Réponse biologique de cellules animales à des contraintes hydrodynamiques : simulation numérique, expérimentation et modélisation en bioréacteurs de laboratoire, Biological response of animal cell to hydrodynamic stresses : numerical simulation, experimentation and modelling in bench-scale bioreactors

De
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Sous la direction de Annie Marc, Eric Olmos
Thèse soutenue le 13 novembre 2008: INPL
La réponse globale de cellules animales à des contraintes hydrodynamiques lors de leur culture en suspension dans des réacteurs agités a été étudiée grâce à une approche intégrative couplant les outils du génie biochimique à ceux de la mécanique des fluides numérique. En premier lieu, la description de l’hydrodynamique moyenne et locale de deux systèmes de culture agités de laboratoire, spinner et bioréacteur, a été réalisée. Puis, l'étude des cinétiques macroscopiques de cellules CHO cultivées en suspension, en milieu sans sérum et sans protéine, a été réalisée avec différentes vitesses d’agitation, pour évaluer l'impact de l'agitation sur les vitesses de croissance et de mort cellulaires, ainsi que de consommation des substrats et de production des métabolites et de l'interféron-gamma recombinant. Des caractérisations supplémentaires des cellules (apoptose, protéines intracellulaires) et de l'interféron ont également été réalisées. Les effets de l'intensification de l'agitation ont été représentés avec plusieurs corrélations globales reliant : (i) en milieu contenant du pluronic, l'intégrale des cellules viables au nombre de Reynolds, et la proportion de cellules lysées à la valeur moyenne de l'énergie de dissipation, <[epsilon]? (ii) en milieu sans pluronic, les vitesses spécifiques de croissance et de mort cellulaires à <[epsilon]. De plus, l'analyse par CFD de la distribution spatio-temporelle des contraintes indique que la lyse cellulaire, observée dans le réacteur aux conditions extrêmes d'agitation, serait plutôt liée à des valeurs locales très élevées de [epsilon], ainsi qu’à la fréquence d'exposition des cellules dans ces zones énergétiques. Un modèle hydro-cinétique original, couplant l’hydrodynamique locale aux cinétiques cellulaires de croissance et de mort, et basé sur l’intermittence de la turbulence permet la prédiction de la lyse massive observée en réacteur sous certaines conditions. Pour confirmer le fait que les effets liés à l'intensification de l'agitation sont bien le résultat d'une augmentation des contraintes hydrodynamiques, et non d'une amélioration du transfert d'oxygène, ce dernier a été mesuré et modélisé par couplage avec une simulation numérique de type Volume Of Fluid , concluant en une absence de limitation d'oxygène. Enfin, la conception, le dimensionnement et la caractérisation hydrodynamique d'un réacteur innovant de type Couette-Taylor, sont proposées pour la mise en œuvre de cultures perfusées dans un environnement hydrodynamique mieux contrôlé
-Cellules animales CHO
-Transfert d’oxygène
-CFD
-Contraintes hydrodynamiques
-Etudes cinétiques
-Bioréacteurs agités
-Culture en suspension
The global response of animal cells to hydrodynamic stress when cultivated in suspension in stirred tank reactors was studied. To do this, an integrative approach coupling biochemical engineering and fluid mechanics tools were used. First, the description of the global and local hydrodynamics of two bench-scale agitated reactors, a spinner flask and a bioreactor, was carried out. Then, macroscopic kinetics of CHO cells cultivated in a serum and protein-free medium were obtained at various agitation rates, in order to evaluate the impact of agitation on cellular growth and death, as well as substrates consumption and metabolites and recombining IFN-[gamma] production. IFN-[gamma] and cells physiological state were more precisely characterised by glycosylation, apoptosis state and intracellular proteins measurements. The effects of the agitation increase were represented by several global correlations that related: (i) in a medium containing Pluronic F68, the Integral of the Viable Cells Density to the Reynolds number, and the proportion of lysed cells with the average value of energy dissipation rate <[epsilon]? (ii) in a medium without pluronic, specific cell growth and death rates to <[epsilon]. Moreover, CFD analysis of the stress distribution indicated that the cellular lysis observed in the bioreactor at the highest agitation rate, would be related to very high local values of [epsilon], and to the exposure frequency of the cells in these energetic zones. An original hydro-kinetic model based on the intermittency of turbulence and coupling the local hydrodynamics with cell growth and death kinetics, allowed the prediction of the massive cell lysis observed in the bioreactor under some mixing conditions. To decouple shear stress effects from oxygen transfer improvement, the oxygen transfer coefficient was experimentally measured and modelled using a Volume Of Fluid numerical simulation. Our results indicated the absence of an oxygen limitation, which confirmed that this cell response resulted from the hydrodynamic stress increase alone. Lastly, an innovative continuous and perfused Couette-Taylor reactor, allowing a better-controlled hydrodynamic environment was designed and sized. Its hydrodynamic description was carried out using CFD calculations
-CHO animal cells
-CFD
-Oxygen transfer
-Hydrodynamic stress
-Suspension cell culture
-Stirred bioreactor
-Cell kinetics studies
Source: http://www.theses.fr/2008INPL075N/document
Publié le : mardi 25 octobre 2011
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INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE (INPL)
Ecole Nationale Supérieure d’Agronomie et des Industries Alimentaires (ENSAIA)
Laboratoire des Sciences du Génie Chimique (LSGC)
Ecole Doctorale Sciences et Ingénierie Ressources Procédés Produits Environnement (RP2E)


THESE
Présentée pour obtenir le grade de


Docteur de l’Institut National Polytechnique de Lorraine
Spécialité : Procédés Biotechnologiques et Alimentaires


Par
Naziha BARBOUCHE


Sujet

Réponse biologique de cellules animales à des
contraintes hydrodynamiques :
simulation numérique, expérimentation et
modélisation en bioréacteurs de laboratoire


Soutenue publiquement le 13 Novembre 2008



Membres du jury

Rapporteurs : Alain LINE (Professeur à l’INSA, Toulouse)
Cécile LEGALLAIS (Directeur de Recherche CNRS à l’UTC, Compiègne)

Examinateurs : Karine LOUBIERE (Chargé de Recherche CNRS au GEPEA, Saint Nazaire)
Annie MARC (Directeur de Recherche CNRS au LSGC, Nancy)
Eric OLMOS (Maître de conférences à l’ENSAIA-INPL, Nancy)
Emmanuel GUEDON (Chargé de Recherche CNRS au LSGC, Nancy)
- 1 - Remerciements


Les travaux de cette thèse ont été réalisés au Laboratoire des Sciences du Génie Chimique de
Nancy, au sein du groupe « Génie des Procédés Biotechnologiques et Alimentaires ». Je
remercie Michel Sardin directeur du LSGC et tous les membres du laboratoire de m’y avoir
accueillie.

J’exprime ma profonde reconnaissance à mes directeurs de thèse Annie Marc, Eric Olmos et
Emmanuel Guédon pour leur encadrement et leur rigueur scientifique, ainsi que leur soutien
durant ces années de thèse.

Je voudrais sincèrement remercier Cécile Legallais, Karine Loubière et Alain Liné pour avoir
accepté de juger ce travail.

J’aimerais adresser toute ma gratitude envers Eric Olmos pour avoir contribué à ce sujet avec
ses travaux de simulations numérique, et pour sa grande implication dans ce projet.

Mes vifs remerciements sont adressés à Fabrice Blanchard et aux membres de l’atelier et du
service SEMI (Hakim Benhara, Mathieu Weber, Christian Blanchard, Pascal Beaurain et
Richard Lainé) pour toute l’aide et la patience dont ils ont fait preuve avec les montages
expérimentaux.

J’aimerais remercier tous les membres du GPBA pour leur bonne humeur ainsi que pour la
chaleureuse ambiance au labo (malgré le froid lorrain), en particulier, Isabelle Chevalot,
Frantz Fournier, Evelyne Ronat et Jean-Louis Goergen.

Un grand merci à mes fidèles compagnons de joie et de galères : Emma, Marie-Françoise,
Eric H. et Eric O., ainsi qu’à mes valeureux stagiaires Jean-Mathieu et Cécile.

Je voudrais également remercier les membres du LISBP, et plus spécialement, Carole Jouve et
Sandrine Alfénore, pour leur accueil et leur encouragement durant la période de rédaction.

Enfin, mes pensées vont à ma famille : Monia, Férid, Linda, Midou, Rached et Christiane,
ainsi qu’à Haythem, pour leur réconfort et leur inébranlable soutien durant les moments
difficiles de cette thèse.
- 4 - SOMMAIRE GENERAL






Introduction Générale............................................................................................................ 13


Chapitre I : Synthèse Bibliographique................................................................................. 21
A. Procédés de culture de cellules animales ......................................................................... 25
B. Effets biologiques des contraintes hydrodynamiques ...................................................... 41
C. Les effets des contraintes hydrodynamiques dans des systèmes à petite échelle............. 59
D. Les effets des contraintes hydrodynamiques en bioréacteurs .......................................... 66
Conclusion.............................................................................................................................. 101


Chapitre II : Matériel et Méthodes..................................................................................... 103
A. Culture des cellules ........................................................................................................ 107
B. Outils analytiques........................................................................................................... 113
C. Méthodes numériques et caractérisation hydrodynamique ............................................ 126


Chapitre III : Etude expérimentale et numérique de l’hydrodynamique de cytoculteurs
agités ...................................................................................................................................... 143
Introduction ............................................................................................................................ 147
A. Analyse expérimentale de l’hydrodynamique du réacteur............................................. 160
B. Simulation numérique par CFD ..................................................................................... 163
C. Calcul de l’énergie dissipée............................................................................................ 168
D. Distribution et historique des contraintes subies par les cellules dans les réacteurs...... 169
Conclusion.............................................................................................................................. 181

- 5 -
Chapitre IV : Etude de la réponse cellulaire à une intensification de l’agitation et
modélisation hydro-cinétique .............................................................................................. 185
Introduction ............................................................................................................................ 189
A. Nouvelle approche de l'étude des contraintes hydrodynamiques sur les cellules animales
basée sur les outils de CFD et les cinétiques de culture expérimentales................................ 191
B. Cinétiques de cultures en absence de tensio-actif .......................................................... 232
Conclusion.............................................................................................................................. 245


Chapitre V : Quantification expérimentale et numérique du transfert d’oxygène
surfacique et volumique....................................................................................................... 249
Introduction ............................................................................................................................ 253
A. Mesures expérimentale du transfert d’oxygène.............................................................. 266
B. Simulations numériques des interfaces gaz-liquides...................................................... 274
Conclusion.............................................................................................................................. 283


Chapitre VI : Conception, dimensionnement et caractérisation d’un réacteur perfusé de
type Couette / Taylor-Couette............................................................................................. 287
Introduction ............................................................................................................................ 291
A. Conception et dimensionnement du réacteur ................................................................. 292
B. Caractérisation de l’hydrodynamique du RCTC............................................................ 302
Conclusion.............................................................................................................................. 311


Conclusion Générale et Perspectives .................................................................................. 313


Références Bibliographiques............................................................................................... 323


- 6 - NOMENCLATURE


VARIABLES

-1
a Aire interfaciale spécifique m
2A Aire de la surface libre m
-1c Concentration de l’oxygène dans la phase liquide mol.L
-1
c* Concentration de saturation de l’oxygène dans la phase liquide mol.L
C Couple N.m
c Constante de mort cellulaire d
c Constante de lyse cellulaire l
C Constante L
C Constante V
d Diamètre d’une particule m p
D Diamètre du mobile d’agitation m
d Diamètre d’une cellule m c
K -1f Fréquence des tourbillons turbulents s
I -1
f Fréquence des tourbillons turbulents dans le domaine inertiel s
V -1f Fréquence des tourbillons turbulents dans le domaine visqueux s
5IVCD Intégrale de la densité des cellules viables (Integral of Viable 10 cell.h/ml
Cell Density)
5
ILCD Intégrale de la densité des cellules lysées (Integral of Lysed 10 cell.h/ml
Cell Density
5ITCD Intégrale de la densité des cellules totales (Integral of Total Cell 10 cell.h/ml
Density
2 -2
k Energie cinétique turbulente m .s
-1
k Vitesse spécifique de mort cellulaire (cellules bleues) h d
k -1k Vitesse spécifique de mort cellulaire dans le modèle cinétique h d
-1k Vitesse spécifique de lyse cellulaire h l
-1
k Coefficient de transfert de matière m.s L
-1k a Coefficient volumique de transfert d’oxygène s L
L Echelle intégrale de la turbulence m
L Longueur ou taille de tourbillon m e
- 7 - Echelle de Kolmogorov m l K
-1 N Vitesse d’agitation s
-1 -1
O Concentration en oxygène dissous g.L ; mol.L 2
* -1 -
O Concentration de saturation en oxygène dissous g.L ; mol.L 2
P Puissance mécanique W
P( ) Fonction de densité de probabilité de
3
P / V Dissipation de puissance par unité de volume W / m
Q Débit de perfusion du réacteur Couette ml/mn ; L/h p
Q Débit de recyclage du réacteur Couette ml/mn ; L/h r
5q Vitesse spécifique de production d’ammonium μmol/10 cell/h ammonia
5
q Vitesse spécifique de consommation de glucose μmol/10 cell/h glucose
5
q Vitesse spécifique de consommation de glutamine μmol/10 cell/h glutamine
5q μg/10 cell/h Vitesse spécifique de production de l’IFN- IFN
5q Vitesse spécifique de production de lactate μmol/10 cell/h lactate
5
q Vitesse spécifique de production μmol/10 cell/h p
-1 -6
Vitesse spécifique de consommation d’oxygène mol.s .10 cell q O2
5
q Vitesse spécifique de consommation de substrat μmol/10 cell/h s
r Position radiale M
5
r Vitesse de lyse cellulaire 10 cell/ml/h l
5
r Vitesse de décès cellulaire (formation de cellules bleues) 10 cell/ml/h d
-1 -1r Vitesse de consommation de l’oxygène g.ml .h O2
-1 -1r Vitesse de consommation du substrat g.ml .h s
5
r Vitesse de croissance cellulaire 10 cell/ml/h x
S Concentration en substrat g/L ; mol/L
T Echelle de temps intégrale s
T Echelle de temps Lagrangienne du fluide s L
t Temps de passage dans le tourbillon s cross
t « Temps de vie » du tourbillon s e
t Temps d’interaction s I
t Temps de réponse de la particule (cellule) s p
-1u Vitesse de liquide m.s
-1u Vitesse de la particule (cellule) m.s p
-1
u’ Fluctuation de vitesse m.s
- 8 -
gaa-1U Vitesse superficielle de gaz m.s g
-1
Moyenne de la vitesse verticale proximale de la surface m.s u z
-1
Racine de la moyenne du carré de la vitesse verticale m.s 2u' z
3
V Volume du réacteur m
-1
X Cellules mortes bleues (marquage au bleu trypan) cell.ml b
-1X Cellules mortes totales (X = X + X ) cell.ml d d b l
-1
X Cellules lysées cell.ml l
-1
X Densité cellulaire moyenne cell.ml m
-1X Cellules totales (X = X + X + X ) cell.ml t t v b l
-1
X Cellules viables cell.ml v
-1
X Densité maximale de cellules viables cell.ml v, max
u yf+ +y Variable pariétale adimensionnelle y =
Y Rendement en ammonium par rapport à la glutamine mole/mole amm/glut
5
Y Rendement en IFN par rapport aux cellules viables μg/10 cellules IFN/Xv
Y Rendement en lactate par rapport au glucose mole/mole lact/gluc
-11Y X/gluc Rendement en cellules par rapport au glucose 10 cell/mole
-11Y X/glut Rendement en cellules par rapport à la glutamine 10 cell/mole
z Position axiale m


VARIABLES GRECQUES

Exposant fractal
Exposant fractal critique c
2 -3 -1 Taux de dissipation de l’énergie cinétique turbulente m .s , W.kg
-1& Gradient de vitesse s
Viscosité dynamique du liquide Pa.s
-1μ Vitesse spécifique de croissance apparente h app
-1
μ Vitesse spécifique de croissance réelle h real
2 -1 Viscosité cinématique du liquide m .s
- 9 -
maaengn

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