Conception, évaluation et optimisation de fragments d'anticorps recombinants à visée thérapeutique

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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par Julien MUZARD pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Conception, évaluation et optimisation de fragments d'anticorps recombinants à visée thérapeutique Soutenu à Paris, le 10 Septembre 2004, devant le jury suivant : Pr. Jean-Claude GLUCKMAN INSERM E 0013 - Hôpital Saint- Antoine, Paris. Président Dr. Flore RENAUD PAITRA CNRS UPRES - A 8087, Versailles. Rapporteur Pr. Joseph SCHREVEL USM 504- Muséum National d'Histoire Naturelle, Paris. Examinateur Pr. Philippe BILLIALD Biochimie - Faculté de Pharmacie, Tours. Examinateur Pr. Max GOYFFON USM 505- Muséum National d'Histoire Naturelle, Paris. Examinateur Laboratoire de Génétique Moléculaire et Physiologique EPHE Université de Versailles/Saint-Quentin, CNRS UPRES-A 8087, Bât. Fermat 45 av.des Etats Unis. 78035 Versailles. Directeur : Bernard Mignotte. Laboratoire d'accueil USM 505 – Lerai. Muséum National d'Histoire Naturelle. 57, rue Cuvier 75231 PARIS CEDEX 05. Directeur scientifique : Philippe Billiald. ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES EPHE Banque de Monographies SVT 1

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Source : ephe.sorbonne.fr
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE   ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES  Sciences de la Vie et de la Terre    MEMOIRE  présenté  par  Julien MUZARD   pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes    Conception, évaluation et optimisation de fragments d’anticorps recombinants à visée thérapeutique  
Soutenu à Paris, le 10 Septembre 2004, devant le jury suivant :  Pr. Jean-ClaudeINSERM E 0013 - Hôpital Saint-Président GLUCKMANAntoine, Paris. Dr. Flore RENAUDCNRS UPRES - A 8087, Versailles.Rapporteur PAITRA Pr. Joseph SCHREVELUSM 504- Muséum NationalExaminateur d’Histoire Naturelle, Paris. Pr. Philippe BILLIALDBiochimie - Faculté de Pharmacie,Examinateur Tours. Pr. Max GOYFFONUSM 505- Muséum NationalExaminateur d’Histoire Naturelle, Paris.     Laboratoire de Génétique Moléculaire et Laboratoire d'accueil Physiologique EPHE USM 505 – Lerai. Université de Versailles/Saint-Quentin, CNRS Muséum National d’Histoire Naturelle. UPRES-A 8087, Bât. Fermat rue Cuvier 75231 PARIS CEDEX 05. 45 av.des Etats Unis. 78035 Versailles.5D7i,recteur scientifique : Philippe Billiald. Directeur : Bernard Mignotte. billiald m mignotte@genetique.uvsq.fr@nhn.fr
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
 Sciences de la Vie et de la Terre -- Mémoire présenté par  Julien MUZARD   Soutenu le 10 Septembre 2004   Conception, évaluation et optimisation de fragments d’anticorps recombinants à visée thérapeutique   La sérothérapie, seul traitement spécifique des envenimations scorpioniques repose sur l’utilisation de fragments d’anticorps polyclonaux hétérologues (Fab ou F(ab)’2) produits par protéolyse ménagée. La préparation de ces antivenins est délicate, leur pouvoir protecteur est souvent faible et leur administration comporte des risques d’effets secondaires (maladie sérique, réactions d’hypersensibilité), sans négliger le risque de contamination par des agents pathogènes. Dans ce contexte, l’utilisation de nouveaux fragments d’anticorps recombinants aux propriétés améliorées pourrait être une alternative de choix en terme d’homogénéité, d’activité spécifique et de sécurité d’emploi.  En utilisant comme support expérimental l’hybridome 9C2 sécréteur d’une IgG monoclonale dirigée contre la toxineAahI du venin de scorpion tunisienAndroctonus australis hector, nous avons développé différents formats d’anticorps recombinants capables de neutraliser l’action de cette toxine active sur les canaux sodium des cellules excitables. Ces fragments d’anticorps monovalents ont été produits sous forme soluble dans des bactéries recombinantes puis purifiés par chromatographie d’affinité. Leurs propriétés structurales ainsi que leurs caractéristiques fonctionnelles ont été analysées. Les résultats obtenus montrent que la production de Fab recombinant actif est délicate (Toxicon; 43 : 233-41). En revanche, les fragments d’anticorps multivalents d’une taille, 2004 sensiblement équivalente à celle des Fab ou des F(ab)’2possèdent des caractéristiques fonctionnelles intéressantes et un pouvoir protecteur élevé. Ces résultats laissent entrevoir la possibilité de développer de nouvelles molécules poly-spécifiques neutralisant l’ensemble des effets létaux du venin d’Androctonus australis.      Mots-clés : Fragments d’anticorps, scorpion, toxine, ingénierie moléculaire. TABLES DES MATIERES  LISTE DES ABREVIATIONS…………………………………………….….  A/ INTRODUCTION……………………………………………………….…  
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1. Sérothérapie…………………………………………………………….……….….6 1.1 Historique………………………………………………………………...………... 6 1.2 Principe………………………………………………………………......………… 8   2. Hybridomes et anticorps monoclonaux…………………………………………...9 2.1 Généralités……………………………………………………………….………… 9 2.2 Obtention d’anticorps monoclonaux………………………………………………. 10 2.2.1 Structure d’une immunoglobuline G (IgG)………………….…………... 10 2.2.2 Anticorps monoclonaux murins…………………………………………. 11 2.2.3 Anticorps monoclonaux humains………………………………………... 13 a/ Hybridomes……………………………………………..………….…. 13 b/ Souris transgéniques…………………………………………………... 14 2.3 Applications et limites……………………………………………………………... 15   3. Ingénierie moléculaire et fragments d’anticorps…………………………………16 3.1 Les fragments d’anticorps recombinants…………………………………………... 16 3.1.1 Fragments scFv………………………………………………………….. 17 3.1.2 Multimères de fragments scFv…………………………………………... 18 3.1.3 Fragments Fab recombinants……………………………………………. 20 3.1.4 Fragments d’anticorps bispécifiques……………………………………. 20 3.1.5 Immunotoxines et immunotraceurs recombinants………………………. 21 a/ Immunotraceurs recombinants………………………………………... 21 b/ Immunotoxines recombinantes……………………………………….. 22 3.1.6 Chimérisation et humanisation………………………………………….. 22 3.2 Banques combinatoires de fragments d’anticorps…………………………………. 23 3.2.1 Méthode de sélection à la surface d’un phage (Phage Display)………… 24 3.2.2 Méthode de sélection à la surface d’un ribosome (Ribosome Display)… 26   4. Envenimations scorpioniques……………………………………………………...28 4.1 Les scorpions………………………………………………………………………. 28 4.1.1 Généralités………………………………………………………….…… 28 4.1.2 Les espèces dangereuses pour l’Homme………………………………... 28 4.1.3 Le scorpionisme en Tunisie……………………………………………... 30 4.2 Composition des venins………………………………………………….………… 30 4.3 Les toxines du venin d’Androctonus australis hector……………………………... 31 4.4 Sérothérapie antiscorpionique……………………………………………………... 32 4.4.1 Préparation des antivenins……………………………………………… 32 4.4.2 Problèmes posés………………………………………………………… 33   5. Objectifs de cette étude. …………………………………………………………...34
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 B/ MATERIEL ET METHODES………………………………………….…  1. Hybridome, anticorps monoclonal et fragments recombinants………………...  2. Souches bactériennes, plasmides et milieux de culture……………………….….  3. Techniques de biologie moléculaire………………………………………………. 3.1 Extraction des ARN messagers……………………………………………………. 36 3.2 Transcription inverse………………………………………………………………. 37 3.3 Réactions PCR……………………………………………………………………... 37 3.4 Digestions enzymatiques des ADNc………………………………………………. 39 3.5 Déphosphorylation des extrémités 3’ libres des plasmides linéarisés……………... 39 3.6 Clonage des ADNc……………………………………………………….………... 39 3.7 Purification des plasmides…………………………………………………….…. 40 3.8 Analyses nucléotidique et protéique…………………………………………….…. 40 4. Expression et caractérisation des fragments d’anticorps recombinants…….…. 4.1 Production bactérienne………………………………………………………….…. 41 4.2 Purification par chromatographie d’affinit酅……………………………….…. 41 4.3 Electrophorèses SDS-PAGE et Western-blots………………………………….…. 42 4.4 Chromatographie d’exclusion-diffusion FPLC……………………………………. 42 4.5 Radioimmunodosages……………………………………………………………... 42 4.5.1 RIA directs………………………………………………………………. 42 4.5.2 RIA compétitifs…………………………………………………….…… 43 4.6 Tests de neutralisationin vivo…………………………………………….……….  C/ RESULTATS OBTENUS…………………………………………….……  1. Production, évaluation structurale et fonctionnelle d’un fragment Fab recombinant (rFab) neutralisant la neurotoxineAahI du scorpionAndroctonus australis hector………………………………………………………………………... 1.1 Construction du vecteur d’expression pCOMB Fab 9C2………………………….. 44 1.2 Production du Fab 9C2…………………………………………………………….. 49 1.3 Caractérisations structurale et fonctionnelle……………………………………... 49 1.3.1 SDS-PAGE, Western-blot et FPLC……………………………………... 49 1.3.2 Radioimmunodosages directs et compétitifs……………………………. 50 1.3.3 Tests de neutralisationin vivo…………………………………………… 52   2. Production et caractérisation d’un fragment d’anticorps recombinant de type Triabody dirigé contre la neurotoxine scorpioniqueAahI…………………………54
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2.1 Construction du vecteur d’expression pSW TRI 9C2……………………………... 54 2.2 Production du Triabody 9C2………………………………………......................... 54 2.3 Caractérisations structurale et fonctionnelle……………………………………... 56 2.3.1 SDS-PAGE et FPLC…………………………………….......................... 56 2.3.2 Radioimmunodosages directs et compétitifs……………………………. 57 2.3.3 Tests de neutralisationin vivo…………………………………………… 58    D/ DISCUSSION ET PERSPECTIVES……………………………..……….  E/ BIBLIOGRAPHIE………………………………………………………….  F/ ANNEXE…………………………………………………………………….     Engineering of a recombinant Fab from a neutralizing IgG directed against scorpion neurotoxin AahI, and functional evaluation versus other antibody fragments.   Aubrey N, Muzard J, Christophe Peter J, Rochat H, Goyffon M, Devaux C, Billiald P.  Toxicon. 43 : 233-41 ; 2004.   Aah ADN ADNc ARN ARNm ARNt BSA CH CL A A260 DL50 dNTP E.coli EDTA Fab Fc FPLC FR Fv HAT
LISTE DES ABREVIATIONS Androctonus australis hector Acide désoxyribonucléique Acide désoxyribonucléique complémentaire Acide ribonucléique Acide ribonucléique messager Acide ribonucléique de transfert Sérum albumine bovine Région constante lourde (heavy) Région constante légère (light) Absorbance Absorbance à 260 nm Dose léthale 50 désoxynucléotide-5-triphosphate Escherichia coli Acide éthylène diamine tétraacétique Fragment d’anticorps liant l’antigène (Fragment Antigen Binding) Fragment cristallisable Chromatographie liquide haute performance Région charpente (Framework region) Fragment variable Hypoxanthine guanine thymidine
HGPRT Ig IgE IgG IPTG kDa LB mV PBS PCR PEG rFab RFc RIA RT-PCR scFv SDS PAGE TE TK UV VH VIH VL X-Gal
Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl-transférase Immunoglobuline Immunoglobuline de type E Immunoglobuline de type G Isopropylthio-b-galactoside Kilo Dalton Luria-Broth Millivolt Solution saline phosphate (Phosphate buffered saline solution) Réaction d’amplification en chaîne Polyéthylène glycol Fragment Fab recombinant Récepteur du fragment Fc (Fc receptor) Radioimmunodosage Transcription inverse suivie d’une PCR Fragment variable simple chaîne Sodium dodécyl-sulfate Electrophorèse en gel de polyacrylamide Tampon Tris-EDTA à pH 7,5 Thymidine kinase Ultra-Violet Domaine variable de la chaîne lourde Virus de l’immunodéficience humaine Domaine variable de la chaîne légère 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside
A / INTRODUCTION
 1. Sérothérapie  1.1 Historique  A la fin des années 1880, alors que la diphtérie était responsable en France de plus de 30.000 décès d’enfants, Berhing et Kitasato, en Allemagne, procédaient à des expériences d’immunisation de rats et de cobayes contre la diphtérie. Le 3 décembre 1890, ils publièrent un mémoire établissant que le sang des animaux auxquels ils avaient injecté la toxine diphtérique contenait une substance qui s’oppose aux effets nocifs de la toxine sécrétée par le microbe responsable de la diphtérie (Behring et Kitasato, 1890). Quelques années plus tard, Berhing en Allemagne et Roux en France mettaient au point un sérum antidiphtérique (Roux et Metchnikoff, 1891). La publication de la découverte de Berhing a tout juste un an lorsque, dans la nuit de Noël 1891, un premier enfant est traité par sérothérapie antidiphtérique par Geissler à Berlin. Dès l’année suivante, commençe en Allemagne la production commerciale d’un sérum antidiphtérique. Alors que la découverte de la sérothérapie anti-diphtérique est une magnifique victoire des chercheurs allemands, la sérothérapie antivenimeuse a été mise au point en 1894, simultanément au Muséum National d’Histoire Naturelle de Paris par Phisalix et Bertrand, et aux Instituts Pasteur de Paris et de Saïgon par Calmette.
Phisalix commence ses travaux sur les venins par une série d’expériences sur le venin de la salamandre terrestre, qui l’amène à publier quatre notes, de 1889 à 1891. Dans ces notes, il évoque l’idée de l’analogie entre sécrétions cellulaires toxiques et sécrétions microbiennes. Grâce à une collaboration étroite, Phisalix et Bertrand publient d’abord trois notes sur la toxicité du sang et du venin de crapaud et de vipère, sur l’immunité naturelle au venin de vipère et sur les glandes venimeuses chez les couleuvres, avant d’en arriver à la publication de leur découverte : ‘‘sur les propriétés antitoxiques du sang des animaux vaccinés contre le venin de vipères’’ atténué par la chaleur. La première annonce d’un sérum à activité thérapeutique faite par Calmette a lieu à la séance de la Société de Biologie du 10 février 1894, celle même où Phisalix et Bertrand venaient d’exposer leurs propres résultats. Sa note avait pour titre : ‘‘L’immunisation artificielle des animaux contre le venin des serpents et la thérapeutique expérimentale des morsures venimeuses’’.  Alors que Phisalix et Bertrand étaient tout aussi convaincus que Calmette de l’importance de leur découverte et des conséquences heureuses qu’elle pouvait avoir pour la protection des hommes, seul Calmette sut mettre en oeuvre les moyens pour la faire connaître et la valoriser. La traduction en anglais de son ouvrage sur «Les Venins, les animaux venimeux et la sérothérapie antivenimeuse» puis, en 1909, un article dans leJournal of medical Research de Boston, contribuèrent à universaliser sa découverte. Ses travaux furent ensuite repris et améliorés un peu partout dans le monde et des instituts spécialisés furent crées : Institut Pasteur de Lille, Institut Butantan de Sao Paulo (Brésil), à Sydney (Australie), à Kasauli (Inde) et à Philadelphie (Etats-Unis). A partir de 1936, l’Institut Pasteur d’Alger produit son propre sérum antiscorpionique. Dès 1924, Nuttal écrivait« Rarely in the history of scientific discovery have the results of laboratory researches been followed so rapidly by their practical application, and few indeed are the workers in the domain of application of medical science who have in their lifetime seen comparable benefice accrue to mankind as a direct consequence of their labour »(Brygoo, 1982). Depuis les années 1950, la sérothérapie est beaucoup moins utilisée en thérapie anti-infectieuse, principalement en raison de la découverte de nombreux antibiotiques qui présentent un double avantage : un spectre d’action plus large et une plus grande facilité d’administration, même si aujourd’hui leur utilisation, parfois abusive, entraîne l’apparition de phénomènes de résistances qui constituent un véritable problème médical. L’exemple des souches deStaphylococcus aureus résistants à la méthicilline en est une illustration. Toutefois, dans le domaine des envenimations la sérothérapie reste aujourd’hui encore le seul traitement spécifique. Elle est régulièrement employée, parfois de façon systématique, même si des critiques sont souvent formulées à l’encontre des sérums antivenimeux (effets secondaires, coût, efficacité inconstante). Avec le développement des techniques d’ingénierie moléculaire, une nouvelle génération d’anticorps est en train d’apparaître offrant de nouvelles perspectives à l’immunothérapie passive. Dans ce contexte, des améliorations peuvent être apportées en sérothérapie antivenimeuse.
   
 1.2 Principe  L’introduction chez un individu d’un organisme étranger (virus, bactérie, parasite, champignon) ou de toute substance reconnue comme différente des molécules du “soi” conduit à la production par les lymphocytes B d’anticorps dirigés contre des motifs moléculaires (déterminants antigéniques ou épitopes) présents sur ces organismes ou ces substances. Ainsi, les lymphocytes B d’un animal immunisé vont produire des anticorps dirigés spécifiquement contre des déterminants antigéniques présents sur les molécules du “non soi”. Le sérum de l’animal (ou immunsérum) contient alors de nombreux anticorps dont les propriétés biologiques et physico-chimiques peuvent varier, y compris pour ceux qui sont dirigés contre le même déterminant. L’immunogène va induire la stimulation et la prolifération de nombreux lymphocytes B, chacun donnant naissance à une population de cellules filles (un clone), identiques entre elles, qui vont se différencier en plasmocytes sécréteurs du même anticorps. L’immunsérum contient donc un mélange d’anticorps (différents isotypes d’IgG et d’IgM avec des affinités différentes) produits par ces clones de lymphocytes B : il s’agit de la réponse anticorps polyclonale. Les immunsérums ont depuis longtemps été utilisés comme outils en recherche, pour le diagnostic, mais aussi en immunothérapie. Cependant, leur utilisation pose différents problèmes. Le plus important est celui de la reproductibilité de leurs caractéristiques fonctionnelles. Un immunsérum n’est pas disponible en quantité illimitée, la qualité d’un immunsérum dépend de la réponse immunitaire qu’a développé l’animal immunisé, deux antisérums dirigés contre la même molécule, même produit chez deux individus de la même espèce, n’auront pas exactement les mêmes propriétés qualitatives et quantitatives. Les titres vont être différents, l’affinité des anticorps qui les composent pourra varier, et les quantités relatives des différents anticorps ne seront pas les mêmes. L’utilisation thérapeutique d’immunsérums est rendue délicate pour ces raisons, mais aussi en raison des effets secondaires associés à l’administration de protéines hétérologues, principalement des réactions d’hypersensibilité. A cela s’ajoute l’incapacité des anticorps hétérologues à recruter les cellules effectrices du système immunitaire humain, à fixer la molécule C1q de la voie classique du complément, où à se lier aux récepteurs des régions Fc présents sur les cellules du système immunitaire. Pour toutes ces raisons, les travaux portant sur le développement d’anticorps aux propriétés améliorées ont été depuis longtemps stimulés et ont conduit d’abord à la mise au point de la technologie des hybridomes sécréteurs d’anticorps monoclonaux (1975), ensuite au développement
des techniques d’ingénierie moléculaire de ces anticorps (1990). D’importantes avancées, tant sur le plan de la recherche (caractérisation biochimique et fonctionnelle de nombreux antigènes) que sur le plan diagnostique et thérapeutique ont été réalisées (Casadevall, 1999).   2. Hybridomes et anticorps monoclonaux            2.1 Généralités  Les bases théorique et pratique de la fabrication d’anticorps monoclonaux proviennent de deux courants de recherche : la génétique, qui a apporté les bases conceptuelles et technologiques permettant la fabrication des hybridomes et l’immunologie, qui a tenté d’analyser la nature et la structure des anticorps produits par les lymphocytes B. C’est en 1975 que César Milstein et Georges Köhler ont appliqué la technique de fusion cellulaire et de sélection de cellules tumorales (dérivées de myélome de souris) aux lymphocytes B. Ils fusionnèrent des lymphocytes B normaux provenant d’une souris immunisée par des globules rouges de mouton avec des cellules de myélome. Cette fusion a donné naissance à des cellules hybrides immortelles produisant, pour certaines d’entre elles, un anticorps monoclonal dirigé contre les globules rouges de mouton. Cette découverte fut considérée comme capitale et valut à ses auteurs l’attribution du Prix Nobel de Médecine et de Physiologie (1984). Les hybridomes ont deux propriétés essentielles : d’une part, ils se multiplient indéfiniment, comme les cellules de myélome, en donnant naissance à des populations de cellules filles identiques entre elles ; et d’autre part, ils produisent l’anticorps que le lymphocyte B dont ils dérivent, fabriquait. Chaque clone de cellules filles produit donc le même anticorps, qui est dit monoclonal. Les avantages d’un tel anticorps par rapport aux immunsérums sont importants : les hybridomes sont gardés en culturein vitro modification de l’anticorps qu’ils produisent. sans Ils peuvent être conservés par congélation sans perdre leur propriété de sécrétion d’anticorps car ils sont habituellement stables, particulièrement s’il s’agit d’hybridomes murins. On dispose d’une source illimitée de cellules produisant toujours le même anticorps, ayant la même affinité et les mêmes propriétés physico-chimiques. Enfin, l’ADN codant les chaînes lourdes et légères de cet anticorps peut être isolé et cloné à des fins d’ingénierie moléculaire. Il devient alors possible de concevoir de nouveaux formats de molécules à activité anticorps aux propriétés améliorées et mieux adaptées à des applications thérapeutiques.   2.2 Obtention d’anticorps monoclonaux   2.2.1 Structure d’une immunoglobuline G (IgG)   Les IgG sont des protéines tétramériques glycosylées, formées de deux chaînes lourdes (50 kDa) et de deux chaînes légères (25 kDa). Les deux types de chaînes sont organisés en domaines
globulaires, d’environ 110 résidus d’acides aminés (12,5 kDa) chacun, stabilisés par un pont disulfure. Les chaînes sont reliées par des ponts disulfure et par des liaisons non covalentes pour former une structure bivalente avec deux sites de liaison à l’antigène.  Les domaines N-terminaux des chaînes lourdes (H) et des chaînes légères (L) sont caractérisés par des séquences variables (V). Chaque domaine variable contient quatre régions charpentes conservées (FR ou framework) et trois régions appelées CDR (complementarity determining regions) correspondant à des séquences dites ‘‘hypervariables’’ qui déterminent la spécificité de l’anticorps. Les régions charpentes, bien qu’elles ne participent pas directement à la liaison à l’antigène, jouent un rôle important, lors du repliement des domaines variables, dans le maintien de l’intégrité du site anticorps (Davies et Metzger, 1983).        
 2.2.2 Anticorps monoclonaux murins   Pour produire des hybridomes sécréteurs d’anticorps monoclonaux, les lymphocytes B provenant d’une rate ou de ganglions lymphatiques d’une souris ou d’un rat immunisés sont fusionnés in vitro à des cellules myélomateuses, en présence de polyéthylène glycol (PEG). Ce dernier est un agent de fusion des membranes plasmiques. L’utilisation du PEG, mise au point par Pontecorvo (1975), a permis d’éviter l’utilisation du virus de Sendaï, également capable de fusionner les membranes plasmiques, mais qui présente l’inconvénient majeur d’être un agent pathogène. Pour faciliter la sélection des cellules de fusion, les cellules de myélome utilisées sont déficientes en une enzyme, habituellement l’hypoxanthine-guanine phosphoribosyl-transférase (HGPRT-), ou plus rarement, la thymidine kinase (TK-). En effet, ces deux enzymes assurent une étape essentielle de la voie alterne de synthèse des nucléotides (la catalyse de la réaction entre une base purique et un phosphoribosyl-pyrophosphate, conduisant à la formation d’un nucléotide purique monophosphate). Leur déficit conduit obligatoirement la cellule à utiliser la voie de néosynthèse des nucléotides, qui pourra être bloquée par des drogues telles que l’aminoptérine, l’azasérine ou le méthotrexate. Par ailleurs, les cellules de souris les plus utilisées comme partenaires de fusion, P3X63Ag8 et Sp2/0-Ag14, dérivées du myélome MOPC21, sont des variants qui ont perdu la capacité de synthétiser leur propre chaîne lourde et légère d’immunoglobuline. Une fois la fusion effectuée, les cellules hybrides sont mises en culture dans un milieu contenant un agent de sélection, en général l’aminoptérine. Cette drogue bloque la seule voie de synthèse de nucléotides restant aux cellules parentales de myélome déficientes en enzyme HGPRT ou TK. Elle permet ainsi la sélection des cellules hybrides, qui, par complémentation génique, expriment une enzyme fonctionnelle (HGPRT+ou TK+) et qui sont donc capables d’utiliser la voie alterne de synthèse de nucléotides à partir de nucléosides. L’apport d’hypoxanthine exogène dans le milieu de culture permet alors de satisfaire les besoins en purines.
 
De plus, le milieu de sélection contient également de la thymidine, parce que l’aminoptérine est un anti-folate qui bloque également la thymidylate synthase. Ce milieu est donc désigné sous le nom de HAT, pour Hypoxanthine, Aminoptérine, Thymidine. Les lymphocytes B normaux, isolés de la rate ou des ganglions, incapables de se répliquer longtempsin vitro, vont, quant à eux, disparaître en quelques jours. En quelques semaines, des cellules hybrides prolifèrent. Ces cellules sont clonées, très souvent, par la méthode des dilutions limites, puis les clones sécréteurs d’un anticorps d’intérêt sont sélectionnés par des méthodes de criblages extrêmement variées (ELISA, blot...). La plupart des hybridomes sont produits par fusion de lymphocytes de souris avec des cellules de myélome de souris ou bien de lymphocytes de rats avec des cellules de myélome de souris ou de rat. Ces fusions ne posent que peu de problèmes d’instabilité génétique et permettent d’obtenir assez rapidement des hybridomes sécréteurs d’anticorps monoclonaux.      2.2.3 Anticorps monoclonaux humains   a)     Hybridomes  L’hybridation de lymphocytes humains avec des cellules de myélome d’autres espèces (souris ou rat) ou avec des cellules de myélome humain est également possible, mais des problèmes majeurs sont alors rencontrés. Outre la palette restreinte d’antigènes utilisables pour des immunisations expérimentales chez l’Homme, les hybridomes obtenus ne sont jamais stables, notamment lorsqu’il s’agit d’hybrides [homme x souris/rat]. L’obtention d’anticorps monoclonaux humains par la technologie des hybridomes reste donc une méthode très peu performante. La technique cellulaire, qui a été la plus utilisée pendant longtemps, consiste à immortaliser les lymphocytes B dun donneur au moyen du virus dEpstei-n Barr, puis à fusionner les lymphocytes B ainsi immortalisés avec des cellules d’un myélome humain pour obtenir des hybridomes relativement stables, sécrétant un anticorps produit par les lymphocytes B humains. Toutefois, l’utilisation de cette technologie de fusion cellulaire reste limitée. Pour des raisons éthiques par exemple, on ne peut immuniser un être humain contre n’importe quels antigènes de type toxine ou agent pathogène. Les seuls lymphocytes humains susceptibles d’être immortalisés sont donc spécifiques d’antigènes vaccinaux, de bactéries ou de virus ayant infecté des patients de façon naturelle.  b) Souris transgéniques  Une approche visant à l’obtention d’anticorps monoclonaux humains directement chez la
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