Procédés de cultures de cellules VERO en milieu sans sérum : contributions au développement d'une stratégie PAT, Vero cell culture processes in serum-free medium : contributions to the development of the PAT strategy

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Sous la direction de Annie Marc
Thèse soutenue le 06 novembre 2009: INPL
Ce travail apporte une contribution au développement de la stratégie PAT pour les procédés de culture de cellules animales. Il propose l'amélioration de la compréhension et de la maîtrise de la culture de cellules Vero, dédiées à la production de vaccins viraux, et cultivées sur microporteurs dans un milieu sans sérum. Une première partie a permis de cribler les effets de certains groupes de composés du milieu de culture par le suivi de la croissance en microplaques. Puis, des études cinétiques et métaboliques plus approfondies, réalisées en spinners, ont montré que le métabolisme carboné des cellules Vero est saturé par l'accumulation intracellulaire de pyruvate et qu’il est peu orienté vers la croissance. Alors que le renouvellement du milieu ou l'ajout ponctuel de glutamine amélioraient la croissance cellulaire sans ré-équilibrer le métabolisme, la substitution du glucose et de la glutamine a permis de réduire l’apoptose et d'améliorer les performances métaboliques et de croissance. Par ailleurs, les spectroscopies diélectrique et proche-infrarouge ont été évaluées pour le contrôle en-ligne du procédé, en prenant en compte les particularités des cellules adhérentes. Nous avons montré leur capacité à évaluer les concentrations de cellules, de composés du milieu, et à détecter l'apoptose. Enfin, les principales améliorations par substitution de la glutamine ont été appliquées en bioréacteurs, à la production d'un vaccin prototype contre la dengue, dans des conditions proches de celles d'un procédé industriel. Ceci a permis de limiter les renouvellements de milieu pendant l’expansion cellulaire, sans compromettre la production de particules virales infectieuses
-Procédé de culture de cellules animales
-Cellules Vero adhérentes
-Milieu sans sérum
-Stratégie PAT
-Spectroscopies en-ligne
-Métabolisme et mort cellulaires
This work contributes to the development of the PAT strategy for animal cell culture processes. The aim of this study was to improve the understanding and the control of Vero cell culture, dedicated to the production of viral vaccines, and grown on microcarriers in serum-free medium. An initial study was performed to screen the effects of certain groups of compounds of the culture medium, by the cell growth monitoring in microplates. Then, kinetic and metabolic studies conducted in spinners flasks allowed to go further and to show that the Vero cell metabolism is saturated through the pyruvate intracellular accumulation and that it is not oriented toward growth. While media renewal or punctual addition of glutamine improve the cell growth without improving the metabolism balance, the substitution of glucose and glutamine allowed to reduce apoptosis and to improve growth and metabolic performances.Furthermore, dielectric and near-infrared spectroscopies have been evaluated for the in-line process monitoring, taking into account the particularities of adherent cells. We have demonstrated their ability to quantify cell concentrations, medium component concentrations, and to detect apoptosis. Finally, major improvements by substitution of glutamine have been applied to bioreactor culture to produce a dengue vaccine prototype, with culture conditions close to industrial process. In these cases, medium renewal during the cell expansion was removed without compromising the production of infectious viral particles
-Animal cell culture process
-Vero adherent cells
-Serum-free medium
-PAT strategy
-In-line spectroscopies
-Cell metabolism
-Cell death
Source: http://www.theses.fr/2009INPL071N/document
Publié le : jeudi 27 octobre 2011
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INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE
Ecole Nationale Supérieure d’Agronomie et des Insdustries Alimentaires (ENSAIA)
Ecole doctorale Ressources Procédés Produits Environnement (RP2E)
Laboratoire des Sciences du Génie Chimique (LSGC)

THESE
Présentée à l’INPL par

Emma PETIOT
En vue d’obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE
Spécialité : Procédés Biotechnologiques et Alimentaires




PROCEDES DE CULTURES DE CELLULES VERO
EN MILIEU SANS SERUM :
Contributions au développement d’une stratégie PAT.


Soutenue publiquement le 6 novembre 2009
devant la commission d'examen





Membres du jury
Président du Jury : Pascal SOMMER Directeur de Recherche CNRS, IBCP, Lyon
Rapporteurs : Amine KAMEN Professeur, IRB-CNRC, Montréal
Otto MERTEN Responsable bioprocédés, Généthon, Evry
Examinateurs : Noël DETRAZ Responsable développement industriel, Mérial, Lyon
nnie MARC Directeur de Recherche CNRS, LSGC, Nancy A
Hervé PINTON Directeur Global Technologies Innovation, Sanofi-pasteur,
Marcy L'Etoile
Invitée : Cécile GENY Chef de projet, Sanofi-pasteur, Marcy L'Etoile
INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE
Ecole Nationale Supérieure d’Agronomie et des Insdustries Alimentaires (ENSAIA)
Ecole doctorale Ressources Procédés Produits Environnement (RP2E)
Laboratoire des Sciences du Génie Chimique (LSGC)

THESE
Présentée à l’INPL par

Emma PETIOT
En vue d’obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE
Spécialité : Procédés Biotechnologiques et Alimentaires




PROCEDES DE CULTURES DE CELLULES VERO
EN MILIEU SANS SERUM :
Contributions au développement d’une stratégie PAT.


Soutenue publiquement le 6 novembre 2009
devant la commission d'examen





Membres du jury
Président du Jury : Pascal SOMMER Directeur de Recherche CNRS, IBCP, Lyon
Rapporteurs : Amine KAMEN Professeur, IRB-CNRC, Montréal
Otto MERTEN Responsable bioprocédés, Généthon, Evry
Examinateurs : Noël DETRAZ Responsable développement industriel, Mérial, Lyon
nnie MARC Directeur de Recherche CNRS, LSGC, Nancy A
Hervé PINTON Directeur Global Technologies Innovation, Sanofi-pasteur,
Marcy L'Etoile
Invitée : Cécile GENY Chef de projet, Sanofi-pasteur, Marcy L'Etoile




A deux petits anges,





Remerciements

Les travaux de cette thèse ont été réalisés au Laboratoire des Sciences du Génie Chimique de Nancy, au
sein du groupe « Génie des Procédés Biotechnologiques et Alimentaires », c’est pourquoi je tiens à
remercier Mr Michel Sardin de m’y avoir acceuillie. Je souhaite aussi exprimer ma profonde
reconnaissance à Mme Annie Marc et Mr Hervé Pinton pour leur encadrement et leurs conseils
scientifiques, mais aussi pour la confiance et l’autonomie qu’ils m’ont accordée tout au long de cette
thèse.

J’adresse mes sincères remerciements à Mr. Pascal Sommer de m’avoir fait l’honneur d’accepter de
présider mon jury de thèse ainsi que à Mr. Amine Kamen et Mr. Otto Merten d’avoir accepté de juger
ces travaux. Je souhaite aussi remercier Mr Noël Detraz pour sa participation à mon jury de thèse.

Je tiens aussi à remercier tous les membres des équipes « Dengue » de Sanofi pasteur pour leur aide
précieuse, et en particulier Laetitia, Gabriel, Fleurine, Isabelle, Mounir pour leur disponibilité et leur
participation active à ce travail. Je souhaite aussi remercier tout particulièrement Cécile Gény, Thierry
Magadoux et Isabelle Bernard qui m’ont suivie et encadrée.

Ces trois années de thèse ont représenté pour moi une transition sur bien des plans, c’est pourquoi,
mes pensées vont aux personnes qui ont marquées cette période. En premier lieu, un grand merci à mes
collèges de travail, actuels et passés pour m’avoir acceptée, écoutée (et peut être supportée), et parmi
eux, je tiens à remercier tout particulièrement Naziha, Eric O., Marie W., Jean-Mathieu, Frédérique,
Marie-Françoise, Mathilde, Caroline… Merci surtout à Fabrice Blanchard et ses perpétuels « thésards et
thésardes préférés », et qui entre autre, m’a initiée à la culture en réacteur…
Mes pensées vont aussi à mes amis proches, toujours présents à mes côtés et qui m’ont accompagnée
tout au long de ce périple. Une petite pensée pour mes compagnes de galère durant ces derniers mois,
Laure et Maia, probablement aussi entrain d’écrire leurs remerciements, mais aussi à tous les autres qui
m’ont permis de temps à autres de m’échapper de ce « grand froid nancéen », Paulo, Kloé, Ché, Mathieu,
Pauline, Alban, Charlotte… sans oublier tous ceux qui m’ont aidée à le supporter ici, Sophie, Christophe,
Greg, Georges, Apo… Je pense aussi très fort à ma famille qui a été présente quand j’en avais le plus
besoin et surtout à ma mère, qui m’a écoutée et soutenue dans les moments difficiles...

Enfin, je tiens à remercier une personne qui a véritablement beaucoup comptée et a marquée cette
période, et qui j’espère, marquera la prochaine, Eric.

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