Nanosphères polymères à couverture de hyaluronate pour la délivrance ciblée de molécules actives dans le traitement des affections du cartilage, Polymer hyaluronat-covered nanoparticules for therapeutic targeting of bioactive compounds in cartilage diseases

De
Publié par

Sous la direction de Edith Dellacherie, Jean-François Stoltz
Thèse soutenue le 14 novembre 2007: Nancy 1
Ce travail de thèse avait pour objectif de développer un système de vectorisation de molécules d’intérêt thérapeutique pour le traitement des pathologies ostéoarticulaires. En effet, les traitements actuels visent plus à traiter les symptômes qu’à enrayer la progression de la pathologie, la difficulté majeure étant la délivrance des molécules et leur adressage. La thématique de recherche a été développée selon deux axes de travail, (1) l’élaboration de systèmes nanoparticulaires, au sein desquels ont été encapsulées différentes molécules (traceur fluorescent, principes actifs) et (2) l’évaluation biologique des systèmes ainsi obtenus sur différents contingents cellulaires. L’originalité de ce travail repose d’une part sur le processus de préparation des nanoparticules mais également sur le recouvrement de leur surface celui-ci étant destiné à renforcer leur tropisme pour les cellules articulaires, les chondrocytes. Nous avons pu, grâce au procédé de synthèse mis au point, préparer différents lots de nanoparticules, encapsulant plusieurs types de molécules, qu’il s’agisse de dextrane FITC (traceur biologique) ou des principes actifs, comme la chondroïtine sulfate ou l’acide hyaluronique. Le choix du recouvrement de surface des nanoparticules par le hyaluronate (HA) a été déterminé par le fait que les cellules chondrocytaires expriment à leur surface un récepteur spécifique du HA, le CD44. Une fois le processus de synthèse et de recouvrement des nanoparticules établi, le travail a consisté à démontrer in vitro l’innocuité des particules (cytocompatibilité, absence d’effets pathogènes, maintien de l’activité de biosynthèse matricielle) et l’intérêt du recouvrement par le HA destiné à favoriser l’internalisation dans les chondrocytes. Après avoir montré la plus forte affinité des nanoparticules recouvertes de HA (en comparaison avec un recouvrement par le poly(alcool vinylique) pour les chondrocytes, nous avons testé le système de vectorisation en injectant nanoparticules chez des animaux sains par voie intraarticulaire infrapatellaire. Les résultats obtenus concernant la cytocompatibilité, l’absence d’effets pathogènes et le maintien de l’activité de biosynthèse ont confirmé ceux observés lors des expériences réalisées in vitro.
-vectorisation
-adressage cellulaire
The aim of the present work was to develop a nanoparticular system of vectorisation of therapeutic interests molecules for the treatment of osteoarticular pathologies. Nowadays, treatments aim more at treating the symptoms that to stop the pathology progress, major difficulty being the release of molecules and their addressing. The objectives of such a research consist on two working axes, (1) the development of nanoparticulaires systems, in which we have encapsulated various molecules (fluorescent tracer, pharmacological compounds) and (2) the evaluation of systems so obtained on different cells contingents. The originality of our work is on one hand the process of preparation of nanoparticles and on the other hand the coating of nanoparticles with HA in order to increase interactions with articular cells, chondrocytes. Thanks to our technique of synthesis, we could prepare different types of nanoparticles, loading several molecules like dextran FITC (biological tracer) or active principles, as the chondroïtin sulphate or hyaluronic acid (HA). The choice of the HA for coated the nanoparticules surface was decided because it is well known that chondrocytes express in their surface a specific receptor of hyaluronique acid, CD44. Once the process of synthesis and the coating of nanoparticles established, our job consisted in showing the harmlessness of particles in vitro (cytocompatibility, lack of pathogenic effects, preservation of the matrix biosynthesis/turnover) and the interest of coating nanoparticules by HA to facilitate the internalisation by chondrocytes. We showed a stronger affinity of nanoparticles covered with HA (versus PVA-coated nanoparticles) for chondrocytes (versus synoviocytes). We also tested our cells targetting system by injecting nanoparticles by intraarticular way at healthy animals. The obtained results confirmed those observed during the in vitro experiments what allows us of validated the concept of vectorization of therapeutic molecules by means of nanoparticular systems for the osteoarticular diseases.
Source: http://www.theses.fr/2007NAN10151/document
Publié le : mardi 25 octobre 2011
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http://www.culture.gouv.fr/culture/infos-pratiques/droits/protection.htm UNIVERSITE HENRI POINCARE - NANCY I
FACULTE DE MEDECINE

ECOLE DOCTORALE « BIOLOGIE SANTE ET ENVIRONNEMENT »



THESE
Présentée et soutenue publiquement le
14 novembre 2007
Pour obtenir le grade de


DOCTEUR DE L’UNIVERSITE HENRI POINCARE – NANCY I


Discipline : Bioingénierie

Par

Hamed LAROUI


NANOSPHERES POLYMERES A COUVERTURE DE HYALURONATE
POUR LA DELIVRANCE CIBLEE DE MOLECULES ACTIVES DANS
LE TRAITEMENT DES AFFECTIONS DU CARTILAGE

JURY

Rapporteurs
Catherine AMIEL Professeur, Paris
Frédéric MALLEIN-GERIN Chargé de recherche, CNRS Lyon

Examinateurs
Edith DELLACHERIE Co-Directeur de Thèse, PU UHP Nancy
Jean-François STOLTZ Co-Directeur de Thèse, PU-PH Nancy
Pierre GILLET PU-PH Nancy
Jean-Claude VOEGEL Directeur de recherche, INSERM Strabourg

Invités
Laurent GROSSIN Chargé de recherche, CNRS Nancy
Elisabeth PAYAN Directeur de recherche, CNRS Nancy
Michèle LEONARD Chargée de recherche, CNRS Nancy

















Remerciements Je tiens à remercier Mme Edith DELLACHERIE, PR UHP, directrice de ma thèse et
Professeur Emérite du Laboratoire de Chimie Physique Macromoléculaire (UMR 7568
CNRS-INPL), pour ses compétences scientifiques et son soutien tant professionnel que
personnel.

Je tiens à remercier M. Jean-François STOLTZ, PU-PH, Co-Directeur de ma thèse et
Professeur du Laboratoire d'Énergétique et de Mécanique Théorique et Appliquée (UMR
7563 CNRS-UHP), pour ses compétences scientifiques et son soutien.

Je remercie M. Patrick NETTER, PU-PH, Directeur de l’UMR 7561 CNRS-UHP, pour son
accueil et son soutien lors de mon travail de thèse.

La partie phisico-chimique de ce travail présenté dans cette thèse a été réalisé au laboratoire
de chimie physique et macromoléculaire, groupe polymère coordonné par Mme Edith
DELLACHERIE, PU. Je remercie Mme Michèle LEONARD, CR CNRS, pour ces
compétences et sa contribution dans ce travail.

La partie biologie a été réalisé au laboratoire dans le groupe « Imagerie et Biomatériaux »
coordonné par M. Pierre GILLET, PU-PH. Je souhaite lui témoigner ma sincère
reconnaissance pour la qualité de son encadrement.
Je remercie M. Laurent GROSSIN, CR CNRS, pour ces compétences et sa contribution à
l’élaboration, la rédaction et la mise en forme de ce travail. Je veux aussi saluer sa patience…

Je suis très sensible à l’honneur que me font Mm. le Pr Catherine AMIEL et Frédéric
MALLEIN-GERIN d’avoir accepté de juger ce travail. Leurs travaux font autorité dans leurs
domaines respectifs et leur jugement sur cette thèse sera particulièrement apprécié.

Merci à M. Dominique DUMAS, pour sa gentillesse et sa disponibilité en microscopie
confocale et à M. Jean François REMY et Luc MARCHAL respectivement du laboratoire des
Sciences du Génie Chimique et celui d'Énergétique et de Mécanique Théorique et Appliquée
pour l’acquisition d’images en microscopie électronique.

Je tiens à remercier Jean-Luc Six, maître de conférence à l’EEIGM, pour m’avoir fait
confiance lors des vacations qu’il m’a confié dans le cadre de l’enseignement de la chimie
macromoléculaire à l’Ecole Européenne d'Ingénieurs en Génie des Matériaux de Nancy.

Merci enfin aux secrétaires et à toutes les personnes des laboratoires concernés, pour leur
disponibilité, leur sympathie et leur courage pour m’avoir supporté durant ces années.
Je tiens particulièrement à saluer Joseph Paquet, pour son aide et son soutien ainsi que pour
ses prises piscicoles, Christel Henrionnet pour sa gentillesse légendaire, Frédéric Vallé pour
son goût prononcé pour la poésie ainsi que tous les autres étudiants et permanents des
laboratoires.






A Famina mon épouse,

A mes parents et ma belle famille,

A Kader,

A M’Hamed, Abdellah, Mohamed, Hadj, Larbi, Mahdjouba, Abed et Chérif

A Noelle, Karim, Sabrina, Ali et Nadège,

A tous mes amis d’hier et d’aujourd’hui,













Je vous dédie cette thèse.
Merci pour votre Amour et votre Soutien














« On choisit pas ses parents, on choisit pas sa famille isit pas non plus les trottoirs de Manille
De Paris ou d'Alger
Pour apprendre à marcher

Est-ce que les gens naissent Egaux en droits
A l'endroit
Où ils naissent
Que les gens naissent
Pareils ou pas »
Maxime Le Forestier



Sommaire

INTRODUCTION 1
CHAPITRE I : GENERALITES & REVUE BIBLIOGRAPHIQUE ........... 5
LA VECTORISATION 5
I. DEFINITION DE LA VECTORISATION................................................... 5
II. LES DIFFERENTS TYPES DE VECTEURS PARTICULAIRES .......... 6
II.1. LES MICROSPHERES ET MICROCAPSULES ..................................6
II.2. LES SYSTEMES NANOPARTICULAIRES.........................................7
II.3. LES VECTEURS MICELLAIRES.....................................................8
II.4. AVANTAGES DE LA VECTORISATION...........................................9
III. LES PRINCIPAUX POLYMERES UTILISES COMME VECTEURS
PARTICULAIRES............................................................................................ 10
IV. LES NANOPARTICULES CŒUR-COURONNE.................................. 12
IV.1. OBJECTIFS ..............................................................................12
IV.2. LA FURTIVITE..........................................................................12
IV.3. LE CIBLAGE .............................................................................13
IV.3.1. L’adressage passif................................................................................................ 14
IV.3.2. L’adressage actif .................................................................................................. 16
IV.4. METHODES D’ELABORATION DE NANOPARTICULES CŒUR-
COURONNE.......................................................................................17
IV.4.1. Auto-assemblage en milieu aqueux, de copolymères amphiphiles organosolubles
.......................................................................................................................................... 17
IV.4.2. Utilisation de copolymères amphiphiles hydrosolubles. ...................................... 18
IV.5. EXEMPLES DE NANOPARTICULES DESTINEES AU CIBLAGE
ACTIF ...............................................................................................19




LE CARTILAGE ARTICULAIRE ET SES PATHOLOGIES..............................21
I. DESCRIPTION DU CARTILAGE ............................................................. 22
I.1. ASPECT MACROSCOPIQUE DU CARTILAGE .................................22
I.2. ASPECT MICROSCOPIQUE DU CARTILAGE..................................22
I.3. RENOUVELLEMENT TISSULAIRE NORMAL24
I.4. LES CONSTITUANTS DU CARTILAGE, PROPRIETES ET FONCTIONS
.........................................................................................................24
I.4.1. Les chondrocytes..................................................................................................... 24
I.4.2. La matrice extracellulaire....................................................................................... 25
I.4.3. Les fibres de collagène............................................................................................ 26
I.4.4. Les protéoglycanes.................................................................................................. 27
II. LES PATHOLOGIES ET LEURS TRAITEMENTS :.............................30
II.1.1. Les lésions chondrales........................................................................................... 31
II.1.2. Les lésions ostéochondrales .................................................................................. 31
II.2. LES TRAITEMENTS DE REPARATION DU CARTILAGE ................31
II.2.1. Les traitements pharmacologiques........................................................................ 31
II.2.2. Les techniques chirurgicales de réparation du cartilage...................................... 33
II.2.2.1. Les techniques de réparation par stimulation locale du tissu ostéogénique ... 33
II.5.2.2. Les techniques d’auto ou allogreffe de tissu cartilagineux mature ................ 34
II.2.2.3. Les techniques d’auto ou allogreffe de tissu cartilagineux immature à capacité
chondrogénique ............................................................................................................ 36
II.2.2.4. Les matériaux de comblement........................................................................ 37
III. CONCLUSION DU CHAPITRE ............................................................. 41










CHAPITRE II : SYNTHESE ET CARACTERISATION DES
HYALURONATES AMPHIPHILES.............................................................. 49
I. GENERALITES SUR LE HYALURONATE ............................................ 50
I.1. STRUCTURE CHIMIQUE ET ORIGINE DU HA...............................50
I.1.1. Structure chimique .................................................................................................. 50
I.1.2. Origine et production.............................................................................................. 51
I.2. PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES ............................................52
I.2.1. Structure.................................................................................................................. 52
I.2.2. Propriétés physico-chimiques du HA en solution aqueuse..................................... 53
I.3. PROPRIETES BIOLOGIQUES........................................................54
I.4. PRINCIPALES APPLICATIONS DU HA .........................................57
I.4. MODIFICATION CHIMIQUE DU HYALURONATE :........................58
II. MATERIELS ET METHODES ................................................................. 59
II.1. METHODES CHIMIQUES ...........................................................59
II.1.1. Le hyaluronate parent : ......................................................................................... 59
II.1.2. Protocole général de synthèse des hyaluronates modifiés :.................................. 59
II.1.3. Mise au point de la synthèse.................................................................................. 60
II.1.4. Nomenclature : .................................................................................................. 61
II.2. METHODES DE CARACTERISATION DES DIFFERENTS PRODUITS:
.........................................................................................................62
II.2.1. Mesure des masses molaires.................................................................................. 62
II.2.1.1. Rappels sur théorie de la diffusion de lumière ............................................... 62
II.2.1.2. Equipements : ................................................................................................. 63
II.2.1.3. Conditions expérimentales : ........................................................................... 64
II.2.2. Détermination des taux de substitution :............................................................... 64
II.2.2.1. Dosage des C par chromatographie en phase gazeuse .................................. 65 n
II.2.2.2. Dosage des -CH -CH -Phe par spectroscopie UV ......................................... 66 2 2
1II.2.3. Etude, par RMN H, de la pureté des polymères préparés.................................... 66
II.2.4. Viscosimétrie ......................................................................................................... 67 II.2.5. Tensiométrie .......................................................................................................... 68
III. SYNTHESE ET CARACTERISATION DES HA AMPHIPHILES .... 71
III.1. SYNTHESE DES HA AMPHIPHILES : HAC (N = 6 ET 12) ET N
HAPHE ............................................................................................72
III.2. ETUDE DE LA STABILITE DU SQUELETTE DE HA AU COURS DE
LA MODIFICATION CHIMIQUE : .......................................................73
III.2.1. Rappel des résultats déjà obtenus au LCPM sur la dégradation du HA au cours
de la synthèse ................................................................................................................... 73
II.2.2. Résultats obtenus au cours de ce travail ............................................................... 73
III.3. CARACTERISATION CHIMIQUE : DETERMINATION DES TAUX DE
SUBSTITUTION EN GROUPES HYDROPHOBES ...................................74
III.3.1 Dosage des chaînes C par chromatographie en phase gazeuse (CPG) .............. 74 n
III.3.2. Dosage des groupements –CH -CH -Phe par spectroscopie UV ........................ 76 2 2
III.3.3. Conclusion............................................................................................................ 78
III.4. PROPRIETES PHYSICOCHIMIQUES EN SOLUTION AQUEUSE....79
III.4.1. Etude par viscosimétrie capillaire ....................................................................... 79
III.4.1.1. Principe et choix du solvant .......................................................................... 79
III. 4.1.2. Résultats et discussion.................................................................................. 80
III.4.2. Etude par tensiométrie ......................................................................................... 81
III.4.2.1. Généralités..................................................................................................... 81
III.4.3.2. Résultats ........................................................................................................ 82
III.4.2.3. Conclusion 85
IV. CONCLUSION DU CHAPITRE .............................................................. 88










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