Etude par microscopie électronique des mécanismes d'action de vecteurs synthétiques pour le transfert de gènes

De
Publié par

Sous la direction de Olivier Lambert
Thèse soutenue le 16 décembre 2009: Bordeaux 1
La grande majorité des essais cliniques de transfert de gènes in vivo utilise des vecteurs viraux. Si ces derniers sont efficaces, ils présentent des risques immunogènes, toxiques, voire mutagènes avérés. Les vecteurs synthétiques (non viraux), par leur grande modularité et leur faible toxicité représentent une alternative très prometteuse. Le principal frein à leur utilisation est leur manque d’efficacité. L’objectif majeur de ce travail de thèse a été de comprendre le mécanisme de transfert de gènes associé à différents complexes vecteurs synthétiques/ADN plasmidique, ce qui est indispensable pour une conception rationnelle de nouveaux vecteurs. Nous avons étudié, sur cellules en culture, le mécanisme de transfert de gènes associé à deux lipides cationiques ; le BGTC (bis(guanidinium)-tren-cholesterol) et la DOSP (DiOleylamine A-Succinyl-Paromomycine) qui sont connus pour être des vecteurs efficaces in vitro. Nous avons ainsi pu visualiser par microscopie électronique leurs voies d’entrée, leurs remaniements structuraux ainsi que leur échappement endosomal qui représente une étape clé du processus de transfert de gènes. L’identification non ambigüe des lipoplexes tout au long de leur trafic intracellulaire a été rendue possible grâce au marquage de l’ADN par des nanoparticules de silice dotées d’un cœur de maghémite (Fe2O3) dense aux électrons. Cette stratégie de marquage a également été appliquée à l’étude du mécanisme d’action d’un autre vecteur synthétique de type polymère, le copolymère à blocs non ionique P188 ou Lutrol. Contrairement à la plupart des vecteurs synthétiques, celui-ci présente une efficacité de transfection in vivo chez la souris par injection in situ pour le tissu musculaire ou en intra trachéale dans le poumon. En revanche, il est totalement inefficace in vitro. Nous avons montré que le Lutrol permet une augmentation de l’internalisation d’ADN par les cellules mais n’induit pas son échappement endosomal, ce qui expliquerait son absence d’efficacité in vitro. D’autres voies d’entrée sont alors à envisager in vivo pour comprendre son mécanisme d’action.
-Microscopie électronique
-Cryo-microscopie électronique
-Nanoparticules
-Vecteurs synthétiques
-Transfert de gènes
-Lipides cationiques
-Tomographie
-Copolymères à blocs
The vast majority of clinical trials of gene transfer in vivo use viral vectors. Although they are effective, they induce immunogenic, toxic or mutagenic risks. Due to their high modularity and low toxicity, synthetic vectors (non viral), represent a promising alternative despite their lack of effectiveness. The major objective of this work was to understand the mechanism of gene transfer using two prototypic synthetic vectors, in the context of a rational design of new vectors. We studied on cultured cells, the mechanism of action of two cationic lipids; BGTC (bis(guanidinium)-tren-cholesterol) and DOSP (DiOleylamine A-Succinyl-Paromomycine) formulated with plasmid DNA (lipoplexes) which are in vitro efficient vectors. We have been able to visualize by electron microscopy, their intracellular pathways, their structural alterations and their endosomal escape, the latter being a key step in the process of gene transfer. The unambiguous identification of lipoplexes throughout their intracellular trafficking has been made possible thanks to the labelling of DNA by core-shell silica nanoparticles with an electron dense maghemite core (Fe2O3). The labeling strategy has also been applied to study the mechanism of action of a nonionic block copolymer (P188 or Lutrol). Interestingly, these synthetic vectors have an in vivo transfection efficiency in mice lung and muscle tissue while they are totally inefficient in vitro. We have shown that Lutrol induces an increase of DNA internalization into cells and fails to trigger endosomal escape, which would explain the lack of in vitro efficacy. These findings suggest that the in vivo mechanism of action of Lutrol would involve other internalization pathways.
-Electron microscopy
-Cryo-electron microscopy
-Nanoparticles
-Synthetic vectors
-Gene transfer
-Cationic lipids
-Tomography
-Block copolymers
Source: http://www.theses.fr/2009BOR13972/document
Publié le : jeudi 27 octobre 2011
Lecture(s) : 107
Nombre de pages : 265
Voir plus Voir moins

N° d’ordre : 3972



THESE

PRESENTEE A

L’UNIVERSITE BORDEAUX 1

ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE


Par Olivier LE BIHAN


POUR OBTENIR LE GRADE DE

DOCTEUR
SPECIALITE : BIOCHIMIE



Etude par microscopie électronique des mécanismes d'action
de vecteurs synthétiques pour le transfert de gènes


Thèse dirigée par Olivier LAMBERT

Soutenue le 16 décembre 2009



Devant la commission d’examen formée de :


M. Patrick MIDOUX, Directeur de recherche INSERM Rapporteur
M. Patrick SCHULTZ, Directeur de recherche CNRS Rapporteur
M. Philippe BARTHELEMY, Professeur Université Bordeaux 2 Examinateur
M. Gilles CHARPENTIER, Professeur Université Bordeaux 1 Examinateur
M. Bruno PITARD, Directeur de recherche CNRS Examinateur
M. Olivier LAMBERT, Directeur de recherche CNRS Directeur de thèse

Résumé
La grande majorité des essais cliniques de transfert de gènes in vivo utilise des vecteurs
viraux. Si ces derniers sont efficaces, ils présentent des risques immunogènes, toxiques, voire
mutagènes avérés. Les vecteurs synthétiques (non viraux), par leur grande modularité et leur
faible toxicité représentent une alternative très prometteuse. Le principal frein à leur
utilisation est leur manque d’efficacité. L’objectif majeur de ce travail de thèse a été de
comprendre le mécanisme de transfert de gènes associé à différents complexes vecteurs
synthétiques/ADN plasmidique, ce qui est indispensable pour une conception rationnelle de
nouveaux vecteurs. Nous avons étudié, sur cellules en culture, le mécanisme de transfert de
gènes associé à deux lipides cationiques ; le BGTC (bis(guanidinium)-tren-cholesterol) et la
DOSP (DiOleylamine A-Succinyl-Paromomycine) qui sont connus pour être des vecteurs
efficaces in vitro. Nous avons ainsi pu visualiser par microscopie électronique leurs voies
d’entrée, leurs remaniements structuraux ainsi que leur échappement endosomal qui
représente une étape clé du processus de transfert de gènes. L’identification non ambigüe des
lipoplexes tout au long de leur trafic intracellulaire a été rendue possible grâce au marquage
de l’ADN par des nanoparticules de silice dotées d’un cœur de maghémite (Fe O ) dense aux 2 3
électrons. Cette stratégie de marquage a également été appliquée à l’étude du mécanisme
d’action d’un autre vecteur synthétique de type polymère, le copolymère à blocs non ionique
P188 ou Lutrol. Contrairement à la plupart des vecteurs synthétiques, celui-ci présente une
efficacité de transfection in vivo chez la souris par injection in situ pour le tissu musculaire ou
en intra trachéale dans le poumon. En revanche, il est totalement inefficace in vitro. Nous
avons montré que le Lutrol permet une augmentation de l’internalisation d’ADN par les
cellules mais n’induit pas son échappement endosomal, ce qui expliquerait son absence
d’efficacité in vitro. D’autres voies d’entrée sont alors à envisager in vivo pour comprendre
son mécanisme d’action.

Abstract
The vast majority of clinical trials of gene transfer in vivo use viral vectors. Although they are
effective, they induce immunogenic, toxic or mutagenic risks. Due to their high modularity
and low toxicity, synthetic vectors (non viral), represent a promising alternative despite their
lack of effectiveness. The major objective of this work was to understand the mechanism of
gene transfer using two prototypic synthetic vectors, in the context of a rational design of new
vectors. We studied on cultured cells, the mechanism of action of two cationic lipids; BGTC
(bis(guanidinium)-tren-cholesterol) and DOSP (DiOleylamine A-Succinyl-Paromomycine)
formulated with plasmid DNA (lipoplexes) which are in vitro efficient vectors. We have been
able to visualize by electron microscopy, their intracellular pathways, their structural
alterations and their endosomal escape, the latter being a key step in the process of gene
transfer. The unambiguous identification of lipoplexes throughout their intracellular
trafficking has been made possible thanks to the labelling of DNA by core-shell silica
nanoparticles with an electron dense maghemite core (Fe2O3). The labeling strategy has also
been applied to study the mechanism of action of a nonionic block copolymer (P188 or
Lutrol). Interestingly, these synthetic vectors have an in vivo transfection efficiency in mice
lung and muscle tissue while they are totally inefficient in vitro. We have shown that Lutrol
induces an increase of DNA internalization into cells and fails to trigger endosomal escape,
which would explain the lack of in vitro efficacy. These findings suggest that the in vivo
mechanism of action of Lutrol would involve other internalization pathways. Remerciements

Ce travail a été réalisé au sein de l’équipe d’Architecture des Complexes
Membranaires et Processus Cellulaires du laboratoire de Chimie et Biologie des Membranes
et Nano-objets (CBMN), sous la direction du docteur Olivier LAMBERT à qui j’exprime ma
plus profonde gratitude pour m’avoir choisi pour mener à bien cette thèse alors que je n’avais
aucune expérience de la microscopie électronique. Merci de m’avoir fait découvrir cet univers
passionnant dans lequel j’espère pouvoir continuer à évoluer dans les années futures.
J’adresse mes plus sincères remerciements aux membres du jury pour avoir accepté
d’évaluer ma thèse ; messieurs Patrick MIDOUX et Patrick SCHULTZ rapporteurs de ma
thèse et messieurs Bruno PITARD, Philippe BARTHELEMY et Gilles CHARPENTIER
examinateurs de ma thèse.
Je remercie le Professeur Alain BRISSON, directeur de l’unité d’Imagerie Moléculaire
et NanoBioTechnologie au sein duquel j’ai débuté ma thèse. Je remercie également Erick
DUFOURC, directeur du laboratoire CBMN.
Je remercie tout particulièrement les membres actuels ou antérieurs de notre équipe
qui de part la diversité de leurs compétences m’ont été d’une aide précieuse durant toute ma
thèse. Merci à Sylvain TREPOUT qui m’a formé à la Cryo-Microscopie Electronique, dans la
bonne humeur et avec tout le dynamisme qui le caractérise. Merci à Pierre BONNAFOUS
pour son implication à des degrés divers dans ce travail. Je remercie également le professeur
Jean-Christophe TAVEAU pour ses compétences en analyse d’image qui m’ont été d’une très
grande aide lors de la reconstruction des volumes tomographiques et de leurs post-traitements.
Je n’oublie pas les stagiaires et les non-permanents qui ont participé à ce travail ; Sarah
AVENTIN, Anaïs CARPENTIER et Ptissam BERGAM.
Je tiens également à remercier les autres membres du laboratoire CBMN qui m’ont
permis de travailler dans un excellent climat. Merci à Céline GOUNOU, Joséphine LAI KEE
HIM, Boris GARNIER pour les résultats préliminaires qu’il a obtenu durant son stage de
Master 2 et qui ont servis de base à mon travail, Sisareuth TAN qui m’a initié aux techniques
d’inclusion et d’ultramicrotomie. Merci à Anthony BOUTER qui m’a été d’une grande aide
en culture cellulaire et en microscopie de fluorescence. Un grand merci à Nicolas ARRAUD, Rémi BERAT et Benoit FAURIE pour les discussions scientifiques ou non, toujours très
enrichissantes.
J’adresse également mes remerciements aux collaborateurs qui ont participé
activement au bon déroulement de ce projet. Je remercie en particulier Bruno PITARD et les
membres de son équipe « Nanovecteurs pour le transport de macromolécules biologiques » de
l’institut du thorax à Nantes qui nous a fourni les plasmides, vecteurs synthétiques et avec qui
nous avons établi une collaboration étroite sur cette thématique de l’étude des mécanismes de
transfert de gènes par les vecteurs synthétiques. Je remercie particulièrement Raphaël
CHEVRE avec qui j’ai beaucoup interagit de part la proximité de nos sujets de thèse
respectifs. Un grand merci à Etienne GONTIER, responsable de la plateforme de microscopie
électronique BIC (Bordeaux Imaging Center) à l’université Bordeaux 2, et à son expérience
des cryométhodes qui nous a permis de réaliser la congélation haute pression des échantillons
cellulaires ainsi que leur cryosubstitution. Je souhaiterais également remercier Stéphane
MORNET, chercheur à l’Institut de Chimie et Matière Condensée de Bordeaux (ICMCB) qui
a synthétisé les nanoparticules de silice nues ou modifiées en surface que j’ai utilisé durant
cette thèse.
Pour finir, je remercie vivement l’association Vaincre La Mucoviscidose (VLM) qui a
financé mes travaux de thèse durant ces trois années et m’a permis de présenter mes résultats
lors des colloques jeunes chercheurs nationaux organisés à Paris ou européens organisés à
Lille. Sommaire

INTRODUCTION GENERALE ...................................................... ............ 4
I LES NANOPARTICULES ................................................................... ............... 6
I.1 Nanotechnologies et Nanoparticules : Définitiso n............................................. .............. 6
I.2 Caractéristiques physico-chimiques des nanopiacurtles ......................................... ............. 7
I.2.1 Propriétés générales ...................................................................................................................... 7
I.2.2 Stabilité colloïdale .............................................................................................................................................. 8
I.3 Applications des Nanoparticules en biolog.ie. ........................................................................ ................ 10
I.3.1 Les interactions nanoparticules/biomolécule s.................................................................................... ... 10
I.3.2 Les nanoparticules en biodétection et/ou pou rle diagnostic. ................................................................ .. 11
I.3.3 Les nanoparticules comme des systèmes de vecotrisation ..................................................................... .. 12
I.3.4 Les nanoparticules pour la bioimagerie ......................................................................................... .1..3. ....
I.3.4.1P articules magnétiques pour l’IRM ......................................................................................... .1..4
I.3.4.2N anoparticules luminescentes pour l’imagerie optique ................................................................... 14
I.3.4. 3Particules d’or pour la microscopie électronique .................................................................................... . 15
I.3.4.4N anoparticules de silice dopées avec une sonde fluorescente .................................................................. 15
II LES MEMBRANES BIOLOGIQUE S............................................................. ....... .1.6.....
II.1 Rôles et organisation ...............................................................1.7.. ....................
II.2 Composition ......................................................................... ..1 8...................
II.2.1 Les phosphoglycérides ................................................................................................................ 1 9
II.2.2 Les sphingolipides ...................................................................................................................... 2 1
II.2.3 Le cholesterol .................................................................................................................................................. 2 1
II.3 Propriétés agrégatives des lipides ........................................................................................ ................. 21
II.4 Polymorphisme lipidique .............................................................. ................... 22
II.4.1 Les différentes phases lipidiques ................................................................................................. .2..2
II.4.2 Le concept de forme ................................................................................................................ 2 3
II.5 Fluidité membranaire ................................................................. .................... 25
II.6 Les liposomes comme membranes modèles. ............................................. ............ 27
II.7 Les membranes biologiques ; des barrièrecst isvéelse ............................................................. .............. 29
II.7.1 Transport d’ions et de petites molécules. ................................................................................................2..9. ....
II.7.2 Transport de grosses molécules ................................................................................................ .3..0. .
II.7.2P.1h agocytose........................................................................................................................... .. 31
II.7.2.L2a macropinocytose ............................................................................................................... 32
II.7.2.L3 a micropinocytose ................................................................................................................ 32
III LE TRANSFERT DE GÈNES DANS LES CELLU L.E.S................................................. .3 .5......................
III.1 Définitions ............................................................................ ..3.5...............
III.2 La diversité des acides nucléiques utuilre sd epso approches thérapeutiques ............................... ..... 36
III.3 Les voies d’administration et méthodeas ndsfe rtr........................................... ........... 37
III.4 Les vecteurs viraux .............................................................. ..3. 9....................
III.5 Les méthodes physico-chimiques ou veycntehuért iqsues ..................................... ......... 41
III.5.1 Les lipides cationiques .......................................................................................................... 4 1
III.5.1.1 Structure générale ..................................................................................................... .4. 1
III.5.1. 2 L es lipides monocationiques .................................................................................................. .. 42
III.5.1.3 Les lipides polycationiques .............................................................................................................. .4...4 ..
III.5.1. 2 C aractéristiques des lipoplexes ......................................................................................................... .. 48
III.5.2 Les polymères cationiques ................................................................................................... .5 2
III.5.2.1 Le polyéthylène-imine (PEI) ........................................................................................ .5..2. ...
III.5.2. 2 L a polylysine (PLL) ............................................................................................................. ... 53
III.5.2. 3 L e s dendrimères .................................................................................................................. ... 54
III.5.2. 4 L e s chitosans ...................................................................................................................... ... 55
III.5.3 L es copolymères à blocs ........................................................................................................... ... 56
III.5.3. 1 S tructure et caractéristiques physico-chimiques ............................................................................... 56
III.5.3.2 Activités biologiques ........................................................................................................ .5.. 8
III.5.3.3 Utilisation des copolymères à blocs pleo utra nsfert de gènes ........................................................ . 59
III.6 Les méthodes physiques ............................................................. ................... 61
III.7 Les grandes étapes du transfert de gènrersiè r:e sb aà franchir ................................ ......... 61
III.7.1 Barrières extracellulairesi n vivo .................................................................................................... 62
III.7.2 Barrières cellulaires ................................................................................................................. 6 2
1
III.7.2.1 L’interaction avec les membranes cellurlaesi ............................................................................... .. 62
III.7.2.2 L’entrée dans la cellule .................................................................................................... .6.. 3
III.7.2.3 Le trafic intracellulaire .................................................................................................... .6 3
III.7.1.4 Apport de la microscopie électroniqu.e. .................................................................................. ... 66
III.8 Les essais cliniques .......................................................................................................... ..6 .8...................

CHAPITRE I: E TUDE DES INTERACTIONS DE NANOPARTICULES DE SILAICVE C LES MEMBRANES
BIOLOGIQUES. ANALYSE DE LEUR MODE DE FRANCHISSEM EDNETS MEMBRANES ............. .......... 71
I INTRODUCTION ....................................................................... ................. 72
II INTERNALISATION DES NANOPARTICULES DE SILICE DANSS LLEIPOSOMES .............................................. ........... .75........
II.1 Internalisation des nanoparticules ...................................................... ................. 75
II.2 Etude du mécanisme d’internalisation des uN psse ina de LUVs par cryo-tomographie électroniq u7e7. .
II.3 Etude de l’influence de la taille des NlePusr sinutrernalisation ................................ ........... 79
III INTERNALISATION DES NANOPARTICULES DE SILICE DANS LCEELLULES .................................... ....... .81......
III.1 Incubation des cellules avec les NPs .à. .3..7°.C ............................................ ............... 81
III.2 Incubation des cellules avec les Nps. .à. .4.°.C. ............................................ ............... 83
III.3 Analyse tomographique du processus d’inlitseartnioan des Nps .............................................. .......... 85
III.4 Devenir des Nps après leur internalisa.t.i.o.n. ............................................. ............... 87
IV CONCLUSION ET PERSPECTIVE S............................................................. ....... .9.0.....

PARTIE EXPÉRIMENTALE DU CHAPITRE I ........................................... ....... .9.3....
I P RÉPARATION DES LIPOSOMESL UVS ........................................................................................... ....... .9.3............
II P RÉPARATION DES NANOPARTICULES DE SILICE NUES ET MIFOIÉDES EDPS, ET FLUORESCENTE.S .................... ................. 94
III INCUBATION DES LIPOSOMES AVEC LENSP S. .................................................. .9 .5......................
IV INCUBATION DES CELLULES AVEC LENSP S. ..................................................... .9.5...................
V LA MICROSCOPIE ÉLECTRONIQU E............................................................ ...... .9.6.......
V.1 Historique ........................................................................... . .96..................
V.2 Fonctionnement général................................................................ .................. 98
V.3 Interactions électrons/matière ............................................................................................ ................. 99
V.4 Formation de l’image ........................................................................................................ ................. 101
VI PRÉPARATION D’ÉCHANTILLONS POUR LA MICROSCOPIE ÉLECTRONIQU .E.................................. .... .1.02.........
VI.1 Préparation et observation d’échantillons cmesi n............................................ ......... 102
VI.1.1 Coloration négative .................................................................................................................. 102
VI.1.2 Cryo-microscopie électronique de films mincse vitrifiés ...................................................................... 103
VI.1.2.1 Principe ......................................................................................................................... 103
VI.1.2.2 Protocole expérimental...................................................................................................................0.4.. .. 1
VI.2 Préparation et observation d’échantillonsi sé p(acellules) ...................................................... .......... 105
VI.2.1 Préparation des cellules par inclusion clsaisque.................................................................................. . 106
VI.2.1.1 Inclusion ..................................................................................................................... 106
VI.2.1.2 Microtomie.................................................................................................................... .1..06
VI.2.1.2 Contraste des coupes ..................................................................................................... .1..0.7.. ..
VI.2.2 Préparation des cellules par cryosubstituotni ................................................................................... . 107
VI.2.2.1 principe ....................................................................................................................... 107
VI.2.2.2 Protocole expérimental ................................................................................................................1.0.8... ..
VI.2.2 CEMOVIS...................................................................................................................................................... 10 9
VII TOMOGRAPHIE ÉLECTRONIQUE ............................................................ .... .1.10.........
VII.1 Principe ........................................................................... ..11 .0.................
VII.2 Protocole expérimental ............................................................... ................. 111
VII.2.1 Collecte des tomogrammes ...................................................................................................... .1..1..1. .
VII.2.2 Analyse et traitement des tomogrammes .......................................................................................... . 111
VIII MICROSCOPIE DE FLUORESCENC E............................................................................................. ... .1.12.............



2
CHAPITRE II :E TUDE DES MÉCANISMES D’ACTION DE VECTEURS SYNTHÉUTEIQS POUR LE
TRANSFERT DE GÈNE ........................................................... ........... 113
I INTRODUCTION ....................................................................................................................... ................... 114
II CARACTÉRISATION DE ’LINTERACTION ENTREN PS ETA DNP EN VUE DU MARQUAGE D’EA DLNP .................... .............. 117
II.1 Caractérisation physicochimique ......................................................... ............... 117
II.2 Visualisation par cryo-MET des complexes ANDpNsp.- ......................................... ....... 120
III ETUDE DES MÉCANISMES DE TRANSFERT DE GÈNE ASSOCIÉX ALIUPOPLEXES ................................. .. .1.22.............
III.1 Marquage des lipoplexes ............................................................ ................. 122
III-2 Mesure de l’expression du transgène ena nutt ildises lipoplexes marqués et non-marqués ....... .1 2.4
III.3 Trafic intracellulaire des lipoplexes à dbe aBsGeTC/DOPE ....................................................... ........ 124
III.3.1 Les lipoplexes ayant conservé leur structe unrative .................................................................................... . 125
III.3.2 Les lipoplexes ayant subi des modificatsi omnorphologiques significatives. ............................................. 127
III.3.3 Formation de nouvelles structures multileallmaires ............................................................................ . 129
III.4 Trafic intracellulaire des lipoplexes à dbea sDOe SP/DOPE ...................................... ........ 131
III.4.1 Les lipoplexes ayant conservé leur strurcet unative ............................................................................ . 131
III.4.2 Les lipoplexes ayant subit des changemen tsmorphologiques ............................................................... 132
III.5 Bilan .............................................................................. ..13.5..............
®
IV ETUDE DU MÉCANISME DE TRANSFERT DE GÈNE ASSOCIÉ OAPUO LCYMÈRE F68 OUL UTROL ..................... ................ 136
IV.1 Effet d’une préincubation des cellules pLaurt rloel sur l’efficacité de transfection par pleosp lelixes à
base de DOSP-DOPE. ....................................................................... .................. 138
IV.1.1 Influence du Lutrol sur l’expression du trsagènne ............................................................................... . 138
IV.1.2 Observation de l’internalisation des lipoplexes .................................................................................. . 139
IV.1.3 Quantification de l’internalisation des lipoplexes marqués ................................................................... 141
IV.2 Analyse de l’effet du Lutrol dans le fraenmcheisnst de la barrière endosomale .................. .. 145
IV.2.1 Caractérisation morphologique des complexes ADN/Np et ADN/Np/Lutrol............................................... 1 45
IV.2.2 Trafic intracellulaire des complexes ADN/Np et ADN/Np/Lutrol ................................................................. 146
IV.2.2.1 Localisation cellulaire des complexes ADN/ Np à des temps courts d’incubation ........................... 14 7
IV.2.2.2 Localisation cellulaire des complexes ADN/ Np/lutrol à des temps courts d’incubation .................. 14 8
IV.2.2.3 Ultrastructure des vésicules contenant sle Nps .......................................................................... 150
IV.2.2.4 Influence de la concentration de Lutroulr sle trafic intracellulaire des complexes ADN/Np/L utrol... 153
IV.2.2.5 Localisation cellulaire des complexes ADN/ Np/Lutrol à des temps longs d’incubation ................... 15 5
IV.3 Bilan .................................................................................................................................. . .15.6...............
V C ONCLUSION / DISCUSSION ............................................................................................... ............... .1.57.

PARTIE EXPÉRIMENTALE DU CHAPITRE II ........................................... ...... .1.64.....
I PRÉPARATION DES FORMULATIONS DE VECTEURS SYNTHÉTIQSU/AEDN ..................................... ....... .1.64
I.1 Plasmide ........................................................................... ..16. 4..................
I.2 Vecteurs synthétiques ......................................................................................................... .................. 164
I.3 Préparation des formulations de lipoplexesq umésa.r............................................................ ............. 165
I.4 Préparation des formulations de polyplexes q umésa r.......................................... ......... 166
II C ULTURE CELLULAIRE ET TRANSFECTIO N....................................................... .1.66..................
III D OSAGE DE ’LACTIVITÉ DU GÈNE RAPPORTEU(RL UCIFÉRASE) .......................................... ........... 167

CONCLUSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES .............................................................. ......... .1.68........
BIBLIOGRAPHIE ................................................................ ............. 170
ANNEXES .................................................................... ............... 188



3
INTRODUCTION GENERALE

Mon travail de thèse s’inscrit dans le domaine très compétitif des vecteurs
synthétiques de transfert de gène. Mon projet vise à étudier les mécanismes d’action par
lesquels les lipides cationiques et les copolymères à blocs (poloxamère) permettent de délivrer
des plasmides in vitro et iinn vviivvoo pour ddee ffuuttuurreess aapppplliiccaattiioonnss cclliinniiqquueess ((ddéélliivvrraannccee ddaannss le
muscle ou l’épithélium pulmonaire).
Nous proposons d’analyser ces mécanismes à l’échelle du nanomètre, par microscopie
éééllleeeccctttrrrooonnniiiqqquuueee aaafffiiinnn ddd’’’aaappppppooorrrttteeerrr dddeeesss iiinnnfffooorrrmmmaaatttiiiooonnnsss ssstttrrruuuccctttuuurrraaallleeesss aaauuu cccooouuurrrsss dddeeesss dddiiiffffffééérrreeennnttteeesss ééétttaaapppeeesss ddduuu
transfert de gènes, de l’interaction avec la membrane plasmique jusqu’à la sortie de
l’endosome et l’entrée dans le noyau.

Figure 1. Analyse des mécanismes d’action des vecteurs synthétiques à l’echelle du
nanomètre en utilisant des nanoparticules comme marqueurs pour l’imagerie afin de
sssuuuiiivvvrrreee llleee dddeeevvveeennniiirrr dddeeesss vvveeecccttteeeuuurrrsss dddaaannnsss lllaaa ccceeelllllluuullleee (((111)))... EEEnnn cccooommmppplllééémmmeeennnttt,,, uuunnneee ééétttuuudddeee dddeeesss
interactions de ces particules "seules" avec les membranes biologiques a été réalisée (2).

4
Le facteur limitant est la détection de ces vecteurs à l’intérieur de la cellule, car il
devient difficile de les identifier avec précision sans les confondre avec des éléments
cellulaires. Nous proposons d’insérer des nanoparticules inorganiques cœur-écorce à
l’intérieur des vecteurs synthétiques. En effet, elles présentent une surface aminée pour la
fixation de l’ADN alors que leur cœur peut contenir des marqueurs détectables par la
microscopie électronique, mais également par autres techniques d’imagerie (microscopie de
fluorescence et imagerie IRM).

Ce manuscrit est articulé autour de trois chapitres. Le premier chapitre est dédié à une
étude bibliographique centrée sur le transfert de gène, intégrant divers aspects fondamentaux
et appliqués à propos des systèmes de vectorisation ainsi que de leurs modes d’action. Le
développement des nanoparticules et leur impact en bio-santé sont évoqués dans ce chapitre.
Le chapitre II présente une analyse par cryo-TEM et TEM sur coupes cellulaires de
l’internalisation de nanoparticules de silice dans des liposomes et dans des cellules. Cette
étude nous éclaire sur les capacités de nanoparticules à traverser les membranes lipidiques et
nous renseigne sur leur devenir intracellulaire.
Le chapitre III présente une caractérisation approfondie du trafic intracellulaire des
vecteurs synthétiques, deux lipides cationiques BGTC et DOSP et le copolymère à blocs
Lutrol. L’utilisation de nanoparticules comme outils d’imagerie des vecteurs synthétiques
associée à la microscopie électronique apporte des informations qualitatives et quantitatives
concernant les mecanismes de franchissement des barrières membranaires et notamment au
cours de l’échappement endosomal.








5
I Les nanoparticules

I.1 Nanotechnologies et Nanoparticules : Définitions

L’échelle nanométrique est souvent considérée comme égale ou inférieure à 100 nm,
même si ce seuil n’a aucune justification scientifique et est loin d’être communément admis.
Dans la nature, il existe beaucoup d’exemples de structures existantes à l’échelle
nanométrique, parmi elles les composants de base du corps humain, telles que les protéines ou
les lipides.
Les nanotechnologies consistent à la conception, à la production et à l’exploitation de
structures, outils et systèmes de taille nanométrique. Les nanotechnologies ne sont pas
totalement nouvelles puisque les chimistes ont depuis longtemps synthétisé des polymères qui
sont de très grosses molécules constituées de sous unités monomériques de taille
nanométrique. Toutefois, les avancées récentes dans le domaine des outils qui permettent de
détecter et examiner les atomes et les molécules avec grande précision ont permis l’expansion
et le développement des nanotechnologies. Ceci a ouvert la porte à une nouvelle science, la
nanoscience définie comme l’étude de phénomènes et la manipulation de matériaux à
l’échelle atomique, moléculaire ou macromoléculaire.
Par consensus, les nanomatériaux sont des matériaux possédant au moins une
dimension et/ou une structure interne de taille nanométrique. Parmi les nanomatériaux, on
retrouve les nanoparticules qui nous intéressent plus particulièrement dans le cadre de notre
étude et qui présentent au moins deux dimensions à l’échelle nanométrique. Il doit être
souligné que les nanomatériaux et donc les nanoparticules ne sont pas tous issus de la
nanotechnologie. En effet, seules le sont les nanoparticules manufacturées c'est-à-dire
produites par l’homme dans un but industriel ou de recherche. Certaines nanoparticules non
manufacturées sont d’origine naturelle comme celles émises par combustion notamment lors
de feux de forêt ou encore par les volcans. D’autres sont d’origine anthropique. Elles sont
issues de l’activité humaine, comme par exemple les nanoparticules produites par les gaz
d’échappement des moteurs diesel.
D’une manière générale, les nanoparticules, en dehors de leur petite taille qui constitue
en elle-même un intérêt majeur pour nombre d’applications, présentent également des
propriétés physiques et chimiques qui sont très différentes de celles de ces mêmes matériaux à
des échelles plus grandes, propriétés qui sont très difficiles à prédire.
6

Soyez le premier à déposer un commentaire !

17/1000 caractères maximum.

Diffusez cette publication

Vous aimerez aussi