Synthèse de nanoparticules spécifiques pour le ciblage et l'imagerie de l'angiogenèse tumorale

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Sous la direction de Gérard Deleris, Marie-Claude Clochard
Thèse soutenue le 16 décembre 2009: Bordeaux 1
La croissance d’une tumeur requiert la formation de son propre réseau vasculaire par angiogenèse. Ce processus est orchestré par une multitude de médiateurs dont le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) qui interagit avec des récepteurs surexprimés à la surface des cellules endothéliales des vaisseaux avoisinant la tumeur. Les thérapies ciblées anticancéreuses jouent sur cette surexpression pour concevoir de nouvelles molécules spécifiques de la zone tumorale. Un nouvel agent de ciblage a ainsi vu le jour au sein du laboratoire. Il s’agit d’un cyclopeptide de 17 acides aminés, nommé CBO-P11 qui présente une haute affinité pour les récepteurs du VEGF. Afin de prolonger le temps de circulation du peptide dans le sang, des nanoparticules de poly(fluorure de vinylidène) (PVDF), polymère biocompatible, ont été utilisées comme vecteur. Les nanoparticules ont tout d’abord été synthétisées par une polymérisation radicalaire en émulsion dans l’eau, puis radio-greffées avec de l’acide acrylique (AA) pour obtenir du PVDF-g-PAA, ce qui a permis par la suite de les fonctionnaliser avec le CBO-P11 et un agent d’imagerie par « click » chemistry via un bras espaceur de type oligo(éthylène glycol). Différents marqueurs ont été étudiés à savoir deux sondes fluorescentes pour l’imagerie optique et un agent de contraste pour l’imagerie par résonance magnétique à bas champ. Chaque étape de synthèse a été caractérisée par de nombreuses techniques telles que la diffusion statique et dynamique de la lumière, la diffusion de neutrons aux petits angles, la spectrométrie photoélectronique de rayons X, la spectrométrie infrarouge, la spectrométrie de fluorescence et la polarisation dynamique nucléaire. Des études in vitro sur des cellules endothéliales ont permis de montrer que les nanoparticules n’étaient pas cytotoxiques et que le CBO-P11 lié au vecteur conservait sa spécificité pour les récepteurs du VEGF. Ces outils multifonctionnels présentent un grand potentiel pour cibler et imager les zones tumorales.
-Angiogenèse
-Nanoparticules
-Imagerie
-Thérapie ciblée
-PVDF
Tumor growth requires the formation of its own vascular network by angiogenesis. This process is mediated through numerous factors including VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) which interacts with receptors overexpressed on endothelial cells of blood vessels neighboring tumor. Targeted anticancer therapies take advantage of this overexpression to design tumor-specific molecules. A new targeting agent, CBO-P11 was synthesized in the laboratory. It is a 17-mer cyclopeptide with a high affinity for VEGF receptors. In order to increase the blood circulation time of this peptide, nanoparticles of poly(vinylidene fluoride) (PVDF), biocompatible polymer, were used as carrier. Nanoparticles were synthesized by radical polymerization in aqueous emulsion, then radio-grafted with acrylic acid (AA) to obtain PVDF-g-PAA. Nanoparticles were functionalized with CBO-P11 and an imaging agent by “click” chemistry via an oligo(ethylene glycol)-like spacer arm. Different dyes were used: two fluorescent probes for optical imaging and a contrast agent for low-field magnetic resonance imaging. Each step of the nanoparticles preparation was monitored and successfully characterized by numerous techniques such as dynamic and static light scattering, small-angle neutron scattering, X-ray photoelectron spectroscopy, infrared spectroscopy, fluorescence spectroscopy and dynamic nuclear polarization. In vitro studies were performed on endothelial cells and have shown that nanoparticles were not cytotoxic and that CBO-P11 conjugated to nanoparticles kept its specificity for VEGF receptors. Those multifunctional tools offer a great potential to target and image tumor.
-Angiogenesis
-Imaging
-Targeted therapy
-PVDF
-Nanoparticles
Source: http://www.theses.fr/2009BOR13939/document
Publié le : dimanche 30 octobre 2011
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THÈSE

PRÉSENTÉE A

L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 1

ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES CHIMIQUES

Par Stéphanie DESHAYES

POUR OBTENIR LE GRADE DE

DOCTEUR
SPÉCIALITÉ : CHIMIE ORGANIQUE

SYNTHESE DE NANOPARTICULES SPECIFIQUES POUR LE
CIBLAGE ET L’IMAGERIE DE L’ANGIOGENESE
TUMORALE

Directeur de recherche : Professeur Gérard DELERIS




Soutenue le : 16 Décembre 2009

Devant la commission d’examen formée de :
Mme. JAMART Brigitte Professeur à l'Institut National Polytechnique de Lorraine Rapporteur
M. DESBRIERES Jacques Professeur à l’Université de Pau et des Pays de l’Adour Rapporteur
M. LECOMMANDOUX Sébastien Professeur à l’Université Bordeaux I Examinateur
M. MOENNER Michel Professeur à l’Université Bordeaux I Examinateur
M. DELERIS Gérard Professeur à l’Université Bordeaux II Directeur de
thèse
Mme. CLOCHARD Marie-Claude Chercheur au CEA de Saclay Co-directrice
de thèse
M. MAURIZOT Victor Chargé de recherche au CNRS Invité
Remerciements

Ce travail de thèse fait suite à une collaboration entre le Laboratoire des Solides
Irradiés (UMR 7642, laboratoire mixte CEA-CNRS-Ecole Polytechnique) du
Commissariat à l’Energie Atomique (CEA) de Saclay et le groupe de Chimie Bio-
Organique (UMR 5084) intégré au laboratoire de Chimie Nucléaire Analytique et Bio-
environnementale (CNAB). Je tiens tout d’abord à adresser mes remerciements au
Professeur Gérard DELERIS, à Monsieur Guillaume PETITE et à Madame Marie-
Claude CLOCHARD pour avoir soutenu ce projet.
Je tiens à exprimer toute ma gratitude à mon directeur de thèse, le Professeur
Gérard DELERIS pour m’avoir accueillie au sein de son laboratoire, pour m’avoir
accordée toute sa confiance, pour son aide scientifique et pour la grande liberté qu’il a
su me laisser dans la gestion de ce projet.
Je tiens également à remercier Madame Marie-Claude CLOCHARD pour m’avoir
guidée tout au long de la thèse. Sa rigueur scientifique et ses remarquables
compétences ont permis l’accomplissement de ce travail et ont facilité la progression
de mes recherches. Ses qualités humaines ont rendu ces échanges très agréables.
Par ailleurs, mes sincères remerciements vont à Monsieur Victor MAURIZOT qui a
su m’encadrer et me prodiguer de précieux conseils, mais aussi pour son soutien
constant au cours de la thèse. Je souhaite lui témoigner toute ma gratitude pour ses
qualités scientifiques et pour sa bonne humeur qui ont contribué à un quotidien
captivant.
Je voudrais remercier toutes les personnes qui ont participé à mes travaux de
thèse et notamment, le Professeur Michel MOENNER pour sa considérable implication
dans l’étude biologique, Thomas BERTHELOT, Cécile BAUDIN, Stéphane ESNOUF
pour leur aide précieuse en RMN, RPE et pour les irradiations, ainsi que Didier
LAIREZ pour les expériences complexes de diffusion de neutrons. Remerciements

Je tiens à remercier vivement les membres de mon jury et tout particulièrement les
rapporteurs, le Professeur Brigitte JAMART et le Professeur Jacques DESBRIERES
pour leur lecture attentive de ce manuscrit et pour leurs remarques constructives et
pertinentes.
Ce projet de thèse n’aurait jamais pu voir le jour sans la collaboration de Jacques
SUSPERREGUI et Cyril RUBIO, anciens directeurs de la société COMIPSO, qui ont
permis de débloquer une situation délicate et d’amorcer le contrat avec le CEA.
Je tiens à mentionner le plaisir que j’ai eu à travailler au sein des différentes
équipes, avec des collègues qui ont su maintenir une très bonne ambiance et qui
m’ont supportée et épaulée pendant ces trois années. J’en remercie ici tous les
membres. Je passe une dédicace spéciale à Mouss qui a toujours été présent pour
rattraper mes « bêtises » et réparer toutes ces maudites machines, un petit mot de la
part de « Speedy » : c’est la dernière ligne droite, alors fonce ! Merci Mouss pour tes
secousses matinales, pour ton écoute et nos petites causettes. Un remerciement tout
particulier à Monsieur Arnaud pour ses encouragements, ses conseils avisés et ses
discussions musicales et cinématographiques, sans oublier la trituration longue et
fastidieuse des glomérules jusqu’au produit parfait. Enfin, merci Anis pour ta
franchise quelque peu cinglante mais juste, ta sympathie et bien sûr pour la vidéo !!!
Table des matières


Introduction générale.................................................................................................................. 5
I. Le voyage littéraire 7
I.1. Rôle de l’angiogenèse dans le développement tumoral ................................................... 8
I.2. La vectorisation d’agents anti-angiogéniques dans les thérapies anticancéreuses ........ 31
I.3. Les techniques d’imagerie de l’angiogenèse tumorale via les nanoparticules............... 51
I.4. Conclusion de ce voyage littéraire et objectifs .............................................................. 64
II. Le voyage scientifique .......................................................................... 65
II.1. Introduction................................................... 66
II.2. Conception et élaboration d’un nouveau vecteur polymère ......... 67
II.3. Synthèse de l’agent de ciblage anti-angiogénique ........................................................ 98
II.4. Synthèse d’agents d’imagerie ..................................................... 103
II.5. Fonctionnalisation des nanoparticules par « click » chemistry ................................... 114
II.6. Approche biologique .................................................................. 132
III. Le voyage empirique ........ 139
III.1. Instrumentation .......................................................................................................... 140
III.2. Synthèses ................... 145
III.3. Les tests biologiques ................................................................................................. 160
Conclusion et perspectives ..... 163
Annexes.. .................................... 167
Bibliographie............................................................................................. 185
Abréviations


AA Acide acrylique
aaAT Anti-angiogenic antithrombin
AAV Virus adéno-associés (adeno-associated virus)
ADN Acide désoxyribonucléique
Ang Angiopoïétine
APO Acide perfluorooctanoïque
ARNm Acide ribonucléique messager
BAE Cellules endothéliales d’aorte bovine
Boc tert-Butoxycarbonyle
CBO Chimie bio-organique
CE Cellules endothéliales
2-ClTrt 2-Chlorotrityle
COX Cyclo-oxygénase
CPP Peptides pénétrant les cellules (cell penetrating peptides)
DAC Acide 7-diéthylaminocoumarine-3-carboxylique
DDL Diffusion dynamique de la lumière
DDS Libération contrôlée de médicaments (drug delivery system)
DIEA N,N-Diisopropyléthylamine
DMEM Dulbecco's modified eagle medium
DMF Diméthylformamide
DNPA Diffusion de neutrons aux petits angles
DSC Calorimétrie différentielle à balayage (differential scanning calorimetry)
DSL Diffusion statique de la lumière
EDC 1-Ethyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide
EGF Facteur de croissance épidermique (epidermal growth factor)
EGM Endothelial growth medium
EPR Enhanced permeation and retention
ESI Electrospray ionization
~ 1 ~ Abréviations

FDA Food and drug administration
FGF Facteur de croissance du fibroblaste (fibroblast growth factor)
Flk-1 Fetal liver kinase-1
Flt Fms-like tyrosine kinase
Fmoc 9-Fluorénylméthoxycarbonyle
G-CSF Facteur stimulant les colonies de granulocytes (granulocyte colony-stimulating
factor)
GM-CSF Facteur stimulant les colonies de granulocytes-macrophages (granulocyte-
macrophage colony-stimulating factor)
HBTU O-(1H-benzotriazole-1-yl)-N,N,N’,N’-tétraméthyluronium hexafluorophosphate
HCMEC Cellules endothéliales de cerveau humain (human brain endothelial cell)
HGF-SF Facteur de croissance des hépatocytes (hepatocyte growth factor-scatter factor)
HIF-1 Facteur induit par l’hypoxie-1 (hypoxia inducible factor-1)
HOBt 1-Hydroxybenzotriazole
HPLC Chromatographie liquide haute performance (high-performance liquid
chromatography)
HPMA N-Hydroxypropyl méthacrylamide
HRMAS High-resolution magic angle spinning
HSV-1 Virus herpes simplex-1
HUVEC Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (human umbilical vein
endothelial cell)
IFN Interféron
Ig Immunoglobuline
IGF Facteur de croissance analogue à l’insuline (insulin growth factor)
IL Interleukine
IP-10 Protéine induite par l’interféron- (interferon-γ-inducible protein)
IRM Imagerie par résonance magnétique
IRTF Infrarouge à transformée de Fourier
KDR Récepteur contenant un domaine kinase (kinase domain containing receptor)
LCL Liposomes avec des temps de circulation prolongés (long-circulating liposomes)
LLB Laboratoire Léon Brillouin
LSI Laboratoire des solides irradiés
2M -2-Macroglobuline
MALDI-TOF Spectromètre de masse couplant une source d'ionisation laser assistée par une
matrice et un analyseur à temps de vol (matrix-assisted laser desorption
ionization-time of flight)
MEB-FEG Microscope électronique à balayage avec un canon à effet de champ (field
emission gun)
~ 2 ~ Abréviations

MEC Matrice extracellulaire
MMP Métalloprotéase matricielle (matrix metalloproteinase)
MMPI Inhibiteur des métalloprotéases matricielles (matrix metalloproteinase inhibitor)
NIR Proche infrarouge (near infrared)
NMP N-méthylpyrrolidone
PAA Poly(acide acrylique)
PAE Cellules endothéliales d’aorte porcine
PAGA Poly[acide R-(4-aminobutyl)-L-glycolique]
PAI Inhibiteur de l’activateur du plasminogène (plasminogen activator inhibitor)
PAMAM Poly(amidoamine)
Pbf 2,2,4,6,7-pentaméthyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl
PCL Poly( -caprolactone)
PD-ECGF/TP Facteur de croissance des cellules endothéliales dérivé des plaquettes (platelet-
derived endothelial cell growth factor/thymidine phosphorylase)
PDGF Facteur de croissance plaquettaire (platelet derived growth factor)
PDN Polarisation dynamique nucléaire
PEDF Facteur dérivé de l'épithélium pigmentaire (pigment epithelium-derived factor)
PEG Poly(éthylène glycol)
PEI Poly(éthylèneimine)
PF-4 Facteur plaquettaire-4 (platelet factor-4)
PLA Poly(acide D,L-lactique)
PLGA Poly(acide D,L-lactique-co-glycolique)
PlGF Facteur de croissance placentaire (placenta growth factor)
PLL Poly(L-lysine)
PPI Poly(propylèneimine)
PVDF Poly(fluorure de vinylidène)
PyBOP Benzotriazol-1-yloxytris(pyrrolidino)phosphonium hexafluorophosphate
RMN Résonance magnétique nucléaire
RPE Résonance paramagnétique électronique
RTK Récepteur à activité tyrosine-kinase
SDF-1 Facteur dérivé des cellules du stroma (stromal cell-derived factor-1)
sFlt-1 Soluble fms-like tyrosine kinase
SM Spectrométrie de masse
SWNT Nanotube de carbone monofeuillet (single-wall carbon nanotube)
TAF Facteur angiogénique tumoral (tumor angiogenesis factor)
TEA Triéthylamine
~ 3 ~ Abréviations

TEG Tétra(éthylène glycol)
TEMP Tomographie d'émission monophotonique
TEP Tomographie par émission de positrons
TFA Acide trifluoroacétique
TFPI-2 Inhibiteur de la voie du facteur tissulaire-2 (tissue factor pathway inhibitor-2)
TGF Facteur de croissance transformant (transforming growth factor)
THF Tétrahydrofurane
TIMP Inhibiteur tissulaire des métalloprotéases (tissue inhibitor of metalloproteinases)
TIS Triisopropylsilane
TNF-   Facteur de nécrose tumorale-  (tumor necrosis factor- )
TOAC Acide 2,2,6,6-tétraméthylpipéridine-1-oxyl-4-amino-4-carboxylique
tPA Activateur du plasminogène de type tissulaire (tissue plasminogen activator)
Trt Trityle
TSP-1 Thrombospondine-1
uPA Activateur du plasminogène de type urokinase (urokinase plasminogen activator)
US Ultrasons
UV Ultraviolet
VCAM Molécule d’adhésion des cellules vasculaires (vascular cell adhesion molecule)
VEGF Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (vascular endothelial growth
factor)
VEGFR Récepteur du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (vascular
endothelial growth factor receptor)
VEGI Inhibiteur de croissance de l’endothélium vasculaire (vascular endothelial growth
inhibitor)
VF2 Fluorure de vinylidène
VHL Von Hippel-Lindau
VPF Facteur de perméabilité vasculaire (vascular permeability factor)
WST-1 4-[3-(4-Iodophényl)-2-(4-nitrophényl)-2H-5-tétrazolio]-1,3-benzène disulfonate
XPS Spectrométrie photoélectronique de rayons X (X-ray photoelectron spectroscopy)



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