Identification et caractérisation d'un nouveau marqueur de la sénescence cellulaire : la protéine WNT16B, Identification and characterization of a new biomarker of cellular senescence : wNT16B protein

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Publié par

Sous la direction de Christian Brambilla, Remy Pedeux
Thèse soutenue le 31 mars 2011: Grenoble
La sénescence cellulaire est un mécanisme de suppression cellulaire caractérisé par un arrêt irréversible du cycle cellulaire. Les cellules sénescentes ont également un secrétome spécifique qui influe sur les cellules voisines, pouvant induire leur entrée prématurée en sénescence, l'apoptose, la prolifération cellulaire et le développement tumoral. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse était d'identifier une nouvelle protéine sécrétée par les fibroblastes sénescents et de caractériser ses fonctions dans les cellules sénescentes et dans les cellules tumorales. Nous avons mis en évidence la protéine WNT16B. Elle est surexprimée dans plusieurs modèles de sénescence cellulaire obtenus à partir de fibroblastes pulmonaires. Dans un modèle de souris transgénique, WNT16B est également associée avec l'accumulation de cellules sénescentes dans les lésions précancéreuses pulmonaires. WNT16B est impliqué dans le mécanisme de sénescence cellulaire. En effet, l'inhibition de WNT16B prévient l'entrée en sénescence, en empêchant l'activation de p53 et l'expression de p21/WAF1, et donc l'arrêt du cycle cellulaire.Nous avons finalement associé l'expression de WNT16B avec la présence de cellules sénescentes dans des tumeurs prélevées chez des patients atteints de carcinomes pulmonaires non à petites cellules. Cette expression est corrélée avec une meilleure survie pour les patients ayant reçu un traitement chimiothérapeutique. Ce dernier résultat fait donc le lien entre traitement, sénescence cellulaire et survie, et illustre le rôle potentiel des marqueurs des cellules sénescentes pour le suivi des patients. Globalement, ces travaux ont donc non seulement permis d'identifier WNT16B comme nouveau marqueur des cellules sénescentes, mais ils ont également ouvert des perspectives d'utilisation de ce marqueur pour l'identification, le traitement et le suivi des patients atteints d'un cancer.
-Cancer du poumon
-Senescence cellulaire
-Microenvironnement
-Biomarqueurs
-WNT16
Cellular senescence is a tumor suppression mechanism consisting of an irreversible cell cycle arrest. Senescent cells also express a specific secretome that plays a role in the microenvironment. It may induce premature senescence, apoptosis, cellular proliferation or tumor development in the neighboring cells. In this context, my thesis aimed to identify and characterize a new senescence-associated secreted protein, before highlighting its role in tumorigenesis. We identified the WNT16B protein. It was overexpressed in various cellular senescence models obtained from lung fetal fibroblasts. Moreover, WNT16B expression was associated with the accumulation of senescent cells in precancerous lesions in a transgenic mice model. WNT16B is also involved in the senescence machinery. Indeed, WNT16B inhibition prevented the senescence onset through inactivation of the p53/p21 pathway, thus stopping the cell cycle progression. Finally, we observed a correlation between the WNT16B expression and the occurrence of senescent tumoral cells in NSCLC samples. This expression was also correlated with a better patient outcome after chemotherapeutical treatment. Thus, this last result linked the treatment efficiency, the occurrence of senescence and the patient survival. Overall, my thesis established elevated WNT16B levels as a novel biomarker for senescence that might be useful for the identification, the treatment follow-up and the prognosis of patient outcome.
-Lung cancer
-Microenvironment
-Cellular senescence
-Biomarkers
-WNT16
Source: http://www.theses.fr/2011GRENV007/document
Publié le : samedi 29 octobre 2011
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THÈSE
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE GRENOBLE
Spécialité : Biologie Cellulaire
Arrêté ministériel : 7 août 2006



Présentée par
Romuald BINET


Thèse dirigée par Christian BRAMBILLA et
codirigée par Rémy PEDEUX

préparée au sein du Laboratoire INSERM U823/UJF – Institut
Albert Bonniot – Equipe Bases Moléculaires de la Progression
des Cancers du Poumon
dans l'École Doctorale Chimie et Sciences du Vivant


Identification et Caractérisation
d’un Nouveau Marqueur de la
Sénescence Cellulaire :
la Protéine WNT16B


Thèse soutenue publiquement le 31 mars 2011,
devant le jury composé de :
Dr Claude CARON DE FROMENTEL
DR2, INSERM U590, Lyon - Rapporteur
Dr Oliver BISCHOF
CR1, INSERM U993, Paris - Rapporteur
Pr Elisabeth BRAMBILLA
PU/PH, INSERM U823, Grenoble - Examinateur
Dr Jean-François DORE
DRE, INSERM U590, Lyon - Examinateur
Pr Christian BRAMBILLA
PU/PH, INSERM U823, Grenoble – Examinateur
Dr Rémy PEDEUX
CR1, INSERM U917, Rennes – Examinateur
tel-00604466, version 1 - 29 Jun 2011

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« C’est à force d’observation, de réflexion, que l’on trouve. »
Monet à Frédéric Bazille, 15 juillet 1864
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tel-00604466, version 1 - 29 Jun 2011REMERCIEMENTS

Tout d’abord, je tiens à adresser ma gratitude aux Prs Elisabeth et Christian Brambilla pour
m’avoir accueilli au sein de l’unité INSERM U578, devenue depuis l’équipe 2 de l’unité
INSERM U823. Je souhaite également remercier les différentes personnes qui m’ont encadré
depuis mon master : le Dr Sylvie Gazzeri en M1, le Dr Rémy Pedeux en M2 et en Thèse,
conjointement avec le Pr Christian Brambilla. Je tiens également à remercier la Fondation
pour le Recherche Médicale (FRM) et en particulier le Dr Nadine Josso qui a créé le prix
Mariane Josso, lequel a financé les trois premières années de ma thèse. De la même façon, je
remercie l’Association pour la Recherche sur le Cancer pour l’attribution de ma bourse de
quatrième année. Je remercie également les membres de mon jury, les Dr Claude Caron de
Fromentel et Oliver Bischof, et le Pr Jean-Fraçois Doré, d’une part d’avoir accepté d’en faire
partie, d’autre part d’avoir fait le déplacement pour ma soutenance et pour les rapporteurs
d’avoir pris sur leur temps pour évaluer mon rapport.
Parce que tout a commencé en M1, j’ai une grosse pensée pour Céline Lampréia (oui tu es
mariée maintenant mais je ne me souviens plus de ton nouveau nom !) qui a été ma première
formatrice à la paillasse. Ta bonne humeur restera inoubliable !
L’année de M2 a été un tournant puisque j’ai commencé à travailler sur le sujet qui serait
par la suite l’objet de ma thèse. Cette année a également été celle de la rencontre du
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tel-00604466, version 1 - 29 Jun 2011maintenant Docteur Damien Ythier (Dam’s), qui m’a indéniablement tiré vers le haut aussi
bien intellectuellement que techniquement, et de Damien Nissou, compagnon de boulettes
mais surtout un excellent camarade.
C’est en thèse que j’ai finalement fait la connaissance du dernier membre du « ING
Group », le désormais Docteur Delphine Larrieu, qui bien que je lui répétasse régulièrement
qu’elle ne servait à rien (!), était un modèle de qualité et de rigueur scientifique, autant qu’une
personne humainement incomparable. On a fini tous les deux et ça aurait été difficile si on ne
s’était pas entendu comme ça.
Je remercie chaleureusement nos collaborateurs qui ont permis l’aboutissement d’une
partie de ce travail, les Drs Manuel Serrano et Manuel Collado de Madrid, le Pr Curtis Harris
et le Dr Ana Robles de Bethesda.
D’autres rencontres ont jalonné mon parcours, notamment le personnel de la plateforme de
protéomique gérée par le Pr Michel Seve, et je pense plus particulièrement à Jérôme Chenau.
Je citerai également l’équipe du Pr Elisabeth Brambilla qui m’a accueilli pendant quelques
semaines dans son laboratoire d’immunohistochimie, alors merci à Nicolas Lemaître,
Laurence David-Boudet et Adrien Mombrun. Enfin, une pensée pour l’ensemble de l’ex-unité
U578 et des équipes 2, 5 et 11 de l’unité U823.
Sur un plan plus personnel, je tiens à citer le nom de ces collègues devenus mes amis,
Anastassia Karageorgis, Christiane Wenk, le Dr Molière N’Guile-Makao, Aurélien Vésin,
Adrien Français, Sébastien Botagissi et Thomas Lloret. Les souvenirs d’une thèse ne
s’accumulent pas essentiellement au labo, alors merci pour les bons moments passés
ensemble.
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tel-00604466, version 1 - 29 Jun 2011Je tiens à remercier ma Maman, pour qui mon départ à Grenoble a été difficile mais qui a
toujours été à mes côtés lorsque j’avais besoin d’elle. Une grosse pensée pour ma Mamie,
toujours là elle aussi. Et bien que tout ne se soit pas passé comme on l’aurait voulu, je
remercie la mère de mon fils Luc, grâce à qui d’une certaine façon cette aventure a commencé
puisque c’est sur son impulsion que nous nous sommes retrouvés à Grenoble.
J’ai une pensée tendre pour Toi, qui es entrée dans ma vie cette dernière année, qui m’as
soutenue pendant la rédaction du rapport, qui a partagé mes doutes et mes galères, et qui as
accepté de t’engager avec moi pour longtemps encore… Merci.
Enfin, parce que ma thèse n’est que mon second bébé, je pense à mon fils Luc, né alors que
je finissais mon master. Tu as été mon plus grand bonheur ces presque cinq dernières années,
tu as supporté mes indisponibilités de thésard et tu as subi les choix de tes parents. Ta
présence a rendu ma thèse inoubliable. Pardon et merci.

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tel-00604466, version 1 - 29 Jun 2011TABLE DES MATIERES

REMERCIEMENTS ......................................................................................................... 4
TABLE DES MATIERES ................................................................................................... 7
ABREVIATIONS ........................................................................................................... 11
LISTE DES FIGURES ...................................................................................................... 15
LISTE DES TABLES........................................................................................................ 17
LISTE DES PUBLICATIONS ............................................................................................ 18
PREAMBULE ............................................................................................................... 19
INTRODUCTION .......................................................................................................... 21
1. La sénescence cellulaire ......................................................................................................................... 21
1.1. La sénescence réplicative ................................................................................................................ 23
1.1.1. La limite de Hayflick .............................................................................................................. 23
1.1.2. Les télomères .......................................................................................................................... 23
Mise en évidence chez Tetrahymena thermophila. ............................................................................. 25
Structure des télomères humains. ....................................................................................................... 25
Principales fonctions des télomères. ................................................................................................... 27
1.1.3. La télomérase. ........................................................................................................................ 29
Historique ........................................................................................................................................... 29
Le complexe télomérase et son mode d’action. .................................................................................. 30
La télomérase in vivo. ........................................................................................................................ 31
1.1.4. Le raccourcissement des télomères : « end-replication problem » ......................................... 33
7

tel-00604466, version 1 - 29 Jun 2011Le problème de la réplication des télomères ...................................................................................... 33
Une activité exonucléasique à l’origine de l’extrémité 3’ simple brin ............................................... 33
Les autres acteurs impliqués dans la génération de l’extrémité 3’ simple brin. ................................. 36
Le rôle du stress oxydatif dans le raccourcissement des télomères. ................................................... 36
Le signal d’entrée en sénescence ........................................................................................................ 37
1.1.5. La sénescence réplicative est une réponse aux dommages de l’ADN .................................... 39
Des protéines de la DDR s’accumulent au niveau des télomères. ...................................................... 39
Rôle des voies DDR dans le processus de sénescence réplicative ...................................................... 43
1.1.6. L’inhibition du cycle cellulaire ............................................................................................... 44
La protéine suppressive de tumeur p53 .............................................................................................. 44
Sénescence et p53 ............................................................................................................................... 46
Régulation du facteur de transcription p53 ......................................................................................... 47
L’inhibiteur des CDK : p21 ................................................................................................................ 48
La protéine pRB ................................................................................................................................. 49
Un autre inhibiteur des CDK : p16 ..................................................................................................... 51
1.2. La sénescence cellulaire prématurée ............................................................................................... 52
1.2.1. La sénescence prématurée induite par un stress (SIPS) .......................................................... 52
Le stress oxydatif................................................................................................................................ 52
La sénescence prématurée induite par des dommages à l’ADN ......................................................... 52
1.2.2. La sénescence prématurée induite par un oncogène ............................................................... 53
1.3. Les autres caractéristiques des cellules sénescentes ........................................................................ 55
1.3.1. Morphologie ........................................................................................................................... 55
1.3.2. L’activité β-galactosidase spécifique de la sénescence (SA-βGal) ......................................... 57
1.3.3. Les foyers d’hétérochromatine associés à la sénescence (SAHF) .......................................... 58
Les protéines impliquées dans la formation des SAHF. ..................................................................... 58
Rôle des SAHF dans l’arrêt du cycle cellulaire. ................................................................................. 59
1.3.4. La résistance à l’apoptose ....................................................................................................... 60
Les cellules sénescentes expriment des protéines anti-apoptotiques. ................................................. 60
Le choix entre sénescence et apoptose. .............................................................................................. 60
1.4. La sénescence cellulaire – in vivo ................................................................................................... 61
1.4.1. La sénescence est un mécanisme de suppression tumorale .................................................... 61
1.4.2. Effets néfastes de l’accumulation de cellules sénescentes ...................................................... 65
Sénescence et vieillissement............................................................................................................... 65
Sénescence et promotion tumorale ..................................................................................................... 67
1.4.3. Utilisation des cellules sénescentes en clinique ...................................................................... 71
Utilisation des marqueurs de sénescence dans le diagnostic et le pronostic ....................................... 71
Applications thérapeutiques ............................................................................................................... 71
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tel-00604466, version 1 - 29 Jun 20112. Les protéines WNT ................................................................................................................................ 73
2.1. Les membres de la famille WNT chez l’Homme ............................................................................ 73
2.1.1. Découverte de WNT1 ............................................................................................................. 73
2.1.2. Caractéristiques générales des protéines WNT ...................................................................... 74
2.2. Les voies de signalisation WNT ...................................................................................................... 77
2.2.1. Les récepteurs ......................................................................................................................... 77
2.2.2. Les inhibiteurs extracellulaires ............................................................................................... 78
2.2.3. La voie WNT/β-caténine ........................................................................................................ 80
2.2.4. La voie de polarité planaire .................................................................................................... 82
2.2.5. La voie du calcium ................................................................................................................. 85
2.2.6. Les autres voies de signalisation indépendantes de la β-caténine. .......................................... 86
2.3. WNT16 ............................................................................................................................................ 90
2.3.1. Le gène WNT16 ...................................................................................................................... 90
2.3.2. Les protéines WNT16 ............................................................................................................. 91
2.3.3. Orthologues et paralogues ...................................................................................................... 93
2.3.4. Expression in vivo................................................................................................................... 93
2.3.5. WNT16 dans le tissu hématopoïétique ................................................................................... 94
2.3.6. Autres rôles dans le développement et les cancers ................................................................. 95
2.3.7. Voies de signalisation activées par WNT16 ........................................................................... 96
3. Objectif et stratégie de l’étude .............................................................................................................. 97
RESULTATS ................................................................................................................. 98
1. Mise en évidence des fonctions de WNT16B dans la régulation de l’entrée en sénescence ............. 98
1.1. WNT16B est un nouveau marqueur de la sénescence cellulaire ..................................................... 98
1.2. WNT16B est nécessaire pour l’entrée en sénescence réplicative .................................................... 99
1.3. WNT16B régule l’activité transcriptionnelle de p53..................................................................... 100
1.4. WNT16B active la voie PI3K/AKT .............................................................................................. 101
Publication n°1 WNT16 Is a New Marker of Cellular Senescence That Regulates p53 Activity and the
Phosphoinositide 3-Kinase/AKT Pathway. .................................................................................................... 103
2. L’expression de WNT16 dans les CPNPC est associée à l’expression d’un marqueur de la
sénescence et à un meilleur prognostic. ........................................................................................................... 139
2.1. L’expression de WNT16 n’est pas altérée dans les CPNPC ......................................................... 139
2.2. WNT16 est exprimé dans le stroma tumoral ................................................................................. 139
2.3. L’expression de WNT16 dans les tumeurs corrèle avec la SA-β-Gal. .......................................... 140
2.4. L’expression de WNT16 est associée à un meilleur pronostic ...................................................... 140
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tel-00604466, version 1 - 29 Jun 2011Manuscrit de la publication n°2 WNT16 Expression In NSCLC Is Associated With Cellular Senescence.
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DISCUSSION .............................................................................................................. 171
1. Les voies de signalisation WNT non canoniques sont associées à la sénescence réplicative .......... 171
2. WNT16B est un nouveau marqueur de la sénescence cellulaire ...................................................... 172
3. WNT16B et AKT .................................................................................................................................. 174
4. WNT16B et p53 .................................................................................................................................... 176
5. WNT16 et croissance tumorale ........................................................................................................... 178
6. L’importance des facteurs solubles .................................................................................................... 181
CONCLUSION ET PERSPECTIVES .................................................................................. 183
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES............................................................................... 187
ANNEXES ................................................................................................................... 200
1. Publication n°3 ..................................................................................................................................... 201
2. Publication n°4 ..................................................................................................................................... 209
3. Publication n°5 ..................................................................................................................................... 217





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tel-00604466, version 1 - 29 Jun 2011

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