Expression et fonction des présénilines vasculaires et exploration de l’hypothèse vasculaire de la Maladie d’Alzheimer

De
Publié par

Sous la direction de Nathalie Macrez
Thèse soutenue le 07 septembre 2009: Bordeaux 1
Les présénilines PS1 et PS2 sont impliquées dans plusieurs fonctions cellulaires par l’intermédiaire de leur activité protéolytique ?-sécrétase qui clive de nombreux substrats y compris la protéine précurseur amyloïde (APP). Les mutations des présénilines, à l’origine des formes familiales de la maladie d’Alzheimer (MA), augmentent la production de peptides ß-amyloïde (Aß) qui s’accumulent dans le parenchyme cérébral et dans la paroi vasculaire, et affectent les signaux calciques de plusieurs types cellulaires. Le réseau vasculaire des patients atteints de la MA est affecté structurellement et fonctionnellement bien avant que ne se déclarent les troubles cognitifs. De plus, les pathologies cardiovasculaires sont des facteurs de risque majeurs pour les formes sporadiques de la MA. Comme les bases moléculaires de la vasculopathie liée à la MA ne sont pas établies, nous avons choisi les présénilines comme molécule cible dans le système vasculaire. Nous avons montré l’expression des présénilines et des protéines partenaires du complexe ?-sécrétase, Nicastrine, Aph-1 et Pen-2 dans les vaisseaux cérébraux et périphériques. L’ensemble génère une activité ?-sécrétase et la production de peptides Aß pathogènes dans les cellules musculaires lisses, soutenant l’hypothèse de l’origine vasculaire d’Aß dans la pathologie amyloïde. De plus, les mutations de PS1 dérégulent la signalisation calcique intracellulaire des artères cérébrales, en augmentant l’activité des canaux de libération du Ca2+ activés par l’IP3 (IP3R) et la recapture du Ca2+ par les pompes du réticulum sarco-endoplasmique Ca2+-ATPase (SERCA). La dérégulation de l’homéostasie calcique par les présénilines mutées pourrait avoir des conséquences sur la réactivité vasculaire des vaisseaux cérébraux. En conclusion, nous avons mis en évidence l’importance physiologique des présénilines dans le réseau vasculaire et l’ensemble de nos travaux permet de mieux comprendre comment les vaisseaux participent à l’apparition des symptômes cliniques de la MA que sont la surproduction d’Aß et l’hypoperfusion cérébrale.
-Mots clés français
Presenilins PS1 and PS2 are involved in several cellular functions through their ?- secretase proteolytic activity, which cleaves many substrates including the amyloid precursor protein (APP). Mutations in presenilins genes are responsible for the majority of familial forms of Alzheimer's disease (AD). Presenilins mutations increased production of ß-amyloid peptide (Aß) that accumulates in the brain parenchyma and the vascular wall, and affect calcium signals in several cell types. The vasculature of patients with AD is structurally and functionally affected before cognitive impairment appearance. In addition, cardiovascular diseases are major risk factors for sporadic forms of AD. As the molecular basis of the vasculopathy associated with AD is not established, we chose presenilins as target molecule in the vascular system. We showed the expression of presenilin and protein partners of ?-secretase complex, nicastrin, Aph-1 and Pen-2 in cerebral and peripheral blood vessels. Vascular wall generate a ?-secretase activity and production of pathogenic Aß peptides supporting the hypothesis of vascular origin of Aß in amyloid pathology. Furthermore, PS1 mutations disturb intracellular calcium signalling in cerebral arteries by first increasing channel activity of Ca2+ release activated by IP3 (IP3R) and second increasing reuptake of Ca2+ by Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase pump (SERCA). Dysregulation of calcium homeostasis by the mutant presenilins might affect vascular reactivity of cerebral vessels. In conclusion, we demonstrated the physiological importance of presenilins in the vascular network and our studies provide new insight on how cerebral blood vessels are involved in the onset of clinical symptoms of AD such as the overproduction of Aß and cerebral hypoperfusion.
-Mots cles en anglais
Source: http://www.theses.fr/2009BOR13949/document
Publié le : vendredi 28 octobre 2011
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A Thierry Guitton



























Année 2009 Thèse n° 3949


THESE
Présentée à
L’UNIVERSITE BORDEAUX
Ecole doctorale sciences de la vie et de la santé

Par
Xavier TOUSSAY
POUR L’OBTENTION DU GRADE DE
DOCTEUR
Spécialité Neurosciences

Expression et fonction des présénilines vasculaires et exploration
de l’hypothèse vasculaire de la Maladie d’Alzheimer


Soutenue le 7 Décembre 2009

Membres du jury
Mr J. MICHEAU Professeur, Université de Bordeaux Président
Mme AM. LOMPRE Directeur de Recherche INSERM Paris Rapporteur
Mme C. RAMPON Chargée de Recherche, CNRS Toulouse
Mr. J. HUGON Professeur, Université de Paris Examinateur
Mr JL. MOREL Chargé de recherche CNRS Bordeaux Examinateur
Mme N. MACREZ Directeur de recherche CN Directrice
1
Avant-propos

Cette thèse a débuté au laboratoire Signalisation et Interaction Cellulaires (CNRS
UMR 5017) dirigé par le Pr. Chantal Mironneau, puis s’est achevée au sein du laboratoire
Centre de Neurosciences Intégratives et Cognitives (CNRS UMR 5228) dirigé par le Dr.
Georges Di Scala.

Tout d’abord je veux remercier le Pr. Chantal Mironneau et le Dr. Georges Di Scala
pour m’avoir accueilli dans leur laboratoire respectif et je souhaite leur témoigner mes
respects les plus sincères.

Je tiens à remercier les Drs Anne-Marie Lompré et Claire Rampon d’avoir pris le
temps d’évaluer ce travail en acceptant d’être rapporteurs de cette thèse. Je remercie
également le Pr. Jacques Hugon de m’avoir fait l’honneur de juger mes travaux, ainsi que le
Pr. Jacques Micheau d’avoir accepté de présider ce jury de thèse. Je voudrais exprimer toute
ma gratitude à l’ensemble du jury pour leurs remarques et suggestions qui ont été pour moi
une source d’enrichissement.

Je tiens surtout à remercier le Dr. Nathalie Macrez qui m’a accueilli au sein de son
équipe et qui m’a accordé sa confiance pour mener à bien ce projet original et ô combien
passionant. Nathalie je te remercie pour ton encadrement, tu as toujours été disponible et très
patiente. J’admire ton exigence constructive, ta facilité à rebondir sur des échecs mais surtout
le fait que tu ne sois jamais à court d’idées originales et intéressantes pour créer ou relancer
des projets. Tu as su aussi effacer mes doutes et me motiver à poursuivre une carrière de
chercheur. Sache que tu es d’ors et déjà une référence pour moi et je souhaite un jour te
proposer à mon tour, un projet scientifique (« du lourd ») et poursuivre notre collaboration.

Un immense merci à l’équipe RéVAN :
Au Dr. Jean-Luc Morel, « celui qui ne dit jamais non ». Merci Jean-luc pour tout ce
que tu m’a apporté autant sur le plan scientifique que sur le plan humain. Travailler à tes côtés
fût un grand plaisir pour moi, tu as toujours répondu présent chaque fois que j’ai eu besoin
d’un conseil, d’un avis ou d’un réconfort. Je te suis aussi reconnaissant pour m’avoir initié à
l’imagerie calcique, d’avoir participer aux différentes discussions sur les manips calcium « à
s’arracher les cheveux ». Enfin, je te remercie d’avoir accepté de juger ce travail.
2
Au Dr. Fabrice Dabertrand, qui a été mon doctorant modèle lorsque j’ai commencé ma
thèse. Fabrice tu es quelqu’un à part…tu es le seul chercheur que je connaisse qui, lorsqu’il va
faire ses courses, il garde sa blouse…Il n’y a que toi qui peux comprendre. J’espère te revoir
très bientôt.
A Nathalie Biendon, la technicienne par excellence. Chère Nathalie, sache que j’ai
beaucoup apprécié ta motivation, ton dynamisme, ton dévouement pour faire avancer les
choses dans le laboratoire. Tu m’as toujours apporté tout l’aide dont j’avais besoin non
seulement pour les manips mais aussi pour tout ce qui concerne la vie au laboratoire. Un
grand merci à toi.
Aux étudiantes Marie-Charlotte et Carole. Merci pour le soutien dont vous m’avez
témoigné en fin de thèse, votre gentillesse. J’aurai aimé partager avec vous la merveilleuse
aventure de la thèse un peu plus longtemps.
Aux « anciens » de l’équipe, le Pr. Jean-François Quignard, les Drs Morgana Hénaff et
Eric Estève. Merci pour vos différentes remarques, suggestions et vos conseils. Je vous
souhaite de faire de belles découvertes très prochainement.

Mes remerciements s’adressent également à l’ensemble du laboratoire CNIC,
particulièrement au Dr. Yoon Cho, aux étudiants devenus docteurs: Stéphanie Allaux, Yves
portes, Fred Esclassan et Edith Lesburguères…pour leur expérience, leur écoute, leur aide et
conseils si précieux. Merci à tous les autres membres du laboratoire et les personnes que
j’oublie certainement de nommer ici.

Si les grandes découvertes scientifiques font avancer l’humanité, n’oublions jamais
que l’amour pure et véritable est l’unique moteur de la vie. Je voudrais ainsi remercier les
gens que j’aime : ma mère Sonia, mon père Raymond, mon frère Fabien et ma sœur Virginie.
Merci aussi à ma belle-famille Philippe, Vic et Camille. Merci à tous pour votre amour et
soutien infaillible. Je remercie Emmanuelle Maurin pour sa grande patience, sa
compréhension, ses encouragements. Merci pour tout l’amour que tu me donnes au quotidien.
Je salue enfin la famille Maurin, merci pour votre soutien et votre affection.

Merci à tous mes amis de Martinique, de Niort, La Rochelle, Bordeaux…et…Poitiers
en force !!!!
3
Les travaux réalisés au cours de ma thèse feront l’objet de deux publications (ACL) :

ACL1: Presenilin function and amyloid A β production in peripheral and cerebral blood
vessels
Toussay X, Biendon N, Rakotoarisoa L, Quignard JF, Cho Y and Macrez N
Soumis

ACL2: Regulation of vascular smooth muscle calcium signalling by presenilins X, Morel JL, Biendon N, Cho Y and Macrez N
En rédaction

Les résultats rapportés dans ces publications ont été présentés dans différents congrès sous
forme de poster (P) ou communication orale (O) :

P1: Vascular expression of presenilins
Toussay X and Macrez N
th 18 Scientific Meeting European Society Hypertension, 14-19 Juin 2008, Berlin

P2: Calcium signalling in mouse arterial cerebrovascular bed
Morel JL, Dabertrand F, Toussay X and Macrez N
st 1 Symposium New Frontiers in Neurophotonics, 20-23 octobre 2008, Talence

O1: Activité γ-sécrétase et production d’amyloïde A β dans la paroi vasculaire
Toussay X, Rakotoarisoa L, Quignard JF et Macrez N
ème10 réunion francophone sur la Maladie d’Alzheimer et les syndromes apparentés,
20-22 octobre 2009, Nantes

J’ai également participé à une autre étude que celles présentées dans ce manuscrit :

P3: Functional interactions between ryanodine receptors, InsP3 receptor and TRPP2
in mouse cerebral arteries
Morel JL, Toussay X and Macrez N
th 20 Ion Channel Meeting, 20-23 septembre 2009, Presqu’île de Giens


4
Sommaire

Avant-propos.............................................................................................................................. 2
Sommaire................................................................................................................................... 5
Liste des figures....................................................................................................................... 10
Liste des tableaux .................................................................................................................... 11
Liste des abréviations .............................................................................................................. 12
Introduction.......... 14
Données Bibliographiques...................................................................................................... 18
I Organisation générale des vaisseaux cérébraux............................................................ 19
I.1 Rappel sur les structures cérébrales..................................................................... 19
I.2 La vascularisation artérielle du cerveau .............................................................. 21
I.2.1 Le système carotidien........................................................................................... 22
I.2.1.1 L’artère cérébrale antérieure ........................................................................ 23
I.2.1.2 L’artère cérébrale moyenne.......................................................................... 25
I.2.2 Le système vertébro-basilaire............................................................................... 25
I.2.2.1 L’artère basilaire..........................................................................................25
I.2.2.2 L’artère cérébrale communicante postérieure ..............................................
I.2.2.3 L’artère cérébelleuse supérieure................................................................... 26
I.2.2.4 L’artère cérébrale postérieure....................................................................... 26
I.2.3 Le polygone de Willis 27
I.3 La vascularisation veineuse du cerveau ............................................................... 27
I.3.1 Les veines superficielles....................................................................................... 28
I.3.2 Les veines profondes............................................................................................ 28
I.3.3 Particularités du système veineux de la souris ..................................................... 28
II Structure des vaisseaux cérébraux ................................................................................. 29
II.1 Structure générale de la paroi vasculaire ............................................................ 29
II.2 Le réseau artériel cérébral .................................................................................... 30
II.3 Le réseau capillaire cérébral 32
II.4 Le réseau veineux cérébral 32
III Les cellules musculaires lisses vasculaires................................................................. 33
III.1 Généralités .............................................................................................................. 33
III.2 Homéostasie calcique au repos.............................................................................. 34
III.3 Couplage excitation-contraction dans les CMLV ............................................... 35
2+III.3.1 Libération de Ca à partir du RS..................................................................... 37
III.3.1.1 Les canaux IP R ....................................................................................... 37 3
III.3.1.1.1 Expression, structure et fonctions ........................................................ 37
2+III.3.1.1.2 Libération du Ca par les IP R............................................................ 38 3
III.3.1.2 Les canaux RYR39
III.3.1.2.1 Expression, structure et fonctions
5
2+III.3.1.2.2 Libération du Ca par les RYR ........................................................... 39
III.3.1.3 Coopération entre IP R et RYR ............................................................... 40 3
2+III.3.2 Entrée de Ca à travers la membrane plasmique............................................. 41
2+III.3.2.1 a via les canaux calciques voltage-dépendants................... 41
2+III.3.2.2 Entrée de Ca via les canaux TRP .......................................................... 42
III.4 Relaxation des CMLV............................................................................................ 44
III.4.1 La pompe PMCA ............................................................................................. 44
III.4.2 La pompe SERCA 45
III.4.3 Les échangeurs NCX........................................................................................ 45
III.4.4 Le rôle de la mitochondrie ............................................................................... 45
2+III.4.5 Les protéines cytosoliques de liaison au Ca .................................................. 46
III.5 Signaux calciques et rôles physiologiques dans les CMLV ................................ 46
III.6 Outils pharmacologiques de la signalisation calcique......................................... 49
III.6.1 Modulation pharmacologique des IP R............................................................ 49 3
III.6.2 acologique des RYR........................................................... 49
III.6.3 acologique des SERCA ...................................................... 50
IV La maladie d’Alzheimer : une affection multifactorielle........................................... 51
IV.1 Définition, symptômes et épidémiologie............................................................... 51
IV.2 Marques histopathologiques neuronales.............................................................. 52
IV.2.1 Les dégénérescences neurofibrillaires 52
IV.2.2 Les plaques séniles...........................................................................................53
IV.2.3 L’atrophie cérébrale.........................................................................................54
IV.3 Marques histopathologiques vasculaires 55
IV.3.1 L’angiopathie amyloïde cérébrale.................................................................... 56
IV.3.1.1 Description générale.................................................................................56
IV.3.1.2 Composition.............................................................................................57
IV.3.1.3 Origine de l’AAC.....................................................................................
IV.3.1.4 Conséquences de l’AAC .......................................................................... 59
IV.3.2 Les modifications de la structure vasculaire cérébrale..................................... 60
IV.3.2.1 Larges artères cérébrales 60
IV.3.2.2 Artères piales et petites artérioles............................................................. 61
IV.3.2.3 Capillaires cérébraux................................................................................61
IV.4 Facteurs de risques................................................................................................. 62
IV.5 Facteurs génétiques................................................................................................ 66
IV.5.1 L’ApoE, facteur de susceptibilité génétique .................................................... 66
IV.5.2 Le précurseur du peptide amyloïde (APP) ....................................................... 68
IV.5.2.1 Caractéristiques........................................................................................68
IV.5.2.2 Le métabolisme de l’APP......................................................................... 69
IV.5.2.2.1 La voie non-amyloïdogène................................................................... 69
IV.5.2.2.2 La voie am.......................................................................... 70
IV.5.3 Les présénilines72
IV.5.3.1 Généralités
IV.5.3.2 Propriétés biologiques et biochimiques.................................................... 72
IV.5.3.2.1 Localisation intracellulaire72
IV.5.3.2.2 Topologie et structure des présénilines................................................ 73
IV.5.3.2.3 Maturation protéolytique......................................................................74
6
IV.5.3.3 Mutations des gènes des présénilines....................................................... 74
IV.5.3.4 Fonctions putatives des présénilines ........................................................ 76
IV.5.3.5 L’activité γ-sécrétase dépendante des présénilines .................................. 77
IV.5.3.5.1 Partenaires du complexe γ-sécrétase.................................................... 77
IV.5.3.5.2 Hétérogénéité du complexe γ ............................................... 79
IV.5.3.5.3 Les différents substrats de l’activité γ-sécrétase 80
V Les différentes hypothèses de la MA .............................................................................. 82
V.1 La cascade amyloïde au centre de la physiopathologie....................................... 82
V.1.1 Relation entre pathologies A β et tau ................................................................ 83
V.1.2 Les oligomères solubles de peptide A β............................................................ 84
V.2 L’hypothèse vasculaire de la MA.......................................................................... 85
V.2.1 Démence vasculaire et maladie d’Alzheimer................................................... 86
V.2.2 Altération vasculaire cérébrale et neurodégénérescence.................................. 87
V.3 L’hypothèse calcique de la MA............................................................................. 89
V.3.1 A β et calcium ................................................................................................... 90
V.3.2 Tau et calcium .................................................................................................. 92
V.3.3 L’ApoE4 et calcium ......................................................................................... 92
V.3.4 Mutation des présénilines et Calcium .............................................................. 93
V.3.4.1 Interaction présénilines et protéines du réticulum........................................ 94
2+V.3.4.2 Présénilines, canal de fuite du Ca ?........................................................... 95
V.3.4.3 Influx capacitatifs97
2+V.3.4.4 Protéines partenaires de liaison au Ca ....................................................... 97
V.3.4.5 Conclusion....................................................................................................98
Matériel et Méthodes............................................................................................................... 99
I Stratégie employée......................................................................................................... 100
II Animaux utilisés............................................................................................................ 101
III Prélèvement et dissection des vaisseaux cérébraux et périphériques...................... 102
IV Extraction des ARN totaux ....................................................................................... 102
V Transcription inverse – Réaction de polymérisation en Chaîne (RT-PCR)................ 103
VI Immunofluorescence................................................................................................. 104
VI.1 Préparation des vaisseaux isolés ......................................................................... 105
VI.2 Préparation des coupes de cerveau..................................................................... 105
VI.3 Récupération de l’antigène et immunofluorescence ......................................... 106
VI.4 Immunomarquage des vaisseaux ou coupes de cerveau................................... 107
VI.5 Observation de l’immunofluorescence par microscopie confocale.................. 107
VII Préparation des protéines et western blot................................................................. 110
VII.1 Préparation des protéines................................................................................ 110
VII.2 Western blot...................................................................................................... 110
VIII Mesure de l’activité γ-sécrétase dans les vaisseaux ................................................. 111
IX Coloration à la thioflavine S..................................................................................... 112
X Mesures des signaux calciques intracellulaires........................................................... 113
7
X.1 Les sondes calciques............................................................................................. 113
X.2 Charge du matériel biologique en sondes .......................................................... 114
2+X.3 Mesure du Ca cytosolique................................................................................. 115
X.4 Charge et photolyse d’IP encagé ....................................................................... 116 3
X.5 Analyse statistique des résultats.......................................................................... 117
Résultats................................................................................................................................. 118
I Expression des présénilines et production du peptide A β dans les vaisseaux cérébraux
et périphériques ..................................................................................................................... 119
I.1 Introduction .......................................................................................................... 119
I.2 Manuscrit soumis ................................................................................................. 120
I.3 Résultats complémentaires.................................................................................. 141
II Production amyloïde dans les vaisseaux cérébraux des souris PS1Δ9 ....................... 142
II.1 Introduction 142
II.2 Résultats ................................................................................................................ 142
II.2.1 Dépôts amyloïdes vasculaires chez les souris PS1 Δ9 .................................... 142
II.2.2 Expression de A β40 et A β42 dans les vaisseaux cérébraux PS1 Δ9............... 143
III Caractérisation de la signalisation calcique des vaisseaux cérébraux.................... 146
III.1 Introduction .......................................................................................................... 146
III.2 Résultats ................................................................................................................ 146
III.2.1 Activité calcique spontanée............................................................................ 146
III.2.2 Réponses calciques évoquées par l’activation de médiateurs ........................ 148
III.2.3 Réponses calciques évoquées par la caféine .................................................. 149
III.3 Applications expérimentales................................................................................ 150
IV Effet des mutations de PS1 dans la signalisation calcique des myocytes des
vaisseaux cérébraux .............................................................................................................. 151
IV.1 Introduction .......................................................................................................... 151
IV.2 Manuscrit en préparation.................................................................................... 152
IV.3 Résultats complémentaires.................................................................................. 172
Discussion.............................................................................................................................. 174
I Expression des présénilines dans le système vasculaire .............................................. 175
II Rôle potentiel des présénilines dans le développement vasculaire .............................. 178
III Expression du complexe γ-sécrétase dans les vaisseaux.......................................... 179
IV Production du peptide A β42 dans les CMLV ........................................................... 180
V Origine des dépôt amyloïdes vasculaires ...................................................................... 182
VI Effet de la mutation PS1 Δ9 sur la production d’A β ................................................ 184
VII Signaux calciques dans les vaisseaux cérébraux..................................................... 186
8
VIII Effet des mutations de PS1 sur la signalisation calcique intracellulaire des
vaisseaux cérébraux .............................................................................................................. 188
VIII.1 Expression des transgènes de PS1 dans les vaisseaux cérébraux................. 188
VIII.2 Effet de la mutation PS1 Δ9 sur l’activité calcique spontanée au repos....... 189
2+VIII.3 S1 Δ9 sur la [Ca ] basale ........................................... 190 i
VIII.4 Effets des mutations de PS1 sur les IP R ....................................................... 191 3
VIII.5 e PS1 sur les RYR 193
2+VIII.6 Recapture du Ca et influx capacitatifs ........................................................ 195
VIII.7 Rôle de l’activité γ-sécrétase ?......................................................................... 197
VIII.8 Calcium, réactivité vasculaire et MA ............................................................. 197
Conclusion............................................................................................................................. 199
Bibliographie ......................................................................................................................... 202
9

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