Production et purification d'acide férulique estérases. Application à la synthèse d'esters phénoliques, Production and purification of ferulic acid esterases. Application to the synthesis of phenolic esters

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Sous la direction de Michel Girardin, Stéphane Delaunay
Thèse soutenue le 25 octobre 2007: INPL
L’induction de la synthèse d’une acide férulique estérase (AFE) a été étudiée chez Streptomyces ambofaciens ATCC 23877. L’activité la plus élevée a été détectée en présence de son de blé désamidonné ou de xylane d’avoine (0,22, 0,21 mU/mg protéine, respectivement). Des productions d’AFE en bioréacteur ont également été réalisées en utilisant 1% (p/v) de son de blé comme inducteur. Le niveau de production de l’AFE a été trois fois plus important en bioréacteur qu’en fiole d’Erlenmeyer. L’AFE de Streptomyces ambofaciens ATCC 23877 et celle de Humicola sp., présente dans un mélange enzymatique commercial (DepolTM 740L), ont été partiellement purifiées et caractérisées. A l’issue de la purification, l’activité AFE de Streptomyces ambofaciens ATCC 23877 a été trop faible pour pouvoir être utilisée ultérieurement en synthèse. Par contre, le potentiel de l’AFE de Humicola sp., concentrée par précipitation à l’acétone, pour la synthèse de différents esters phénoliques a été testé. Les meilleurs rendements de conversion ont été observés lors de l’absence de substitutions sur le cycle aromatique de l’acide phénolique ou en présence de groupements hydroxyles. Les synthèses en milieu non aqueux (M2B2) se sont montrées infructueuses en raison, peut-être, d’un effet néfaste du solvant sur l’enzyme
-Acide férulique estérase
-Streptomyces ambofaciens
-Purification partielle
-Induction
-Humicola sp.
-Estérification enzymatique
-Acides phénoliques
The induction of the ferulic acid esterase (FAE) synthesis was studied with Streptomyces ambofaciens ATCC 23877. The highest activity was detected in the presence of either destarched wheat bran or oat spelt xylan (0,22, 0,21 mU/mg protein, respectively). FAE productions in bioreactor were also carried out using 1% (w/v) of wheat bran as inducer. The FAE production level was three times higher in bioreactor than in Erlenmeyer flask. FAE of Streptomyces ambofaciens ATCC 23877 and that of Humicola sp., present in an enzymatic commercial mixture (DepolTM 740L), were partially purified and characterised. At the end of the purification, FAE activity of Streptomyces ambofaciens ATCC 23877 was too weak to be used later in synthesis. However, the FAE potential of Humicola sp., concentrated by acetone precipitation, for the synthesis of various phenolic esters was tested. The best conversion yields were observed in the absence of substitution on the phenolic acid aromatic cycle or in the presence of hydroxyl groups. The synthesis in non-aqueous medium (M2B2) were unsuccessful maybe because of an harmful effect of the solvent on the enzyme
-Ferulic acid esterase
-Phenolic acids
-Enzymatic esterification
-Induction
-Streptomyces ambofaciens
-Humicola sp.
-Partial purification
Source: http://www.theses.fr/2007INPL075N/document
Publié le : mardi 25 octobre 2011
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http://www.culture.gouv.fr/culture/infos-pratiques/droits/protection.htm
INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE
Ecole Nationale Supérieure d’Agronomie et des Industries Alimentaires

Ecole doctorale : Ressources Procédés Produits Environnement


THESE
présentée à l’INPL par


Fadi KHEDER


pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE

Spécialité : Procédés Biotechnologiques et Alimentaires



Production et purification d’acide férulique estérases.
Application à la synthèse d’esters phénoliques




Soutenue publiquement le 25 octobre 2007 devant la commission d’examen




Rapporteurs : M. Eric DUBREUCQ : Professeur
M. Pierre VILLENEUVE : Chargé de Recherche (HDR)

Examinateurs : M. Armand GUCKERT : Professeur
M. Sylvain GUYOT : Chargé de Recherche (HDR)
M. Michel GIRARDIN : Professeur (directeur de thèse)
M. Stéphane DELAUNAY : Maître de conférences (co-directeur de thèse)
M. Lionel MUNIGLIA : Maître de conférences (co-directeur de thèse, invité)
INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE
Ecole Nationale Supérieure d’Agronomie et des Industries Alimentaires

Ecole doctorale : Ressources Procédés Produits Environnement


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Fadi KHEDER


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DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE

Spécialité : Procédés Biotechnologiques et Alimentaires



Production et purification d’acide férulique estérases.
Application à la synthèse d’esters phénoliques




Soutenue publiquement le 25 octobre 2007 devant la commission d’examen




Rapporteurs : M. Eric DUBREUCQ : Professeur
M. Pierre VILLENEUVE : Chargé de Recherche (HDR)

Examinateurs : M. Armand GUCKERT : Professeur
M. Sylvain GUYOT : Chargé de Recherche (HDR)
M. Michel GIRARDIN : Professeur (directeur de thèse)
M. Stéphane DELAUNAY : Maître de conférences (co-directeur de thèse)
M. Lionel MUNIGLIA : Maître de conférences (co-directeur de thèse, invité)

Remerciements

J’exprime mes remerciements les plus sincères à Monsieur le Professeur Michel
Girardin pour m’avoir donné la possibilité de réaliser ce travail ainsi que pour son
encadrement et ses conseils. Je remercie également Messieurs Stéphane Delaunay et
Lionel Muniglia, Maîtres de Conférence à l’ENSAIA, pour leur amitié et pour avoir
suivi et co-dirigé cette thèse.

Je remercie Monsieur Eric Dubreucq, Professeur à l’Université de Montpellier et
Monsieur Pierre Villeneuve, Chargé de Recherche au CIRAD de Montpellier, qui ont
accepté de juger ce travail de thèse en qualité de rapporteurs. Je remercie également
Messieurs Sylvain Guyot, Chargé de Recherche à l’INRA et Armand Guckert,
Professeur à l’ENSAIA, pour avoir accepté d’examiner ce travail.

Je tiens à exprimer mes plus sincères remerciements à mon frère Ghassan Abo
Chameh, qui a participé à la réalisation de ce travail de thèse en qualité d’étudiant en
Mastère, pour son soutien, sa disponibilité, ses idées et ses conseils contribuant toujours
à enrichir cette recherche.

Je remercie également Mesdames Catherine Humeau et Bernadette Piffaut ainsi
que Monsieur Bernard Rovel (Maîtres de Conférence) et surtout Marie-Noëlle
Stutzmann (adjoint technique) et tous les autres membres du Laboratoire Biocatalyse
Bioprocédés à l’ENSAIA pour leur amitié, leur encouragement et leur soutien au cours
de ces années.

Je remercie tout particulièrement le gouvernement syrien d’avoir financé ces
travaux de thèse ainsi que mes Professeurs à la Faculté des Sciences à Damas
notamment Madame le Professeur Haifa Al-Azmeh.

Finalement, je tiens à remercier ma famille ainsi que tous mes amis en France et
en Syrie pour leur amitié et leur encouragement sans limite.
SOMMAIRE GENERAL

Introduction………………………………………………………………………….. 1

Chapitre 1. Synthèse bibliographique
I. Rôle naturel des acide férulique estérases……………………………………….. 3
II. Les acide férulique estérases……………………………………………………. 17
III. Les Streptomyces ……………………………………………………………... 39
IV. Synthèse d’esters par voie enzymatique : une utilisation récente des acide
férulique estérases………………………………………………………………….. 43

Objectifs de l’étude…………………………………………………………………... 55

Chapitre 2. Matériels et méthodes
I. Sources d’acide férulique estérases...…………………………………………… 57
II. Produits chimiques……………………………………………………………… 58
III. Composition et préparation des milieux de culture……………………….…… 60
IV. Conditions de culture…………………………………………………………... 62
V. Mesure de l’activité acide férulique estérase…………………………………… 66
VI. Protocole de purification des acide férulique estérases………………………... 68
VII. Méthodes analytiques…………………………………………………………. 72
VIII. Protocoles des synthèses enzymatiques……………………………………… 80

Chapitre 3. Production et purification partielle de l’acide férulique estérase de S.
ambofaciens ATCC 23877
I. Choix des conditions d’induction de la synthèse d’acide férulique estérase par S.
ambofaciens ATCC 23877……………………………………………….………… 82
II. Production de l’acide férulique estérase par S. ambofaciens ATCC 23877……. 111

Chapitre 4. Purification partielle de l’acide férulique estérase de Humicola sp.
TMI. Détection de l’activité acide férulique estérase dans le Depol 740L………….. 121
TM II. Purification partielle de l’acide férulique estérase présente dans le Depol
740L………………………………………………………………………………... 122 Chapitre 5. Caractérisation partielle des acide férulique estérases
1. Influence de l’acide férulique sur l’activité acide férulique estérase de S.
ambofaciens ATCC 23877………….…………………...……………………….… 131
2. Effet du pH et de la température……….………………………………………... 132
3. Spécificité de substrat des acide férulique estérases….…………………………. 134

Chapitre 6. Utilisation des acide férulique estérases en synthèse
I. Utilisation de l’acide férulique estérase de S. ambofaciens ATCC 23877 en
synthèse....………………………………………………………………………….. 139
II. Utilisation de l’acide férulique estérase de Humicola sp. en synthèse…….…… 140

Conclusions et perspectives ………………………………………………………… 157

Annexe……………………………………………………………………………….. 162

Références bibliographiques………………………………………………………... 164

















Abréviations

ABC : acide bicinchoninique
AF : férulique
AFE : acide férulique estérase
ASB : albumine sérique bovine
CEA : chromatographie échangeuse d'anions
CEC : chromatographie échangeuse de cations
CEI : chromatographie échangeuse d'ions
CIH : chromatographie d’interactions hydrophobes
CLHP : chromatographie liquide à haute performance
DMF : N,N-diméthylformamide
DX : dextrines blanches
FE : férulate d’éthyle
FM : fe méthyle
GL : glucose
kDa : kilo Dalton
M B: 2-méthylbutan-2-ol 2 2
MOPS : 3-(N-morpholino)propanesulfonique
PB : pectine de betterave
rpm : rotation par minute
SA : sulfate d’ammonium
SB : son de blé désamidonné
SDS-PAGE : sodium dodécyle sulfate- électrophorèse sur gel de
polyacrylamide
SM : son de maïs désamidonné
TC : tourteau de colza
TEMED : (N,N,N',N'-tétraméthyléthylènediamine)
TFA : acide trifluoroacétique
Tris : Tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane
U : unité enzymatique
UV : ultraviolet
XA : xylane d’avoine





Introduction























Introduction

La paroi cellulaire végétale est une des sources d’énergie renouvelable les plus
abondantes sur la terre (Crepin et al., 2003b). Elle est constituée d’un mélange de
polymères hétérogènes comprenant la cellulose, la lignine, les hémicelluloses et les
pectines. Des composés phénoliques, tels que les acides hydroxycinnamiques (par
exemple, l’acide férulique, l’acide caféique, l’acide p-coumarique) sont également liés à
ces polysaccharides par des liaisons esters (Kroon et al., 2000). Un de leurs rôles est
probablement de diminuer la biodégradabilité de la paroi par les micro-organismes
(Mastihuba et al., 2002).
Aussi, pour obtenir une dégradation complète de la paroi végétale les micro-
organismes emploient une batterie d’enzymes spécifiques dont notamment les acide
férulique estérases (AFE). Ces enzymes hydrolysent les liaisons esters formées entre les
acides hydroxycinnamiques, surtout l’acide férulique, et les résidus d’arabinose ou de
galactose des polysaccharides.

Au cours des dernières années, plusieurs AFE ont été identifiés chez une grande
variété de champignons et à un degré moindre chez les bactéries.

Aujourd’hui, les AFE trouvent plusieurs domaines d’applications industrielles
notamment pour la production d’acides hydroxycinnamiques à partir des déchets
agroalimentaires. Ces acides phénoliques, en particulier l’acide férulique, sont connus
pour leurs propriétés intéressantes et tout particulièrement pour leur pouvoir
antioxydant. Cependant, leur faible solubilité en phase grasse limite leur utilisation dans
les produits alimentaires lipidiques (pour la stabilisation d’acides gras par exemple). La
meilleure solution pour effacer ce désavantage est de modifier la structure de ces
composés via l’estérification par des alcools aliphatiques conduisant à la formation de
dérivés plus lipophiles (Stamatis et al., 2001).

Généralement, les lipases sont très utilisées pour ce type de transformation mais
elles sont, la plupart du temps, incapables de catalyser l’estérification lorsque le donneur
d’acyle aromatique possède une fonction donneuse d’électron conjuguée à la fonction
1carboxylique, c’est le cas de certains acides phénoliques substitués tels que l’acide
férulique et l’acide caféique (Guyot et al., 1997 ; Stamatis et al., 1999 ; Enaud, 2004).
Aussi, une des solutions pour synthétiser des esters d’acides cinnamiques serait
certainement de faire appel à des enzymes plus spécifiques que les lipases à savoir les
AFE.
C’est ainsi que le potentiel synthétique de ces biocatalyseurs en milieu hydro-
organique attire actuellement l’attention d’un grand nombre de chercheurs et notamment
ceux de notre laboratoire. Toutefois, cette approche est rendue difficile par la faible
disponibilité commerciale des ces enzymes.

Ce travail de thèse a donc été entrepris dans le but d’une part de mettre au point la
production d’AFE par des micro-organismes notamment des bactéries et d’autre part de
comparer ses propriétés catalytiques avec celles d’une AFE de champignon purifiée à
partir d’un mélange enzymatique industriel.




















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