Modélisation moléculaire et expérimentation en réacteur solide/gaz pour la compréhension de la sélectivité de la lipase B de Candida antarctica, Molecular modeling and experimentation in solid/gas reactor for understanding the selectivity of lipase B from Candida antarctica

De
Publié par

Sous la direction de Marianne Graber
Thèse soutenue le 22 juillet 2010: La Rochelle
L’objectif de cette thèse était de mieux comprendre les paramètres structuraux et environnementaux gouvernant l’énantiosélectivité de la lipase B de Candida antarctica (CALB), lors de la résolution des alcools secondaires linéaires chiraux. Ces composés sont notamment utilisés comme synthons chiraux dans l’industrie pharmaceutique. Dans un premier temps, une étude systématique des orientations du butan-2-ol et du pentan-2-ol au sein du site actif a été réalisée par modélisation moléculaire. Les résultats suggèrent l’existence de modes d’arrimages supplémentaires à ceux mentionnés dans la littérature. La comparaison selon l’énergie potentielle du substrat des structures les plus stables, combinée à la prise en compte de modes de fixation non productifs, nous a permis d’expliquer qualitativement l’énantiopréférence de la CALB pour la forme R. A l’aide du réacteur solide/gaz, nous avons montré que les résidus hydrophobes formant le canal d’accès du substrat au site actif (Ile189, Leu278 et Ala282), jouaient un rôle significatif dans l’énantiosélectivité de la CALB vis-à-vis des alcools secondaires. L’influence de la partie alkoxy du donneur d’acyle sur le ratio énantiomérique a également pu être mise en évidence. Par ailleurs, nous avons montré que des mutations isostériques de la poche stéréosélective conduisaient à des variations des paramètres thermodynamiques d’activation de l’acylation du pentan-2-ol, probablement suite à des modifications du réseau de liaisons hydrogène formé entre les résidus de la poche. Les études d’adsorption de l'eau et des substrats sur l’enzyme immobilisée nous ont permis de relier l'état d'hydratation de la CALB avec les effets particuliers de l'eau sur l’activité et la sélectivité de l’enzyme.
-Lipase B de Candida antarctica
-Énantiosélectivité
-Réacteur solide/gaz
-Modélisation moléculaire
-Chromatographie gazeuse en phase inverse
-Alcoolyse
-Activité thermodynamique
The aim of this thesis was to understand more precisely the structural and environmental parameters governing the enantioselectivity of lipase B from Candida antarctica (CALB), involved in the discrimination of chiral secondary alcohols enantiomers. These compounds are used in particular for the synthesis of enantiomerically pure pharmaceutical molecules. Initially a systematic study of the orientation of butan-2-ol and pentan-2-ol in the active site was performed by molecular modeling. The results suggest the existence of additional binding modes to those mentioned in the literature. The potential energy comparison of the most stable conformations of the substrate, combined with the existence of non productive binding modes, allowed us to explain qualitatively the enantiopreference of CALB for the R form. Using the solid/gas reactor, we have shown that hydrophobic residues forming the access channel of substrate to the active site (Ile189, Leu278 and Ala282), played a significant role in the enantioselectivity of CALB towards secondary alcohols. The influence of the alkoxy part of the acyl donor on the enatiomeric ratio E has also been highlighted. Furthermore, we showed that isosteric mutations of the stereoselective pocket led to changes in pentan-2-ol activation thermodynamic parameters of acylation, probably due to changes in the hydrogen bonds network formed between residues of the pocket. Studies of water and substrates adsorption on the immobilized enzyme allowed us to relate the hydration status of CALB with specific effects of water on the enzyme activity and selectivity.
-Candida antarctica lipase B
-Enantioselectivity
-Solid/gas reactor
-Molecular modeling
-Inverse gas chromatography
-Alcoholysis
-Thermodynamic activity
Source: http://www.theses.fr/2010LAROS298/document
Publié le : vendredi 28 octobre 2011
Lecture(s) : 67
Nombre de pages : 330
Voir plus Voir moins


UNIVERSITÉ DE LA ROCHELLE





ÉCOLE DOCTORALE
Science pour l’Environnement Gay-Lussac

Laboratoire Littoral Environnement et Sociétés (LIENSs) UMR CNRS 6250


THÈSE
présentée par :
Zsuzsanna MARTON



soutenue le 22 juillet 2010
pour l’obtention du grade de Docteur de l’Université de La Rochelle
Discipline : Biochimie



Modélisation moléculaire et expérimentation en réacteur solide/gaz
pour la compréhension de la sélectivité de la lipase B de Candida antarctica








JURY :

Sylvain LAMARE Professeur, Université de la Rochelle, Président du jury
Krystyna ZAKRZEWSKA Directeur de recherche CNRS, Université de Lyon, Rapporteur
Alain MARTY Professeur, INSA de Toulouse, Rapporteur
Marianne GRABER Professeur, Université de La Rochelle, Directeur de thèse
Vinh TRAN Professeur, Université de Nantes, Co-directeur de thèse
Gwénaëlle ANDRÉ-LEROUX Chargée de recherche INRA, Institut Pasteur de Paris, Examinateur

tel-00541104, version 1 - 29 Nov 2010






tel-00541104, version 1 - 29 Nov 2010Modélisation moléculaire et expérimentation en réacteur solide/gaz
pour la compréhension de la sélectivité de la lipase B de Candida antarctica

Résumé :
L’objectif de cette thèse était de mieux comprendre les paramètres structuraux et environnementaux gouvernant
l’énantiosélectivité de la lipase B de Candida antarctica (CALB), lors de la résolution des alcools secondaires
linéaires chiraux. Ces composés sont notamment utilisés comme synthons chiraux dans l’industrie
pharmaceutique. Dans un premier temps, une étude systématique des orientations du butan-2-ol et du pentan-2-ol
au sein du site actif a été réalisée par modélisation moléculaire. Les résultats suggèrent l’existence de modes
d’arrimages supplémentaires à ceux mentionnés dans la littérature. La comparaison selon l’énergie potentielle du
substrat des structures les plus stables, combinée à la prise en compte de modes de fixation non productifs, nous
a permis d’expliquer qualitativement l’énantiopréférence de la CALB pour la forme R. A l’aide du réacteur
solide/gaz, nous avons montré que les résidus hydrophobes formant le canal d’accès du substrat au site actif
(Ile189, Leu278 et Ala282), jouaient un rôle significatif dans l’énantiosélectivité de la CALB vis-à-vis des
alcools secondaires. L’influence de la partie alkoxy du donneur d’acyle sur le ratio énantiomérique a également
pu être mise en évidence. Par ailleurs, nous avons montré que des mutations isostériques de la poche
stéréosélective conduisaient à des variations des paramètres thermodynamiques d’activation de l’acylation du
pentan-2-ol, probablement suite à des modifications du réseau de liaisons hydrogène formé entre les résidus de la
poche. Les études d’adsorption de l'eau et des substrats sur l’enzyme immobilisée nous ont permis de relier l'état
d'hydratation de la CALB avec les effets particuliers de l'eau sur l’activité et la sélectivité de l’enzyme.

Mots clés : Lipase B de Candida antarctica, énantiosélectivité, réacteur solide/gaz, modélisation moléculaire
chromatographie gazeuse en phase inverse, alcoolyse, activité thermodynamique


Molecular modeling and experimentation in solid / gas reactor for understanding the
selectivity of lipase B from Candida antarctica
Summary :
The aim of this thesis was to understand more precisely the structural and environmental parameters governing
the enantioselectivity of lipase B from Candida antarctica (CALB), involved in the discrimination of chiral
secondary alcohols enantiomers. These compounds are used in particular for the synthesis of enantiomerically
pure pharmaceutical molecules. Initially a systematic study of the orientation of butan-2-ol and pentan-2-ol in
the active site was performed by molecular modeling. The results suggest the existence of additional binding
modes to those mentioned in the literature. The potential energy comparison of the most stable conformations of
the substrate, combined with the existence of non productive binding modes, allowed us to explain qualitatively
the enantiopreference of CALB for the R form. Using the solid/gas reactor, we have shown that hydrophobic
residues forming the access channel of substrate to the active site (Ile189, Leu278 and Ala282), played a
significant role in the enantioselectivity of CALB towards secondary alcohols. The influence of the alkoxy part
of the acyl donor on the enatiomeric ratio E has also been highlighted. Furthermore, we showed that isosteric
mutations of the stereoselective pocket led to changes in pentan-2-ol activation thermodynamic parameters of
acylation, probably due to changes in the hydrogen bonds network formed between residues of the pocket.
Studies of water and substrates adsorption on the immobilized enzyme allowed us to relate the hydration status
of CALB with specific effects of water on the enzyme activity and selectivity.

Keywords : Candida antarctica lipase B, enantioselectivity, solid/gas reactor, molecular modeling, inverse gas
chromatography, alcoholysis, thermodynamic activity
LIttoral ENvironnement SociétéS (LIENSs) Equipe Biotechnologie Environnementale (BIEN)
UMR 6250, Université de La Rochelle, 2, Rue Olympe de Gouges, 17042 LA ROCHELLE


tel-00541104, version 1 - 29 Nov 2010
tel-00541104, version 1 - 29 Nov 2010Je tiens à remercier en premier lieu le Professeur Sylvain Lamare pour m’avoir
accueillie au sein de son laboratoire, de m’avoir fait confiance tout au long de ces années et
enfin, d’avoir accepté de présider mon jury de thèse.
Je voudrais adresser mes remerciements les plus chaleureux au Professeur Marianne
Graber pour la direction scientifique de ces travaux de thèse, pour sa disponibilité, son
écoute et d’avoir participé à l’écriture de mon manuscrit de thèse. Je tiens à la remercier
sincèrement pour m’avoir permis d’évoluer dans des domaines variés, à l’interface de
l’enzymologie, des biotechnologies, de la chimie et de la bio-informatique, ainsi que pour les
conditions dans lesquelles ces travaux ont pu être réalisés. Par ailleurs je tiens également à
la remercier de m’avoir permis de collaborer avec des laboratoires extérieurs et m’avoir
ainsi permis de rencontrer Per-Olof et Camille.
Je remercie également le Professeur Vinh Tran, de l’Université de Nantes, pour
m’avoir encadré et participé activement à ce travail de recherche. Je le remercie sincèrement
de m’avoir initié à la modélisation moléculaire et de m’avoir transmis une petite partie de ses
compétences en ce domaine.
Je tiens à exprimer ma reconnaissance au Docteur Krystyna Zakrzewska, Directeur de
recherche CNRS, et au Professeur Alain Marty pour avoir fait l’honneur de juger mon travail
et d’en être les rapporteurs. J’associe à ces remerciements Gwénaëlle André-Leroux pour
avoir accepté d’examiner ce travail.
Je remercie tous les membres du laboratoire, collègues et parfois bien plus que ça !
Guillaume et Mika pour les nombreux bons moments passés ensemble, Manu pour nos
discussions en fin journées et ses conseils de chimiste, Hélène et Andrea pour nos petites virés
nocturnes, Pierre et Matthieu pour les goûters mémorables, Nico et Romain pour les séances
de piscine, Virginie, Delphine, Vaness, Hervé, Valérie L., Valérie S. … Et aussi Isabelle
Goubet pour sa grande disponibilité et ses nombreux conseils et Eric pour ses cours de
« moonwalk ». Je remercie également les stagiaires ayant contribués à ces travaux de thèse,
Claire, Cédric, Mickaël et Sylvain, mais aussi à tous les autres stagiaires qui ont contribués à
la bonne ambiance au sein du labo : Azza, Amira, Beby, Romain, Nico, Vincianne, Sofia…
Enfin, tous mes remerciements à tous ceux que je n’ai pas nommés mais qui ont été présents
pour moi pendant ces années.
Evidement, je remercie chaleureusement et sans compter mes parents sans qui mes
années universitaires auraient été beaucoup plus ardues et plus particulièrement, ma mère
pour tous ses petits plats ! Köszönöm. Je remercie également mon chéri pour avoir su
s’adapter à mon rythme de vie et de travail et de m’avoir réconfortée aux moments difficiles.
tel-00541104, version 1 - 29 Nov 2010
tel-00541104, version 1 - 29 Nov 2010






Soyez le premier à déposer un commentaire !

17/1000 caractères maximum.