Vieillissement musculaire : impact de la protéolyse intracellulaire calcium-dépendante

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Sous la direction de Sylvie Poussard
Thèse soutenue le 25 novembre 2009: Bordeaux 1
La sarcopénie ou perte involontaire progressive de la masse musculaire chez le sujet âgé s’accompagne de l’altération de nombreux phénomènes physiologiques comparables à ceux observés chez les myopathes. Le processus de régénération musculaire est très ralenti, les activités protéolytiques intracellulaires sont modifiées et de nombreuses fonctions cellulaires sont perturbées en raison d’un stress oxydatif incontrôlé. L’intervention des calpaïnes, protéases neutres calcium-dépendantes, dans les processus associés au développement, à la régénération et à l’intégrité du tissu musculaire est incontestable. Les calpaïnes apparaissent, en effet, comme des acteurs clefs des voies de transductions liées à la myogenèse, la prolifération et la survie cellulaire. Toutefois aucune étude permettant d’établir la relation vieillissement du tissu musculaire- activité calpaïne n’a été entreprise à ce jour. Le projet a donc pour but principal d’inventorier les signaux pro-sarcopéniques interagissant avec les calpaïnes et d’établir leurs relations avec la fonctionnalité des cellules satellites, le stress oxydant et l’apoptose. Nous avons mis en évidence une augmentation de l’expression/activité des calpaïnes durant le vieillissement musculaire chez le rat et identifié des partenaires des calpaïnes impliqués dans des fonctions physiologiques altérées durant la sarcopénie: homéostasie calcique, activité contractile, production d’ATP, régénération musculaire. Nous avons également montré que l’induction d’un stress oxydant entraîne l’activation des calpaïnes au cours de la prolifération des cellules satellites de façon corrélée à une augmentation de l’apoptose. D’une manière intéressante, un traitement préventif par un antioxydant naturel d’écorce de pin (Oligopin®) est capable de prévenir à la fois l’apoptose et l’activation des calpaïnes. L’ensemble de ces résultats suggère que le stress oxydant associé au vieillissement induirait des mécanismes calpaïno-dépendants responsables de l’altération de processus essentiels à la fonction musculaire.
-Calpaïnes
-Stress oxydant
-A-actinine 3
-ATP synthase
-Ryr1
-Sarcopénie
-Muscle
Aging is associated with a progressive and involuntary loss of muscle mass also known as sarcopenia. This condition represents a major public health concern. Although sarcopenia is well documented, the molecular mechanisms of this condition still remain unclear. The calcium-dependent proteolytic system is composed of calcium dependent cystein-proteases named calpains. Calpains are involved in a large number of physiological processes such as muscle growth and differentiation, and pathological conditions such as muscular dystrophies. The aim of this study was to determine the involvement of the proteolytic system in the phenotype associated with sarcopenia by identify the key proteins (substrates or regulators) interacting with calpains during muscle aging and identify pro-sarcopenic signals after oxidative stress induction in satellite cells. Muscle aging was correlated with the up-regulation of calpain activity. Ryanodine receptor 1, ATP synthase subunit alpha and alpha actinin 3 appear as key partners of calpains during muscle aging. Such interactions suggest an implication of calpains in many processes altered during aging including cytoskeletal disorganisation, regulation of calcium homeostasis and mitochondrial dysfunction. Furthermore, oxidative stress induction led to an increase in the activity of calpains correlated to an increase in apoptosis of proliferating satellite cells. In a very interesting way, a preventive treatment with a commercial antioxidant (Oligopin®) prevented these effects. All these data suggest that oxidative stress coupled observed during muscle aging could lead to calpaïno-dependent mechanisms responsible for apoptosis and muscle dysorganisation.
-Calpains
-Muscle aging
-Sarcopenia
-ATP synthase Ryr1 a-actinin 3
Source: http://www.theses.fr/2009BOR13899/document
Publié le : vendredi 28 octobre 2011
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THESE
Présentée à
L’Université Bordeaux 1


Ecole doctorale des sciences de la vie et de la santé

Par monsieur Cédric BRULE

Pour obtenir le grade de
DOCTEUR

Spécialité : Nutrition

=================================
Vieillissement musculaire : impact de la protéolyse
intracellulaire calcium-dépendante
Thèse dirigée par Sylvie POUSSARD et Elise DARGELOS
Soutenue le 25 novembre 2009

Après avis de Mrs.
Daniel BECHET Directeur de Recherche, INRA de Theix
Bertrand FRIGUET Professeur, Université Paris 6


Devant la commission d’examen formée de Mmes et Mrs

Véronique PALLET Professeur, Université Bordeaux 1 Présidente du jury
Daniel BECHET Directeur de Recherche, INRA de Theix Rapporteur
Bertrand FRIGUET Professeur, Université Paris 6 Rapporteur
Isabelle BOURDEL-MARCHASSON Professeur H-U, Bordeaux 2 Examinatrice
Vincent MOULY Directeur de Recherche, CNRS/Université Paris 6 Examinateur
Sylvie POUSSARD Ingénieur de Recherche, Université Bordeaux 1 Directrice de thèse
Elise DARGELOS Maître de conférences, Université Bordeaux 1 Membre invité












































Remerciements


Ce travail a été réalisé au sein de l’Unité Protéolyse, Croissance et Développement
musculaire dans le cadre d’une allocation de thèse accordée par la région Aquitaine.

Je tiens tout d’abord à exprimer ma gratitude envers Monsieur le Professeur Patrick
COTTIN pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire et pour m’avoir prodigué une
quantité impressionnante de conseils aussi bien pour l’étude des calpaïnes que pour la vie
quotidienne.
J’exprime également ma reconnaissance à Mesdames Sylvie POUSSARD et Elise
DARGELOS pour m’avoir encadrée brillamment et soutenue durant ces trois années. Leurs
précieux conseils couplés à leurs qualités scientifiques et pédagogiques m’ont permis
d’évoluer sereinement lors de l’exercice difficile qu’est une thèse. Sans elles, je ne serais pas
arrivé là ou j’en suis. De plus, je tiens à signaler que nos rapports ont dépassé le cadre du
laboratoire et je me réjouis des contacts humains que j’ai pu entretenir avec elles.

Je tiens à remercier tous les membres du jury, Madame Véronique PALLET pour
l’avoir présidé, Monsieur Bertrand FRIGUET pour avoir jugé ce travail, Madame Isabelle
BOURDEL-MARCHASSON et Monsieur Vincent MOULY pour avoir examiné mon
manuscrit. De plus, je tiens à remercier particulièrement Monsieur Daniel BECHET pour
avoir jugé mon travail ainsi que pour m’avoir accueilli un mois entier dans son unité afin de
récupérer du matériel biologique ainsi que pour acquérir des nouvelles techniques de
laboratoire.

Je tiens également à remercier tous les membres du laboratoire pour m’avoir
supporté pendant ma thèse, ainsi que pour leur bonne humeur et leurs conseils scientifiques.
Un grand merci plus particulier et une grande amitié à Abdessatar HADJ-SASSI, Pierre
LOCHET et Amélie PIRES-ALVES pour leur bonne humeur matinale et leurs conseils
scientifiques (ou non) avisés ; un merci pour Cynthia DUBOURG pour sa disponibilité et sa
gentillesse lors de mes questions incessantes sur l’administratif ; ainsi qu’à tous les autres
membres du laboratoire : Laetitia DAURY-JOUCLA, Jacques RAYMOND, Jean-Jacques
BRUSTIS et Philippe VESCHAMBRE avec qui j’ai pris beaucoup de plaisir à travailler et à
partager des moments agréables.

Je tiens à remercier les personnes que j’ai pu côtoyer à l’ISTAB, Bruno VARICHON
et Julien MONTEL pour les discussions endiablées de pauses déjeuner.

J’adresse mes sincères remerciements à mes compagnons étudiants thésards, Docteur
ou bientôt Docteur : Ludovic, Pascal et Hélène pour leur soutien ainsi que pour leur aide
diverse et variée. Egalement, un grand merci aux stagiaires et étudiants qui ont eu le malheur
de travailler avec moi : Antoine, Audrey, Asmae, Ramata et Laurianne ; je vous souhaite
beaucoup de réussite pour l’avenir.

Je tiens à remercier tous mes amis qui ont cru en moi sans même comprendre un
traître mot de ce que je racontais quand je leur expliquais mon travail.

Enfin, un grand merci à ma très chère épouse qui a enfin compris dans ces derniers
mois le difficile travail de supporter un thésard lors de l’écriture du manuscrit et de la
préparation de l’oral. Rien que pour cela, elle mériterait une médaille. De plus, je la remercie
pour son soutien sans faille lors des moments difficiles.

Merci à toutes les personnes que j’ai pu oublier (toutes mes excuses) et merci à ceux
qui ont lu ou liront ce manuscrit.

















Sommaire

Avant propos ........................................................................................................ 1

Introduction ..........................................................................................................3
ère1 partie : le système protéolytique neutre calcium-dépendant : les calpaïnes......... 4
I Généralités, structure des calpaïnes ............................................................ 5
I A Les calpaïnes ubiquitaires.................................................................. 5
I B Les calpaïnes tissus spécifiques.......................................................... 7
II Localisation des calpaïnes........................................................................ 9
III Régulation de l’activité des calpaïnes ubiquitaires.................................... 10
III A Le calcium.................................................................................. 10
III B Les phospholipides et autres activateurs directs ................................ 11
III C La calpastatine............................................................................. 13
IV Substrats et fonctions physiologiques des calpaïnes.................................. 16
V Les calpaïnopathies .............................................................................. 16

ème2 partie : Le muscle strié squelettique ......................................................... 19
I Organisation cellulaire ........................................................................... 21
I A Le sarcomère................................................................................. 22
I B Le sarcolemme 24
I C Le réticulum sarcoplasmique............................................................ 26
II Les différents types de fibres musculaires ................................................ 27

ème3 partie : Myogenèse et régénération musculaire........................................... 29
I La myogenèse....................................................................................... 30
I A Les facteurs de transcriptions myogéniques........................................ 31
I B Implication des calpaïnes au cours de la myogenèse ............................ 32
II La régénération musculaire.................................................................... 33
II A Les cellules satellites : activation de la régénération ........................... 34
II B Les cetellites : régulation de la régénération 36

ème4 partie : Les atrophies musculaires et le système protéolytique neutre calcium-
dépendant............................................................................................................... 39
I La myopathie de Duchenne..................................................................... 41
II La LGMD2A....................................................................................... 43
III La sarcopénie ou vieillissement musculaire............................................. 46
III A Apoptose et vieillissement musculaire 46
III B Le stress oxydant et son rôle au cours du vieillissement musculaire ..... 49
III B 1 Les bases des ROS ................................................................ 49
III B 2 Stress oxydant et vieillissement ............................................... 52
III B 3 Conséquences du stress oxydant sur le vieillissement musculaire.. 53
III C : Causes et conséquences de la perte d’énergie produite par le
métabolisme durant le vieillissement musculaire........................................................... 54
III C 1 Les mutations de l’ADNmt dans le muscle âgée : lien avec la perte
d’énergie ................................................................................................................ 54
III C 2 Les conséquences cellulaires de la déplétion en énergie............... 56


Résultats .............................................................................................................. 59

Chapitre 1 : article 1 : Evolution du système protéolytique neutre calcium-dépendant
durant le vieillissement du muscle squelettique ............................................................ 60

article 2 : Etude protéomique des voies de signalisations calpaïno-
dépendantes au cours du vieillissement musculaire ....................................................... 73

Chapitre 2 : article 3 Augmentation de la protéolyse neutre calcium-dépendante chez
des myoblastes humains après induction par un stress oxydant..................................... 111

Conclusions perspectives .................................................................................. 125

Références bibliographiques ............................................................................. 134

Annexes ............................................................................................................ 166













Table des abréviations


ACBP : Acyl-Coa binding protein
ADN : Acide désoxyribonucléique
ADNc : Acide désoxyribonucléique complémentaire
ARN : Acide ribonucléique
ATP : Adénosine triphosphate
bHLH : Basic helix-loop-helix
Cdk: Cyclin dependent kinase
CSQ: Calsequestrine
Css1 / Css2 : Calpain small subunit 1 / 2
DGC : Dystrophin-glycopretein complex
DHPR : Récepteurs dihydropyridine
DMD : Duchenne Muscular Dystrophy
EDTA : Acide éthylène diamine tétraacétique
EGF : Epidermal growth factor
ERK: Extracellular signal-regulated kinase
FGF : Fibroblast growth factor
GAPDH: Glyceraldéhyde 3-phosphate déhydrogénase
G6PD : Glucose 6-phosphate dehydrogénase
GR : Glutathion reductase
GSH : Glutathion
HGF : Hepatocyte growth factor
Hsp: Heat shock protein
IGF : Insulin-like growth factor
IL-6: Interleukine-6
IS1 / IS2 : Insertion sequence 1 / 2
JP: Junctophiline
LGMD-2A : Limb-girdle muscular dystrophy type 2A
MARCKS: Myristoylated alanin-rich C-kinase substrate
MAPK: Mitogen activated protein kinase
MEC : Matrice extracellulaire
MEF-2: Myocytes enhancer factor-2
MG29: Mitsugumine 29
MRF : Myogenic regulatory factor
MyBP: Myosine Binding Proteins
MyHC: Myosine heavy chain
NS: Nuclear sequence
PI : phosphatidylinositol
PKA, C : Protéine kinase A, C
PS: Phosphatidylsérine
ROS: Reactive oxygen sprecies
Ryr 1 : Ryanodin receptor 1
SERCA : Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase
SOD : Superoxyde dismutase
SDS: Sodium dodécyl sulfate
SDS-PAGE : Sodium dodécyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis
SR : Réticulum sarcoplasmique
SRF: Serum-response factor
TGF- β, α: Transforming growth factor- β, α
TNF- α: Tumor necrosis factor- α
VICR: Voltage induced calcium release




Liste des figures


Figure 1 : structure des calpaïnes ubiquitaires ......................................................................... . 6

Figure 2 : structure schématique de la calpaïne 3 ......................................................................8

Figure 3 : mécanisme d’activation des calpaïnes..................................................................... 11

Figure 4 : structure schématique de la calpastatine humaine ................................................... 14

Figure 5 : représentation schématique du modèle d’interaction calpastatine/calpaïne ............ 15

Figure 6 : organisation générale de la structure et de la composition du muscle strié
squelettique............................................................................................................................... 20

Figure 7 : structure du sarcomère............................................................................................. 22

Figure 8 : organisation moléculaire du sarcomère ................................................................... 24

Figure 9 : structure des costamères au niveau du sarcolemme ................................................ 25

Figure 10 : structure schématique de la jonction tubule T/SR ................................................. 27

Figure 11 : la différenciation myogénique ............................................................................... 29

Figure 12 : représentation schématique des cinq étapes de la fusion des myoblastes ............. 32

Figure 13 : les différentes étapes de la régénération musculaire.............................................. 36

Figure 14 : facteurs influençant l’activité des cellules satellites 37

Figure 15 : actions possibles des calpaïnes ubiquitaires durant l’atrophie musculaire............ 40

Figure 16 : structure schématique de la dystrophine................................................................ 41

Figure 17 : le réseau du complexe dystrophine-glycoprotéines............................................... 42

Figure 18 : répartition des mutations identifiées chez les patients LGMD2A ......................... 43

Figure 19 : schéma des protéines sarcomériques impliquées dans des dystrophies musculaires
et associées ou non à la calpaïne 3 ........................................................................................... 45

Figure 20 : schéma des voies entraînant l’apoptose ................................................................ 49

Figure 21 : voies principales de lutte contre l’oxydation cellulaire ......................................... 51

Figure 22 : ROS, inflammation et vieillissement .................................................................... 53

Figure 23 : Causes principales de la perte d’énergie dans les fibres musculaires âgées.......... 55

Figure 24 : Modèle récapitulatif des différents résultats obtenus durant la thèse .................. 133




Liste des tableaux


Tableaux I : les différentes calpaïnes et leur distribution tissulaire ........................................... 7

Tableaux II : caractéristiques fonctionnelles, structurales et métaboliques des fibres
musculaires chez l’homme ....................................................................................................... 28

Tableaux III : marqueurs de cellules satellites......................................................................... 35



























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