Étude des mécanismes d'action de bactériocines de la sous classe IIa, Study of the mechanisms of action of sub-class IIa bacteriocins

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Sous la direction de Anne-Marie Revol-Junelles, Catherine Cailliez-Grimal
Thèse soutenue le 09 décembre 2008: INPL
Le site d’action des bactériocines de la sous-classe IIa est la membrane cytoplasmique des bactéries à Gram positif. Le mécanisme d’action se décompose en trois étapes : (i) adsorption de la bactériocine sur la membrane ; (ii) structuration du peptide et insertion dans la bicouche lipidique ; (iii) formation de pores. La présence de pores provoque des fuites de composés vitaux aboutissant soit à un arrêt de la croissance soit à la mort de la bactérie. Le degré de pénétration de la mésentérocine 52A dans la membrane a été mesuré grâce à l’anisotropie de fluorescence de deux sondes, le TMA-DPH et le DPH, respectivement localisées à la surface et en profondeur de la bicouche lipidique. Des résultats différents ont été obtenus avec deux espèces bactériennes appartenant au genre Listeria. Dans un cas, le peptide s’insère partiellement dans la membrane et dans l’autre en profondeur. Ces résultats suggèrent que la mésentérocine 52A peut suivre deux mécanismes distincts aboutissant à une bactériostase. Pour mieux comprendre les interactions entre la bactériocine et la cellule cible, le degré de pénétration de la mésentérocine 52A dans la membrane de trois souches de Leuconostoc, la première sensible, la seconde naturellement insensible et la dernière rendue résistante, a été caractérisé. Il semblerait que le phénotype de résistance soit corrélé avec les propriétés physico-chimiques de l’enveloppe cellulaire. Afin de pouvoir généraliser les résultats observés avec la mésentérocine 52A, d’autres bactériocines de la sous-classe IIa, les carnobactériocines Cbn BM1 et Cbn B2, produites par la souche Carnobacterium maltaromaticum CP5, ont été étudiées. Dans un premier temps, ces bactériocines ont été produites et purifiées à partir d’une souche d’Escherichia coli recombinante. L’étape de production en fermenteur a été optimisée, des quantités de l’ordre de 300 mg de peptides ont été produites. Le mode d’action des carnobactériocines, seules ou en combinaison, a été déterminé vis-à-vis de cellules procaryotes ou eucaryotes. Les carnobactériocines Cbn BM1 et Cbn B2 ont un mode d’action synergique contre les bactéries sensibles et ne présentent pas de cytotoxicité vis-à-vis des cellules de la lignée Caco-2
-Listeria
-Mécanisme d’action
-Expression hétérologue
-Anisotropie de fluorescence
-Carnobactériocine B2
-Carnobactériocine BM1
-Mésentérocine 52A
-Peptides antibactériens
-Leuconostoc
The action site of sub-class IIa bacteriocins is the cytoplasmic membrane of Gram-positive bacteria. The current view of the mechanism of action is divided into three steps: (i) adsorption of bacteriocins on the membrane; (ii) apparition of the structures of peptide and integration into the lipid double layer (iii) formation of pores. The presence of pores leads to efflux of vital cell compounds. They cause growth stop or bacterial death. The degree of penetration of mesenterocin 52A into the membrane was measured by fluorescence anisotropy of two probes, TMA-DPH and the DPH, which target the surface or the depth of the membrane, respectively. Different results were obtained with two bacterial species of the genus Listeria. In the first hand, the peptide is partially inserted into the membrane and in the second hand in depth. These results suggest that mesenterocin 52A can exhibit two different mechanisms leading to the same antibacterial effect. To better understand the interactions between bacteriocins and the target cell, the degree of penetration of mesenterocin 52A into the membrane of three Leuconostoc strains, the first sensitive, the second naturally resistant and last induced resistant, was characterized. It seems that the resistance phenotype is correlated with physical and chemical properties of the cell envelope. To generalize the results observed with mesenterocin 52A, other bacteriocins of sub-class IIa, the carnobacteriocins Cbn BM1 and Cbn B2, produced by Carnobacterium maltaromaticum CP5 strain, were studied. These bacteriocins were produced in E. coli and subsequently purified. The optimization of the production process in a reactor led to purify up to 300 mg of peptides for 1.5 liter of culture. The mode of action of carnobacteriocins, alone or in combination, was determined with prokaryotic or eukaryotic cells as targets. The carnobacteriocins Cbn BM1 and Cbn B2 have a synergistic mode of action against sensitive bacteria and are not cytotoxic against Caco-2 cell line
-Listeria
-Mechanism of action.
-Heterologous expression
-Fluorescence anisotropy
-Antimicrobial peptides
-Mesenterocin 52A
-Carnobacteriocin BM1
-Carnobacteriocin B2
-Leuconostoc
Source: http://www.theses.fr/2008INPL100N/document

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NANCY-UNIVERSITE
INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE
Ecole Nationale Supérieure d’Agronomie et des Industries Alimentaires

Laboratoire de Science et Génie Alimentaires

THESE
Présentée à l’Institut National Polytechnique de Lorraine par

Jordane JASNIEWSKI

Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE
Spécialité : Procédés Biotechnologiques et Alimentaires


Etude des mécanismes d’action de bactériocines de la sous-classe IIa


Soutenue publiquement le 9 décembre 2008 devant la commission d’examen

Rapporteurs :
M. Frédéric Leroy, Professeur, Vrije Universiteit Brussel, Belgique
M. Hervé Prévost, Professeur, ENITIAA de Nantes, France

Examinateurs :
Mme Anne-Marie Revol-Junelles, Maître de conférences HDR (Directeur de thèse), ENSAIA, Nancy, France
Mme Catherine Cailliez-Grimal, Maître de conférences HDR (Co-directeur de thèse), ENSAIA, Nancy, France

Invité :
M. Eric Gelhaye, Maître de conférences HDR, UHP, Nancy, France
NANCY-UNIVERSITE
INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE
Ecole Nationale Supérieure d’Agronomie et des Industries Alimentaires

Laboratoire de Science et Génie Alimentaires

THESE
Présentée à l’Institut National Polytechnique de Lorraine par

Jordane JASNIEWSKI

Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE
Spécialité : Procédés Biotechnologiques et Alimentaires


Etude des mécanismes d’action de bactériocines de la sous-classe IIa


Soutenue publiquement le 9 décembre 2008 devant la commission d’examen

Rapporteurs :
M. Frédéric Leroy, Professeur, Vrije Universiteit Brussel, Belgique
M. Hervé Prévost, Professeur, ENITIAA de Nantes, France

Examinateurs :
Mme Anne-Marie Revol-Junelles, Maître de conférences HDR (Directeur de thèse), ENSAIA, Nancy, France
Mme Catherine Cailliez-Grimal, Maître de conférences HDR (Co-directeur de thèse), ENSAIA, Nancy, France

Invité :
M. Eric Gelhaye, Maître de conférences HDR, UHP, Nancy, France

Remerciements

Ce travail s’est déroulé au Laboratoire de Science et Génie Alimentaires de l’ENSAIA-INPL
de Nancy. Je remercie le Professeur Stéphane Désobry pour m’avoir accueilli au sein de son
laboratoire.

J’exprime toute ma reconnaissance à Madame Anne-Marie Revol-Junelles, Maître de
conférences HDR à l’ENSAIA et à Madame Catherine Cailliez-Grimal, Maître de HDR à l’IUT Nancy-Brabois pour avoir accepté de diriger ce travail. Je leur
exprime toute ma gratitude pour leur bonne humeur, leur patience, leur encadrement, leurs
conseils ainsi que pour avoir patiemment corrigé ce document et les articles.

Je remercie également Monsieur le Professeur Jean-Bernard Millère (IUT Nancy-Brabois)
pour ses conseils et ses corrections.

Mes remerciements s’adressent également à Monsieur Frédéric Leroy, Professeur au Research
Group of Industrial Microbiology and Food Biotechnology (IMDO), Vrije Universiteit
Brussel, Belgique et à Monsieur Hervé Prevost, Professeur à l’UMR-INRA 1014 SECALIM
ENITIAA de Nantes qui ont accepté de juger ce travail en qualité de rapporteurs.

Je remercie Monsieur Eric Gelhaye, Maître de conférences HDR à la Faculté des Sciences de
Nancy, Monsieur Mohamed Younsi, Docteur à la Faculté de Médecine de Nancy et Madame
Isabelle Chevalot, Maître de conférences à l’ENSAIA pour leur collaboration scientifique.

Je remercie la toute nouvelle recrue, Monsieur le Docteur Frédéric Borges, pour ses
corrections et surtout son amitié.

Je tiens à remercier l’ensemble du personnel de l’ENSAIA qui me connaît et particulièrement
llecelui du LSGA, et surtout Anne, M Turban, Delphine, Myriam, Cédric, Jean-Louis,
Stéphane, Emmanuel R. et Emmanuel G.

Un grand merci à tous mes compagnons de galère : Eric, Guillaume.
Inam et Thibaut, bon courage car la votre commence…

Je remercie Greg, Willy, Gogi, Mike, Bienbien, Christin, Charlie, Alain, Franck, FX et
Audrey pour leur amitié…

J’embrasse Noémie pour son amour et pour m’avoir supporté tout au long de ce travail. Je
remercie également toute sa famille, c’est un plaisir de partager ma vie avec vous, en
particulier Marie-Anne, Jean-Daniel, Mélanie et son « Roumain » Loïc, Emeline et son
pianiste Julien. Je remercie la famille Hasser dans son ensemble avec une petite dédicace au
père des naines…

Enfin, un grand merci à mes parents qui m’ont encouragé dans toutes mes entreprises et à
mon frère à qui je tiens à dédicacer ce travail…

A Cédric…














Table des matières
Table des matières

Liste des figures hors publications....................................................................................................................... 1
Liste des tableaux hors publications.................................................................................................................... 1
Liste des abréviations............................................................................................................................................ 2
Introduction........................................................................................................................................................... 5
Chapitre I : Synthèse bibliographique ................................................................................................................ 9
I. Les bactériocines des bactéries lactiques................................................................................... 9
I.1 Définition................................................................................................................................................... 9
I.2 Classification ............................................................................................................................................. 9
II. Organisation ............................................................................................................... 14
II.1 Eléments génétiques du locus................................................................................................................. 14
II.2 La production des bactériocines ............................................................................................................. 15
II.2.1 Sécrétion des bactériocines.............................................................................................................. 15
II.2.2 Régulation de l’expression................ 19
II.3 Immunité ................................................................................................................................................ 21
III. Les bactériocines de la sous-classe IIa........................................................................................................ 23
III.1 Structure................................................................................................................................................ 23
III.2 Rôle des différentes régions de la bactériocine ..................................................................................... 26
III.3 Spectre d’activité................................................................................................................................... 31
IV. Mode et mécanismes d’action..................................................................................................................... 35
IV.1 Quantification de l’activité antibactérienne .......................................................................................... 35
IV.1.1 Détermination du titre en bactériocine........................................................................................... 35
IV.1.2 Facteurs physico-chimiques influençant l’activité des bactériocines............................................. 36
IV.2 Mode d’action ....................................................................................................................................... 38
IV.3 Mécanisme d’action.............................................................................................................................. 39
IV.3.1 Adsorption et structuration de la bactériocine...... 39
IV.3.2 Insertion de la bactériocine et formation de pores dans la cellule cible......................................... 41
IV.3.3 Les conséquences de la présence de pores..................................................................................... 43
IV.3.4 Méthodes pour l’étude du mécanisme d’action..............................................................................44
V. La résistance aux bactériocines .................................................................................................................... 47
V.1 Les différents types de résistants............................................................................................................ 48
V.2 Les caractéristiques des résistants .......................................................................................................... 50
VI. La production et la purification des bactériocines ...................................................................................... 53
VI.1 Purification............................................................................................................................................ 53
VI.2 Améliorations de la production............................................................................................................. 55
Chapitre II : Résultats ........................................................................................................................................ 61
I. Analyse du mécanisme d’action de la mésentérocine 52A par anisotropie de fluorescence ......................... 61
I.1 Introduction.............................................................................................................................................. 61
I.2 “Fluorescence anisotropy analysis of the mechanism of action of mesenterocin 52A: speculations on
antimicrobial mechanism” ............................................................................................................................ 62
I.3 Contribution de l’article........................................................................................................................... 72
II. Différences fonctionnelles entre des souches de Leuconostoc sp. sensibles ou résistantes à la mésentérocine
52A, une bactériocine de la sous-classe IIa....................................................................................................... 74
I.1 Intr............................... 74
II.2 “Functional differences in Leuconostoc sensitive and resistant strains to mesenterocin 52A, a class IIa
bacteriocin” ................................................................................................................................................... 75
II.3 Contribution de l’article ......................................................................................................................... 85
III. Optimisation des procédés de production et de purification des carnobactériocines Cbn BM1 et Cbn B2 de
Carnobacterium maltaromaticum CP5 produites par expression hétérologue chez Escherichia coli .............. 88
III.1 Introduction........................................................................................................................................... 88
III.2 “Optimization of the production and purification processes of carnobacteriocins Cbn BM1 and Cbn B2
from Carnobacterium maltaromaticum CP5 by heterologous expression in Escherichia coli” ................... 88
Table des matières

III.3 Contribution de l’article ........................................................................................................................ 97
IV. Interactions entre les deux carnobactériocines Cbn BM1 et Cbn B2 de Carnobacterium maltaromaticum
CP5 sur des bactéries et des cellules Caco-2 cibles .......................................................................................... 99
IV.1 Introduction........................................................................................................................................... 99
IV.2 “Interactions between two carnobacteriocins Cbn BM1 and Cbn B2 from Carnobacterium
maltaromaticum CP5 on target bacteria and Caco-2 cells”........................................................................... 99
IV.3 Contribution de l’article...................................................................................................................... 105
Chapitre III : Conclusion générale et perspectives ........................................................................................ 107
Références bibliographiques ............................................................................................................................ 115


Liste des figures et des tableaux hors publications
Liste des figures hors publications
Figure 1 : structure de la nisine A. ........................................................................................................................ 10
Figure 2 : structure (A) : de la mesarcidine produite par Bacillus subtilis (Hsu et al., 2003) ; (B) : de la mutacine
II produite par Streptococcus mutans (Krull et al., 2000) ; (C) : structures des résidus d’acides aminés
inhabituels..................................................................................................................................................... 10
Figure 3 : organisation générale des opérons producteurs de bactériocines.......................................................... 15 4 : systèmes de transport et de maturation des prébactériocines de bactéries lactiques............................. 17
Figure 5 : schéma simplifié du système général de sécrétion Sec......................................................................... 18
Figure 6 : exemple de « quorum-sensing » chez Carnobacterium maltaromaticum............................................. 19
Figure 7 : séquence et structure tridimensionnelle de la carnobactériocine B2 (Cbn B2) et de sa protéine
d’immunité (ImB2). ...................................................................................................................................... 21
Figure 8 : modélisation moléculaire de l’interaction ionique entre la carnobactériocine Cbn B2 et la protéine
d’immunité ImB2.......................................................................................................................................... 22
Figure 9 : simulations moléculaires dynamiques de la carnobactériocine Cbn B2 et de sa protéine d’immunité
ImB2 dans un environnement mimant la membrane cytoplasmique............................................................. 22
Figure 10 : alignement de séquences de différentes bactériocines de la sous-classe IIa ....................................... 24
Figure 11: superposition de la structure en hélice α de la leucocine A................................................................. 25
Figure 12 : superposition du tryptophane 18 et de la phénylalanine 22 de la carnobactériocine Cbn B2 (rouge) et
de la leucocine A (jaune)............................................................................................................................... 25
Figure 13 : modèles des mécanismes d’action des bactériocines.......................................................................... 42

Liste des tableaux hors publications
Tableau 1 : les bactériocines produites par le genre Carnobacterium................................................................... 12
Tableau 2 : les nes r le Leuconostoc......................................................................... 13
Tableau 3 : exemples de localisation des gènes producteurs de bactériocines...................................................... 14
Tableau 4 : activités antibactériennes de la mésentérocine 52A (Mes 52A)......................................................... 33
Tableau 5 : activités antibactérdes carnobactériocines BM1 (Cbn BM1) et B2 (Cbn B2)......................... 34
Tableau 6 : effets de composés chimiques sur l’activité des bactériocines........................................................... 37
Tableau 7 : conséquences cellulaires dues à l’action de peptides antibactériens .................................................. 45

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