de l’unité INSERM U618, dans l’équipe « Aérosols et
Cancer broncho-pulmonaire », à la Faculté de Médecine de l’Université François-Rabelais de
Tours, sous la direction du Professeur Etienne LEMARIÉ et du Docteur Nathalie HEUZÉ-
VOURC’H.

Je tiens particulièrement à remercier Nathalie HEUZÉ-VOURC’H, ma co-encadrante
de thèse, avec qui j’ai beaucoup appris pendant ces trois années de thèse aussi bien sur le plan
scientifique que sur le plan humain. Nathalie, merci pour ta gentillesse, ta bonne humeur, ta
présence et ton soutien permanent. Je suis très heureuse d’avoir été « cobaye » pour ta
première thèse et espère que tu auras aimé autant que moi l’équipe que nous avons formée
pendant ces trois années !

Je remercie également le Professeur Etienne LEMARIÉ, mon directeur de thèse, pour
l’approche clinique qu’il a apportée à nos nombreuses réflexions et pour sa bienveillance.

J’adresse mes plus sincères remerciements aux membres du jury, le Docteur Jacques
BARBET et le Professeur Jacques CADRANEL qui me font l’honneur d’être les rapporteurs
de ma thèse, le Docteur Christian BEHRENS, le Professeur Patrice DIOT et le Docteur Marc
OHRESSER qui ont accepté de juger cette thèse.

Je remercie les différents organismes qui ont financé cette thèse et qui ont permis
qu’elle existe. La SPLF, Pneumologie et Développement et l’ARAIR pour le soutien financier
de la thèse mais également l’INSERM, le Ministère de la Recherche, l’IFR 135, le
Cancéropôle Grand Ouest et la Ligue Contre le Cancer.

Je tiens également à remercier toutes les personnes avec qui nous avons collaboré
pendant ces trois années. Ça a été un réel plaisir pour moi de partager leur expérience et leur
savoir faire :

- Laurent GUILLEMINAULT qui a mis de côté sa blouse de médecin pour venir travailler à
nos côtés pendant un an. J’ai beaucoup aimé travailler avec toi pendant ces quelques mois où
tu es venu agrandir la petite famille « cetuximab » et ton regard de clinicien a été de précieux
conseils !

- l’équipe du CIPA d’Orléans avec qui nous avons fait une grande majorité des
expérimentations animales : Alain LE PAPE, Stéphanie LERONDEL, Maryline LEMÉE,
Stéphanie RÉTIF, Sabrina PESNEL et Julien SOBILO. Merci d’avoir chouchouté nos
animaux !

- les équipes 6 et 7 de l’UMR CNRS 6239-GICC de Tours avec qui nous avons étroitement
collaboré et qui nous ont approvisionné en cetuximab (vue notre consommation, ce n’était pas
négligeable !) : Nicolas CONGY-JOLIVET et Gilles THIBAULT pour nous avoir gentiment
aidés sur les études de cytométrie en flux, Gilles PAINTAUD et Nicolas AZZOPARDI pour
leur précieuse aide sur la pharmacocinétique, Marc OHRESSER pour les différentes
constructions plasmidiques FcRn α et β2m et Hervé WATIER, Marie-Cécile ROUSSANNE
et Charlotte MAGDELAINE pour leurs conseils avisés tout au long de ce projet.

- les collègues du bâtiment M : Sandrine LEGUELLEC et Laurent VECELLIO pour leur
gentillesse, leur grande disponibilité et leurs conseils sur les aérosols, Jérome MONTHARU
et Georges ROSEAU (du PPF animalerie) pour la bonne humeur qu’ils ont apportée aux
expérimentations animales et Michèle DE MONTE pour ses conseils sur les études
statistiques.

- Serge GUYETANT, Claire BLÉCHET, Sandra REGINA et Catherine COCO pour la
collecte des prélèvements pulmonaires et des données anatomo-pathologiques et cliniques.
Merci d’avoir pris le temps pour les études immunohistochimiques et pour l’analyse des
données clinico-pathologiques des patients.


- le laboratoire Novaxia dirigée par Brigitte LEGRAIN et le docteur Dominique-Henri
DOUVIN pour les analyses anatomo-pathologiques des prélèvements de souris.

- José HUREAUX du CHU d’Angers pour m’avoir formée pour les premières aérosolisations
chez la souris et Isabelle Valo pour les études anatomopathologiques.

- Serge BERNARD et Hervé LEROUX de l’INRA de Nouzilly qui nous ont gentiment
accueillis dans leur laboratoire pour l’étude de tolérance.

- Jacques BARBET et Alain FAIVRE-CHAUVET de l’INSERM U892 de Nantes pour le
125marquage du cetuximab à l’iode .

- le laboratoire du LFB Biotechnologies pour la purification de l’anticorps anti-FcRn α.

- Anthony COURTOIS du laboratoire de Biotechnologie et Molécules Marines de Brest pour
le marquage du cetuximab au FITC.

- le Professeur ANTHONIOZ et Claudine PROUIN du laboratoire de cytologie du CHU
Bretonneau pour leur gentillesse.

- Patrick VOURC’H pour nous avoir fait partager son expérience sur les études épigénétiques.

- Yves COURTY pour ses conseils avisés en biologie moléculaire, Pascale REVERDIAU et
Sophie IOCHMANN pour leur expérience sur les modèles animaux et la méthylation.

- Sophie HAMARD, Jérôme JAILLET, Christelle PARENT et Nathalie RICHE, pour leur
bonne humeur, leur gentillesse et leur aide technique et diverse…

Ainsi que toutes les personnes du bâtiment 47C et de l’équipe 3A que j’ai eu la chance
de côtoyer :

Sylvie ATTUCCI, Martine BERTON, Camille BIANCHI, Eric BOISSINOT, Michèle
BRILLARD, Jacques CHANDENIER, Sandrine DALLET-CHOISY, Elisabeth DIOT, Patrice
DIOT, Annick ESNARD, Frédéric ESNARD, Michèle FERRER, Francis GAUTHIER,
Daniel GRIMBERT, Yves GRUEL, Gilles LALMANACH, Valérie LEBLOND, Fabien
LECAILLE, Caroline MAJORAL, Sylvain MARCHAND-ADAM, Emmanuelle MERCIER,
Thierry MOREAU, Chantal VALAT, Marie-Louise ZANI.

Et particulièrement mes co-thésards et collègues ATER avec qui j’ai passé de très
bons moments au labo, au Ptit Bota’, au squash et ailleurs… !

Kévin BARANGER, Guillaume GAUD, Alexandre GAUTHIER, Florian VEILLARD et
aussi Mireille AINCIBURU, Benjamin BRILLET, Sandrine CASTELLA, Gwenhael JEGOT,
Timofey KALUPOV, Valentine PANEL, Hélène SERRANO. Ainsi que les nouveaux et les
anciens que j’oublie sûrement…

Pour finir un grand merci à mes parents, mes frères, mes grands-parents et toute ma
famille, mes amis et bien sûr Nico pour leur présence et leur soutien inconditionnel...

Merci à tous !

RÉSUMÉ


Le but de cette étude a été d’évaluer l’intérêt de l’aérosolthérapie d’anticorps
monoclonaux (AcM) dans le traitement du cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules
(CBNPC) à travers l’exemple du cetuximab, un AcM anti-EGFR. L’expression du récepteur
FcRn, élément essentiel dans la pharmacocinétique et la biodistribution des IgGs
thérapeutiques a également été étudiée dans le CBNPC.
Nos résultats démontrent que l’AcM peut résister aux contraintes physiques de la
nébulisation. Les données de biodistribution et pharmacocinétique, obtenues dans le modèle
animal mis en place, indiquent que suite à une administration pulmonaire, l’Ac s’accumule de
façon précoce et prolongée au niveau pulmonaire chez l’animal et qu’il passe lentement et
faiblement dans le compartiment sanguin. De plus, les tumeurs chez la souris paraissent
sensibles à l’aérosolthérapie avec du cetuximab.
L’analyse au niveau transcriptionnel et protéique du récepteur FcRn chez des patients
atteints d’un CBNPC a révélé que le récepteur est moins exprimé, au niveau transcriptionnel,
dans le tissu tumoral que dans le tissu sain adjacent à la tumeur. Cette altération de
l’expression pourrait être consécutive à l’hyperméthylation du promoteur de ce gène.

Mots-clés : cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules, aérosolthérapie, anticorps
thérapeutiques, récepteur FcRn.

ABSTRACT


The project aims at determining whether aerosoltherapy is well suited for monoclonal
antibodies (Mab), in Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC). In addition, exploration of the
expression of FcRn, an IgG receptor contributing to increased half-life and biodistribution of
Mab, has been studied in NSCLC.
Using cetuximab, an anti-EGFR Mab as a model, we showed that Mab resist the
physical constraints of nebulization. Biodistribution and pharmacokinetic analyses, using a
murine model that we established, revealed that cetuximab is highly and durably accumulated
within the lungs and is slowly and weakly released into the bloodstream following airways
delivery. Moreover, animal tumors seem sensitive to cetuximab aerosoltherapy. Altogether,
our findings highlight the interest of Mab aerosoltherapy for NSCLC treatment.
Expression analysis of FcRn at both the transcript and protein levels showed that the
receptor is downregulated in NSCLC. FcRn alteration of expression in the tumor might be
due to hypermethylation of the gene promoter as often found in cancer.

Keywords : non small cell lung cancer, aerosoltherapy, therapeutic antibody, FcRn receptor.

b
b

ABRÉVIATIONS


Ac : anticorps
ADN : acide désoxynucléique
ADNg : ADN génomique
AMM : autorisation de mise sur le marché
ARN : acide désoxyribonucléique
ARNm : ARN messager
ASC : aire sous la courbe
BSA : bovine serum albumin
2m : 2-microglobuline
CBNPC : cancer bronchique non à petites cellules
CBPC : cancer bronchique à petites cellules
CMH : complexe majeur d’histocompatibilité
CV : coefficient de variation
Ct : threshold cycle
DAB : diaminobenzydine
DAMM : diamètre aérodynamique médian en masse
dNTP : désoxyribonucléoside triphosphate
DPI : dry powder inhaler
EDTA : acide éthylène-diamine-tétraacétique
EGF : epidermal growth factor
EGFR : epidermal growth factor receptor
ELISA : enzyme linked immunosorbent assay
FcRn : neonatal Fc receptor
FITC : fluoresceine isothiocyanate
HRP : horseradish peroxydase
i.p. : intrapéritonéale
i.v. : intraveineuse
Ig : immunoglobuline

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