Réplication de l'ADN mitochondrial : identification d’une seconde activité ADN polymérase dans la mitochondrie de S.cerevisiae et Contribution à l’étude du réplisome mitochondrial

De
Publié par

Sous la direction de Michel Castroviejo
Thèse soutenue le 21 décembre 2009: Bordeaux 2
Au cours de la croissance des levures, la cellule doit dupliquer sont génome nucléaire et mitochondrial, le processus de réplication est bien moins étudié dans les mitochondries. Néanmoins, si de multiples ADN polymérases sont impliquées dans les processus de réplication et de réparation dans le noyau, il est considéré jusqu’à aujourd’hui qu’une seule ADN polymérase est impliquée dans ces processus dans la mitochondrie. Des résultats récents mettent en exergue le fait que la situation est bien plus compliquée qu’il n’y apparait au départ. Pour élucider le processus de réplication dans la mitochondrie de levure, j’ai focalisé mon intérêt à tenter de purifier et de caractériser le complexe de réplication. Ce travail était important à développer étant donné la découverte au laboratoire d’une seconde ADN polymérase supplémentaire à la polymérase gamma, dans les mitochondries de levure. Une première partie de ma thèse a été de m’investir afin d’obtenir suffisamment de protéines dans le but d’une identification par spectrométrie de masse, compte tenu de la faible proportion des ADN polymérases dans la cellule et en particulier dans la mitochondrie. Nous avons démontré que cette polymérase est codée par le gène unique POL1. Par des techniques d’ultracentrifugation et d’analyse biochimiques, j’ai réussi à isoler et caractériser un complexe de réplication mitochondrial. Des techniques d’exclusion chromatographiques ont permis d’attribuer une masse native à ce complexe. Sa composition a été étudiée grâce à des colonnes ioniques et hydrophobes, une autre méthode d’analyse repose sur l’utilisation de colonnes d’affinité afin de reconstituer in-vitro les interactions existant entre plusieurs protéines présumées impliquées. Ainsi, un réseau d’interactions impliquant les deux ADN polymérases mitochondriales avec cinq autres protéines a été reconstitué. La masse native de différentes formes stables de ce complexe se situent à 500 kDa ou au-delà de 1 MDa.
-ADN polymérase
-Réplisome
-Mitochondrie
-Réplication
-Complexe protéique
During yeast growth, cells must duplicate their nuclear and mitochondrial DNA. The replication process involved is less studied in mitochondria. Nevertheless, if multiple DNA polymerases are implicated in the nuclear replication and repair mechanisms, until now it is believed that only one DNA polymerase is involved in these processes in mitochondria. Recent results pointed out that the situation is more complicated than preliminary believed. To elucidate the replication process in yeast mitochondria I focused my interest in attempts to purify and characterize the replication complexes. This work was important to develop in accord with the discovery in the laboratory of a second DNA polymerase in addition to the polymerase gamma in yeast mitochondria. One first part of my thesis was to hardly purify enough of this enzyme to be allowed to identify it by mass spectrometry as the DNA polymerase alpha, encoded by the unique POL1 gene. By ultracentrifugation and biochemical techniques, I succeeded to purify the complex. Exclusion chromatographies were managed to elucidate the native mass of this complex. In addition ionic and hydrophobic chromatographic columns were carried out to determine its composition. Another way to study the complex was the reconstitution in vitro of the interactions happening with some usual suspect proteins with the help of chromatographic affinity columns. I reconstituted partly an interactions model network, including the two mitochondrial DNA polymerases and 5 others proteins implicated in replication. I determined the mass of different stable forms of the isolated complexes, around 500 kDa and over 1 MDa
-DNA polymerase
-Replisome
-Mitochondria
-Replication complex
Source: http://www.theses.fr/2009BOR21689/document
Publié le : lundi 31 octobre 2011
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Université Victor Segalen Bordeaux 2

Année 2009

Thèse n°1689

THÈSE

pour le

DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2

Mention : Sciences Biologiques et Médicales
Option : Biologie-Santé


Présentée et soutenue publiquement
Le 21 décembre 2009
Par Christophe VELOURS
Né(e) le 22 juillet 1982 à Talence


REPLICATION DE L’ADN MITOCHONDRIAL
Identification d’une seconde activité ADN polymérase dans la
mitochondrie de S.cerevisiae
et
Contribution à l’étude du réplisome mitochondrial



Membres du Jury

Mr le Professeur Serge ALZIARI ...........................................................Rapporteur
Mr le Docteur Jean-Michel ROSSIGNOL..............................................Rapporteur
Mme le Docteur Colette SAILLARD .....................................................Examinateur
Mr le Professeur Michel RIGOULET.....................................................Président du jury
Mr le Docteur Michel CASTROVIEJO..................................................Directeur de Thèse




1Table d’abréviations
8-hydroxyguanine : 7,8-Dihydro-8-oxoguanine
AD : Domaine d’Activation
ADN : Acide DésoxyriboNucléique
ADNmt : Acide DésoxyriboNucléique mitochondrial
ADP : Adénosine diphosphate
ANCP : Adenine Nucleotide Carrier protein
APAF1 : Apoptotic Protease Activating Factor 1
APS : Ammonium PerSulfate
ARN : Acide RiboNucléique
ARS : Séquences de Réplication Autonome
ATP : Adénosine TriPhosphate
AZT-TTP : Azidothymidine
BER : Base Excision Repair
BN-PAGE : Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis
BRCT : Brca1 C-terminal
BSA : Bovine Serum Albumin
CHAPS : 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propanesulfonate
CN-PAGE : Clear Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis
CPD : Cyclobutane Pyrimidine Dimers
CSBs : Conserved Sequence Blocks
dATP : DésoxyAdénine 5'-TriPhosphate
DBD : DNA Binding Domain
dCTP : désoxyCytidine 5'-TriPhosphate
DDSA : Dodecenyl Succinic Anhydride
dGTP : Désoxyguanosine triphosphate
DMP30 : Tris-2,3,6-(dimethylaminomethyl)phenol
dNTP : Deoxyribonucleoside triphosphate
DO : Densité Optique
DOA : Atrophies Optiques Dominantes
dRP : désoxyribose phosphate
DSP : Dithiobis(Succinimidyl Propionate)
dTTP : désoxyThymidine Triphosphate
DSO : Origine Double Brin
DTT : Dithiothréitol
ESI : ElectroSpray Ionization
EDTA : Ethylène diamine tétraacétique
EGTA : Ethylene Glycol Tetraacetic Acid
FapyG : 2,6-Diamino-4-hydroxy-5-formamidopyrimidine
FEN1 : Flap endonucléase 1
FPLC : Fast protein liquid chromatography
G6PDH : Glucose-6-phosphate déshydrogénase
GFP : Green Fluorescent Protein
GST : Glutathione-S-Transferase
HA : Hemagglutinin
HCA : Hydrophobic Cluster Analysis
HMG : High Mobility Group
HSP : Heavy Strand Promotor IgG : Immunoglobuline G
LC-MS/MS : Liquid Chromatography MS/MS
LHON : Leber Hereditary Optic Neuropathy
LSP : Light Strand Promotor
LP-BER : Long Patch Excision Repair
MALDI : Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization
MCM : MiniChromosomal Maintenance
MNA : Methylnorbornène-2,3-dicarboxylic anhydre
MRP : Mitochondrial RNA Processing
MS/MS : Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry
MTS : Mitochondrial Targeting Sequence
NADH : Nicotinamide adénine dinucléotide
NADPH : Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate
NARP : Neuropathie Ataxie Rétinite Pigmentaire
NEM : N-éthylmaléimide
NER : Nucleotide Excision Repair
NHEJ : Non homologuous End Joining
NI : Non Identifiée
ORC : Origin Replication Complex
ORF : Open Reading Frame soit cadre ouvert de lecture
PCNA : Proliferating Cell Nuclear Antigen
PCR : Polymerase Chain Reaction
PEG : Polyéthylène Glycol
PEO : Ophthalmoplégies Externes Progressives
Pi : Phosphate inorganique
PIP : PCNA-interacting-protein
PMSF : PhenylMethylSulphonyl Fluoride
Pol : ADN polymérase
PTH : PhénylThioHydantoïne
PVDF : Polyvinylidene Fluoride
ROS : Reactive Oxygen Species
RPA : Replication Protein A
RT-PCR : Real-time PCR
SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
SP : Sulfopropyl
SP-BER : Short Patch Excision Repair
SPDP : N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)-propionate
SSB : ADN simple brin
SV40 : Simian Virus 40
SYNM : asparaginyl-ARNt synthétase
TAPTAG : Tandem-Affinity Purification tag
TCA : Trichloroacetic acid
TEMED : N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine
TEV : Tobacco Etch Virus
Thymine glycol : 5,6-dihydro-5,6-dihydroxythymine
TIM : Transport Inner Membrane
TLS : TransLesion Synthesis
TOF : Time-Of-Flight
TOM : Transport Outer membrane
Topo : ADN topoisomérase UBM : Ubiquitin-Binding Motif
UBZ : Ubiquitin-Binding Zinc Finger
UV : Ultra-Violets
VDAC : Voltage-Dependent Anion Channel
X-Gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside INTRODUCTION GENERALE
I- LA MITOCHONDRIE. ....................................................................................................... 6
I.1- L’origine de la mitochondrie : l’endosymbiose._______________________________________________ 6
I.2- présentation de la mitochondrie.___________________________________________________________ 8
I.3- L’ADN mitochondrial. _________________________________________________________________ 11
I.3.1- Taille et structure. ____________________________________________________________ 11
I.3.2- Les gènes. __________________________________________________________________ 13

II- LES MALADIES MITOCHONDRIALES. ................................................................... 14
II.1- Mutations de gènes nucléaires. __________________________________________________________ 14
II.1.1- mutation du gène FXN: Défaut d’assemblage de la machinerie Fe/S.____________________ 14
II.1.2- Mutation du gène OPA1: Problème de la dynamique mitochondriale. ___________________ 15
II.1.3- Mutation du gène ATP12 : Défaut d’assemblage des complexes
des oxydations phosphorylantes. ________________________________________________ 16
II.1.4- Mutation du gène TAZ1: changements de composition
de la membrane interne mitochondriale. __________________________________________ 16
II.1.5- Mutations au niveau du gène SPG7: Problème de système de contrôle de qualité dans la
mitochondrie. _______________________________________________________________ 17
II.2- Mutations de l’ADN mitochondrial. ______________________________________________________ 18
II.2.1- Syndrome de NARP. _________________________________________________________ 18
II.2.2- Maladie de LHON. __________________________________________________________ 19
II.2.3- Syndrome de Kearns-Sayre.____________________________________________________ 19
II.3 - Mutations du gène POLG : Problème de réplication de l’ADN mitochondrial._____________________ 20
III- LA REPLICATION. ....................................................................................................... 22
III.1- La réplication nucléaire. ______________________________________________________________ 22
III.2- Réplication de l’ADN mitochondrial. ____________________________________________________ 24
III.2.1- Modèle de réplication mitochondrial humain. _____________________________________ 24
III.2.2- Modèle de réplication mitochondrial de la levure S.cerevisiae. ________________________ 26
IV- LA REPARATION DE l’ADN. ...................................................................................... 28
IV.1- Le BER dans le noyau. _______________________________________________________________ 29
IV.2- Le BER dans la mitochondrie.__________________________________________________________ 30

V- LES ADN POLYMERASES............................................................................................ 31
V.1- Historique. _________________________________________________________________________ 31
V.2- Polymérases bactériennes. _____________________________________________________________ 31
V.3- Les ADN polymérases animales. ________________________________________________________ 32
V.3.1- L’ADN polymérase alpha (!).__________________________________________________ 32
V.3.2- L’ADN polymérase beta (").___________________________________________________ 33
V.3.3- L’ADN polymérase gamma (#). ________________________________________________ 34
V.3.4- L’ADN polymérase delta ($). __________________________________________________ 34
V.3.5- L’ADN polymérase epsilon (%&' ________________________________________________ 35
V.3.6- L’ADN polymérase zeta ((). ___________________________________________________ 36
V.3.7- L’ADN polymérase Rev1._____________________________________________________ 37
V.3.8- L’ADN polymérase lambda ()). ________________________________________________ 37
V.3.9- L’ADN polymérase eta (*).____________________________________________________ 38
V.3.10- L’ADN polymérase iota (+). __________________________________________________ 38
V.3.11- L’ADN polymérase kappa (,). ________________________________________________ 39
V.3.12- L’ADN polymérase mu (-). __________________________________________________ 40
V.3.13- L’ADN polymérase theta.(/). _________________________________________________ 40
V.3.14- Terminal deoxynucléotide transférase. __________________________________________ 40
V.4- Les ADN polymérases de S.cerevisiae. ___________________________________________________ 41
V.4.1- L’ADN polymérase alpha._____________________________________________________ 41
V.4.2- L’ADN polymérase "-like. ____________________________________________________ 41
V.4.3- L’ADN polymérase gamma. ___________________________________________________ 42
2V.4.4- L’ADN polymérase delta. _____________________________________________________ 42
V.4.5- L’ADN polymérase epsilon. ___________________________________________________ 42
V.4.6- L’ADN polymérase zeta.______________________________________________________ 42
V.4.7- L’ADN polymérase Rev1._____________________________________________________ 43
V.4.8- L’ADN polymérase eta._______________________________________________________ 43
V.4.9- L’ADN polymérase phi (!). ___________________________________________________ 44
V.4.10- L’ADN polymérase sigma (0). ________________________________________________ 44
V.5- Les Familles de polymérases. ___________________________________________________________ 44
V.6- Les ADN polymérases mitochondriales.___________________________________________________ 45

VI- L’ADRESSAGE MITOCHONDRIAL.......................................................................... 47

VII- L’INTERET DU MODELE LEVURE. ....................................................................... 50

OBJECTIFS DE LA THESE. ............................................................................................... 52




CHAPITRE I : Identification de la seconde activité ADN polymérase mitochondriale


I- INTRODUCTION. ............................................................................................................. 54
I.1- Tentatives de purification des mitochondries. _______________________________________________ 55
I.2- Technique permettant l’identification d’une protéine. _________________________________________ 56
I.2.1- Caractéristiques physicochimiques. ______________________________________________ 56
I.2.2- Propriétés enzymatiques._______________________________________________________ 57
I.2.3- Séquençage N-terminal d’Edman.________________________________________________ 57
I.2.4- Interruption génique.__________________________________________________________ 58
I.2.5- Protéine de fusion.____________________________________________________________ 60
I.2.6- Spectrométrie de masse. _______________________________________________________ 61

OBJECTIF DU PREMIER CHAPITRE :........................................................................... 65

II- MATERIELS ET METHODES...................................................................................... 66
II.1- Matériels. __________________________________________________________________________ 66
II.1.1- Souches de levures et bactéries._________________________________________________ 66
II.1.2- Culture des levures.__________________________________________________________ 66
II.1.3- Préparation des mitochondries. _________________________________________________ 67
II.1.4- Préparation des mitoplastes.____________________________________________________ 68
II.1.5- Traitement à la protéinase K.___________________________________________________ 69
II.1.6- Gradient d’Histodenz™ (Sigma-Aldrich)._________________________________________ 69
II.1.7- Microscopie électronique. _____________________________________________________ 70
II.2 - Méthodes Relatives à l’étude des protéines. _______________________________________________ 71
II.2.1- Détermination de la concentration des protéines. ___________________________________ 71
II.2.2- Test d’activité ADN polymérase ADN dépendante. _________________________________ 71
II.2.3- Purification des ADN polymérases mitochondriales. ________________________________ 73
II.2.4- Détermination de la localisation des protéines. _____________________________________ 76

III- RESULTATS……………………………………………………………………………80
III.1- Purification des mitochondries. _________________________________________________________ 80
III.1.1- Traitement protéinase K. _____________________________________________________ 80
III.1.2- Mitoplastes. _______________________________________________________________ 81
III.1.3- Purification des mitochondries sur gradient d’Histodenz™ (Sigma-Aldrich)._____________ 82
III.2- Identification de l’ADN polymérase éluée avec 250 mM NaCl (ADN polymérase NI). ______ 83
III.3- Microscopie à fluorescence. ___________________________________________________________ 85

IV- DISCUSSION…………………………………………………………………………...88



3CHAPITRE II : Etude du complexe de réplication mitochondrial de la levure S.cerevisiae

I- INTRODUCTION. ............................................................................................................. 98
I.1- Les complexes protéiques_______________________________________________________________ 98
I.1.1- Les interactions protéine-protéine. _______________________________________________ 99
I.1.2- Technique d’étude des complexes protéiques. _____________________________________ 100
I.1.3- Facteurs déstabilisants les complexes protéiques.___________________________________ 111
I.2- Complexe de réplication nucléaire. ______________________________________________________ 113
I.3- Complexe de réplication mitochondrial.___________________________________________________ 113
I.4- Candidats potentiels au réplisome mitochondrial. ___________________________________________ 115

OBJECTIFS DU CHAPITRE II......................................................................................... 117

II- MATERIELS ET METHODES.................................................................................... 118
II.1- Matériels. _________________________________________________________________________ 118
II.1.1- Souches de levures et de bactéries. _____________________________________________ 118
II.1.2- Culture des bactéries.________________________________________________________ 118
II.1.3- Préparation des mitochondries. ________________________________________________ 119
II.2- Méthodes Relatives à l’étude des protéines. _______________________________________________ 119
II.2.1- Techniques de concentration des protéines._______________________________________ 119
II.2.2- Mesures d’activités enzymatiques. _____________________________________________ 120
II.2.3- Séparation des protéines sur gel d’électrophorèse. _________________________________ 124
II.2.4- Purification du complexe de réplication. _________________________________________ 131
II.3- Méthodes relatives à l’étude des acides nucléiques. _________________________________________ 137
II.3.1- Techniques générales. _______________________________________________________ 137
II.3.2-Séparation et purification des fragments d’ADN.___________________________________ 137
II.3.3- PCR (Réaction de Polymérisation en Chaîne). ____________________________________ 138
II.3.4- Réalisation des constructions ORI5, COX3. ______________________________________ 139
II.3.5- Marquage des oligonucléotides aux extrémités 5’. _________________________________ 140

III- RESULTATS. ................................................................................................................ 142
III.1- Purification du complexe de réplication natif._____________________________________________ 142
III.1.1- Nouvelle stratégie de purification du complexe de réplication. _______________________ 143
III.1.2- Recherche des activité ADN polymérase et ADN topoisomérase dans la phase 2_________ 144
III.1.3- Approfondissement de la purification. __________________________________________ 147
III.1.4- Détermination de la taille du complexe. _________________________________________ 149
III.1.3- Recherche des différentes activités dans la phase 2.________________________________ 152
III.1.4- Identification de protéines présentes dans la phase 2 pouvant faire partie du réplisome.____ 156
III.1.5- Expérience de pontage.______________________________________________________ 161
III.1.6- Etude de la dissociation du complexe de réplication._______________________________ 162
III.2- Etude des interactions possibles entre des candidats potentiels du réplisome. ____________________ 165
III.2.1- Colonne ADN polymérase #. _________________________________________________ 166
III.2.2- Colonne ADN topoisomérase 1._______________________________________________ 169
III.2.3- Colonne ADN ligase 1.______________________________________________________ 171
III.2.4- Colonne RIM1.____________________________________________________________ 174
III.2.5- Colonne ADN Polymérase !._________________________________________________ 175
III.2.6- Colonne ADN Polymérase !1. _______________________________________________ 177
III.2.7- Colonne Nucléase 1.________________________________________________________ 179

IV- DISCUSSION…………………………………………………………………………..182


CONCLUSION GENERALE

4
INTRODUCTION GENERALE
5INTRODUCTION GENERALE


I- LA MITOCHONDRIE.
La mitochondrie est un organite dont la taille est de l’ordre du micromètre (1 à 10 µm
de long et 0,5 à 1 µm de large) présent chez la quasi-totalité des eucaryotes. La mitochondrie
est le lieu d’une multitude de processus essentiels à la cellule, parmi lesquels la production
d’énergie via la synthèse d’ATP grâce aux oxydations phosphorylantes, la dégradation des
acides gras par la "-oxydation ou encore l’utilisation du pyruvate produit de la glycolyse par
le cycle de Krebs. Toutes ces fonctions essentielles nécessitent une molécule, l’oxygène. Cet
élément peut être délétère pour la cellule du fait de son fort potentiel d’oxydo-réduction, en
effet, il est capable d’endommager les protéines, acides gras et autres éléments composant la
cellule. Comment un élément néfaste comme le dioxygène peut permettre une amélioration
significative des rendements énergétiques ? Prenons le cas de la levure, en condition
anaérobie, le processus énergétique utilisé est la fermentation, cette voie métabolique se
déroule dans le cytoplasme et permet la production de 2 moles d’ATP par mole de glucose
consommé. Grâce à la mitochondrie, en condition aérobie, de 36 à 38 moles d’ATP sont
produites par mole de glucose consommé via le cycle de Krebs et la chaîne respiratoire. Nous
pouvons nous poser une seconde question : quelle est l’origine des mitochondries dans les
cellules ? La réponse est : l’endosymbiose ; ce phénomène va être abordé dans le paragraphe
suivant.

I.1- L’origine de la mitochondrie : l’endosymbiose.

La définition de la symbiose est la coopération mutuellement bénéfique entre deux
organismes vivants, donc appelée endosymbiose lorsque l'un est contenu par l'autre.
L'organisme interne est appelé un endosymbiote. Cette terminologie est surtout employée au
niveau cellulaire pour imager une coopération entre des micro-organismes simples, et les
cellules d'organismes plus évolués qui les contiennent et dont ils favorisent le fonctionnement.
Parmi des cas d’endosymbiose, nous pouvons trouver un ver vestimentifère tubicole Riftia
pachyptila vivant le long de la dorsale océanique du pacifique Est. Il s’agit d’un ver géant
vivant en colonie à des températures proches de 20°C à des profondeurs supérieures à 2500m.
Cet organisme est dépourvu de système digestif mais il entretient une symbiose étroite avec
61000
100
10
1
0,1
0,01
0,001
0,0001
4 3 2 1 0
Age (milliard d'années)
Figure 1 : Evolution de la porportion de dioxygène dans l'atmosphère au cours du temps.
Le trait large montre l'évolution proposée du niveau atmosphérique d'oxygène depuis l'apparition
de la Terre (4,6 milliard d'années) jusqu'à aujourd'hui. Des cyanobactéries sont apparues avant 2,8 Ga
et commencèrent à réaliser la photosynthèse. Entre 2,45 et 2 Ga, la valeur du taux d'oxygène est peu
précise mais devait être plus élevée que 10% du taux actuel, mais significativement plus faible que la
concentration d'oxygène de nos jours. Ce taux semble se stabiliser de 1,85 Ga à 0,85 Ga puis une
augmentation du niveau d'oxygène atmosphérique fut déterminée de 0,85 Ga à 0,54 Ga ce qui devrait
correspondre à la colonisation de la terre par les végétaux supérieurs.
O2 atmosphérique (pourcentage par rapport
au niveau atmosphérique actuel)

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