ETUDE DES EFFETS DE LA SUPPLEMENTATION DE L'ALIMENTATION DE HAMSTERS SYRIENS EN ACIDES GRAS POLYINSATURES DE LA SERIE n-3, SUR LES ALTERATIONS DE LA REACTIVITE AORTIQUE ENDOTHELIUM DEPENDANTE INDUITES PAR LA LYSOPHOSPHATIDYLCHOLINE.

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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Science de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Anthony LUCAS Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes TITRE : ETUDE DES EFFETS DE LA SUPPLEMENTATION DE L'ALIMENTATION DE HAMSTERS SYRIENS EN ACIDES GRAS POLYINSATURES DE LA SERIE n-3, SUR LES ALTERATIONS DE LA REACTIVITE AORTIQUE ENDOTHELIUM DEPENDANTE INDUITES PAR LA LYSOPHOSPHATIDYLCHOLINE. Soutenu le : 8 Octobre 2007 devant le jury suivant : Professeur Jean Chambaz Président Professeur Jean-Louis Paul Examinateur Professeur Bernard Lacour Examinateur Docteure Françoise Goirand Examinateur Docteure Michèle Chabert Rapporteur Laboratoire de Nutrition lipidique et Directeur : Pr Bernard Lacour apoptose dans le système vasculaire EPHE (Science de la Vie et de la Terre) UMR 1154 Nutrition Lipidique et Régulation Directeur : Dr Alain Grynberg Fonctionnelle du Coeur et des Vaisseaux Tuteur : Dr Françoise Goirand Faculté de pharmacie, Université de Paris XI ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE EPHE Banque de Monographies SVT 1

  • relaxation aortique

  • no monoxyde d'azote

  • régulation endothéliale de la vasoconstriction

  • structure de la paroi artérielle

  • mécanismes de régulation du tonus vasculaire

  • acide arachidonique

  • voies de relaxation impliquant la libération de no

  • hamster


Publié le : lundi 1 octobre 2007
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE    ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES  Science de la Vie et de la Terre  MEMOIRE Présenté par  Anthony LUCAS  Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes  TITRE :  ETUDE DES EFFETS DE LA SUPPLEMENTATION DE L’ALIMENTATION DE HAMSTERS SYRIENS EN ACIDES GRAS POLYINSATURES DE LA SERIE n-3, SUR LES ALTERATIONS DE LA REACTIVITE AORTIQUE ENDOTHELIUM DEPENDANTE INDUITES PAR LA LYSOPHOSPHATIDYLCHOLINE.
  Soutenu le : 8 Octobre 2007 devant le jury suivant :  Professeur Jean Chambaz Président  Professeur Jean-Louis Paul Examinateur  Professeur Bernard Lacour Examinateur  Docteure Françoise Goirand Examinateur  Docteure Michèle Chabert Rapporteur    Laboratoire de Nutrition lipidique et Directeur : Pr Bernard Lacour apoptose dans le système vasculairefrphp.ck.aocaln@runreb.dra EPHE (Science de la Vie et de la Terre)  UMR 1154 Nutrition Lipidique et Régulation Directeur : Dr Alain Grynberg Fonctionnelle du Coeur et des Vaisseaux Tuteur : Dr Françoise Goirand Faculté de pharmacie, Université de Paris XIr.fdnarb-u@gruoengoG.ioioesarcnF  ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE
 ETUDE DES EFFETS DE LA SUPPLEMENTATION DE L’ALIMENTATION DE HAMSTERS SYRIENS EN ACIDES GRAS POLYINSATURES DE LA SERIE n-3, SUR LES ALTERATIONS DE LA REACTIVITE AORTIQUE ENDOTHELIUM DEPENDANTE INDUITES PAR LA LYSOPHOSPHATIDYLCHOLINE.  Anthony LUCAS  Mémoire soutenu le  RESUME  Objectif. deLe but de ce travail était d’étudier les effets préventifs de l’apport alimentaire deux AGPI n-3, les acides eicosapentaénoïque (EPA) et docosahexaénoïque (DHA), sur les effets délétères de la lysophosphatidylcholine (LPC) sur la relaxation endothélium-dépendante d’aortes de hamsters syriens.Méthodes.Dans une première série d’expérimentations, les effets d’une gamme de concentrations de LPC (0, 10, 15, 20µM) ont été testés sur la relaxation aortique endothélium-dépendante induite par l’acétylcholine (ACh 10-9à 3.10-5M) et endothélium-indépendante induite par le nitroprussiate de sodium (10-9à 3.10-5comparativement à ceux de la phosphatidylcholine (PCM), 0, 10, 20µM). Dans la suite des travaux, l’influence de la LPC 20 µM a été testée sur les voies de relaxation impliquant la libération de NO et les métabolites de l’acide arachidonique. Le L-NAME (100µM) a permis de bloquer les NO synthases, la MAFP (0, 10, 25, 60µM) et le AACoCF3 (0, 10, 20µM) la PLA2, l’indométhacine (10µM) les cyclooxygénases, le 17-ODYA (10µM) les 17b-hydroxylases et le sulfaphénazole (10µM) les monoxygénases CYP2C9-dépendantes. Dans une seconde série expérimentale, 3 groupes de hamsters ont été nourris, pendant 5 semaines, avec un régime contrôle ou supplémenté en EPA ou en DHA. La composition lipidique des parois aortiques a été analysée par chromatographie gazeuse. La relaxation aortique induite par l’ACh (10-9à 3.10-5M), a été testée en présence ou en absence de LPC (20µM) et/ou d’inhibiteurs (L-NAME 100µM; AACoCf3 20µM; charybdotoxine 1µM + apamine 0,3µM, inhibiteurs des BKCaet SKCa).Résultats. La LPC inhibe de façon concentration-dépendante la relaxation aortique induite par l’ACh. En présence ou non de LPC, la relaxation induite par l’ACh est entièrement inhibée par le L-NAME. La relaxation induite par l’ACh en présence de LPC est inhibée par la MAFP et l’AACoCF3, mais non modifiée par l’indométhacine, le 17-ODYA et le sulfaphénazole. En présence de LPC, la charybdotoxine et l’apamine inhibent la relaxation induite par l’ACh. L’apport dans l’alimentation d’EPA ou de DHA s’accompagne d’une intégration de ces composés dans les phospholipides membranaires aortiques. Les AGPI n-3 potentialisent les effets délétères de la LPC sur la vasorelaxation aortique induite par l’ACh et restent sans effets apparents sur l’ensemble des voies de signalisation testées.Conclusions. La LPC inhibe la relaxation induite par l’ACh dans l’aorte de hamster syrien en inhibant principalement la libération du NO tout en stimulant la voie de la PLA2. Par ailleurs, la LPC, induit un SK des cellules e activation des canaux potassiques BKCa etCa musculaires lisses. Les effets délétères induits par la LPC ne sont pas corrigés par l’apport d’EPA ou de DHA dans l’alimentation des animaux. MOTS CLES :Réactivité vasculaire,AGPI n-3, EPA, DHA, NO, lysophosphatidylcholine, acide arachidonique, aorte, Hamster syrien, endothélium SOMMAIRE
INDEX DES SCHÉMAS...............................................
INDEX DES TABLEAUX.............................................
INDEX DES FIGURES.................................................
I INTRODUCTION .......................................................................................................7............ I.1 Epidémiologie de l’athérosclérose...................................................................................... 8 I.2 Facteurs de risque............................................................................................................... 9 I.2.1 Les facteurs non modifiables.......................................................................................... 9 I.2.2 Les facteurs modifiables................................................................................................. 9 I.3 Structure de la paroi artérielle......................................................................................... 10 I.3.1 L’adventice................................................................................................................... 10 I.3.2 La média....................................................................................................................... 10 I.3.3 L’intima........................................................................................................................ 11 I.4 Mécanismes de régulation du tonus vasculaire.............................................................. 11 I.4.1 La régulation de la relaxation vasculaire....................................................................... 11 I.4.2 La régulation endothéliale de la vasoconstriction......................................................... 14 I.5 Régulation générale des flux d’acides gras et de cholestérol dans l’organisme......... 15 I.5.1 Les lipoprotéines.......................................................................................................... 15 I.5.2 Le transport des acides gras et du cholestérol............................................................... 16 I.5.3 Les LDL....................................................................................................................... 17 I.6 Athérogénèse..................................................................................................................... 18 I.6.1 La définition de l’athérosclérose................................................................................... 18 I.6.2 L’initiation de l’athérosclérose...................................................................................... 18 I.6.3 Le développement de l’athérome.................................................................................. 20 I.6.4 La rupture de la plaque................................................................................................. 21 I.6.5 Les dysfonctions endothéliales et athérosclérose.......................................................... 23 I.6.6 La LPC et athérosclérose.............................................................................................. 23 I.7 Prévention nutritionnelle de l’athérosclérose par les acides gras polyinsaturés n-3 (AGPI n-3) 25 I.7.1 Structure de l’acide eicosapentaénoïque(EPA) et de l’acide docohexaénoïque (DHA). 26 I.7.2 Les AGPI n-3 dans l’alimentation................................................................................ 26 1.7.3 Effets des AGPI n-3 sur les maladies cardiovasculaires.............................................. 26 1.7.4 Effets des AGPI n-3 sur les lipides plasmatiques........................................................ 28 1.7.5 Effets des AGPI n-3 sur le recrutement monocytaire au niveau de la paroi artérielle... 28 1.7.6 Effets des AGPI n-3 sur les voies de relaxation endothélium-dépendante................... 29 I.8 Objectifs de l’étude........................................................................................................... 30 I.8.1 Test des effets d’une gamme de concentrations de lysophosphatidylcholine sur la relaxation aortique de hamster syrien endothélium- dépendante et indépendante..................................................... 30 I.8.2 Etude des effets de la lysophosphatidylcholine sur les voies de signalisation endothéliales impliquées dans la vasorelaxation aortique de hamster
................................................................VIATIONS DESABRÉLSIET5................................
syrien............................................................................. 31 I.8.3 Etude de l'influence d'un régime enrichi en AGPI n-3 sur les effets délétères de la LPC sur la vasorelaxation aortique chez le hamster syrien............................................................................................. 31
II MATÉRIELS ET MÉTHODES.................................. II.1 Régimes....................................................................................... II.2 Prélèvement de l’aorte............................................................... II.3 Technique de mesure de la vasoréactivité des anneaux aortiques II.4 Protocole expérimental.............................................................. II.5 Analyse lipidique....................................................................... II.6 Analyse des données..................................................................
III RÉSULTATS.............................................................. III.1 Effets de la LPC sur la relaxation aortique endothélium-dépendante et indépendante         III.2 Exploration des effets de la LPC sur les voies de signalisation impliquées dans la relaxation aortique à l’acétylcholine.................................................................................... III.2.1 Exploration de la relaxation dépendante du NO et de la PLA2 III.2.2 Exploration de la relaxation dépendante des dérivés de l’AA par les cyclo-oxygénases et mono-oxygénases..................................................................................................... III.2.3 Etude du rôle de la production radicalaire......................... III.2.4 Etude du rôle des canaux potassiques calcium-dépendants. III.3 Effets des régimes sur la composition en acides gras des parois aortiques de hamster          III.4 Influence du régime sur les effets délétères de la LPC sur la vasorelaxation aortique et les voies de signalisation associées.......................................................................
IV DISCUSSION............................................................
V CONCLUSION...........................................................
VI PERSPECTIVE.........................................................
Liste des Abréviations
VII BIBLIOGRAPHIE .................................................................................................3.2..........    AA Acide arachidonique 12 AACOCF3 Arachidonyl trifluoromethyl kétone 44 AC Acétylcholine 48
ACAT Acyl-coenzyme A cholestérol acyl transférase 22 AG Acide gras 57 AGPI Acide gras polyinsaturé 6 AIN American Institute of Nutrition 41 AMPc Adénosine mono-phosphate cyclique 14 ANOVA Analyse of variances 46 ARNm Acide ribonucléique messagé 17 apo Apolipoprotéine 20 BH4 Tétrahydrobioptérine 13 COX Cyclo-oxygénases 14 CTRL Contrôle 41 DAG Diacylglycérol 14 DHA Acide docosahexaénoïque 7 DPA Acide docosapentaénoïque 35 EDHF Facteur hyperpolarisant dérivé de l’endothélium 14 EETs Acides époxyeïcosatriénoïque 14 EPA Acide eicosapentaénoïque 7 ET-1 Endothéline-1 17 ET-2 Endothéline-2 17 ET-3 Endothéline-3 17 ETA Récépteur de l’endothéline de type A 17 ETB Récépteur de l’endothéline de type B 17 FAD Flavin adenine dinucleotide 13 FMD Flow-mediated dilation 30 FMN Flavine mononucléotide 13 GMPc Guanidine mono-phosphate cyclique 14 HETEs Acides hydroxyeïcosatétraénoïques 14 HDL High density lipoproteins 9 HUVEC Cellules endothéliales de cordon ombilical humain 31 ICAM-1 Intercellular Adhesion Molecule-1 25 IDL Intermediary Density Lipoprotein 18 IP3 Inositol triphosphate 12 L-Arg L-Arginine 12 LCAT Lécithine-cholestérol-acyl-transférase 21 LDL Low Density Lipoprotein 6 LDLox LDL oxydée 6 LDL-R LDL-récépteur 6 LPC Lysophosphatidylcholine 6 L-NAMENω-Nitro-L-arginine méthyl ester 44 Lp(a) Apolipoprotéine (a) 19 MAFP Méthyl arachidonyl fluorophosphonate 44 MC Masse corporelle 47 MMPs Métalloprotéinase 28 MONICA Multinational monitoring of trends and determinants in cardiovascular disease 8 MOX Mono-oxygénase 67 NADPH Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate 13 NHANES I National Health and Nutrition Examination Survey 35 NO Monoxyde d’azote 13 NOS NO-Synthase 12 ODC Ornithine décarboxylase 32 ODYA 17-octadecynoic acid  44 OMS Organisation mondiale de la santé 6
PC Phosphatidylcholines 31 PGI2 Prostaglandine I2 12 PGI3Prostaglandine I3 37         PKB Protéine Kinase B 37 PKC Protéine Kinase C 14 PLA2Phopholipase A214 PLC Phospholipase C 14 pO2Pression partielle en oxygène 25                                 PSGL-1 P-Selectin Glycoprotein 26 SAFE Scientific Animal Food and Engineering 41 SEM Standard error of the mean 46 SNP Nitroprussiate de sodium 64 SOD Superoxyde dismutase 45 SR-A Récepteur scavengers A 27 SR Smooth Reticulum 12 TF Facteur tissulaire 28 TNF-α Tumor Necrosis Factor-α 37 VCAM –1 Vascular Cell Adhesion Molecule –1 25 VLA-4 Very Late Antigen 4 26 VLDL Very low Density Lipoprotein 18                      I Introduction  L’athérosclérose est une pathologie de la paroi artérielle qui se développe au niveau de sites privilégiés dans l’ensemble de l’arbre artériel, dès le stade fœtal. Elle évolue ensuite lentement durant plusieurs décennies pour ne devenir généralement symptomatique qu’à la fin de l’âge adulte (Napoli et al., 1997). Ainsi, dans les pays industrialisés, la plupart des individus adultes vivent avec des lésions athérosclérotiques coronaires asymptomatiques. Or les complications de cette pathologie constituent la première cause de mortalité dans ces sociétés (OMS, 2003). La principale complication de l’athérosclérose est la cardiopathie ischémique due à l’athérosclérose des artères coronaires. La maladie coronarienne frappe souvent les individus dans leurs années les plus productives, et les coûts qui en découlent tant sur le plan économique que social s’avèrent considérables (Ross, 1999). Sa
prévention, plus encore que le traitement, est donc capitale. Durant la dernière décennie, de nombreuses études ont considérablement bouleversé nos connaissances de la physiopathologie de l’athérosclérose (Fuster et al., 1999; Ross, 1999). Le transport et la distribution du cholestérol et des acides gras dans l’organisme sont assurés par des complexes lipoprotéiques hydrosolubles, les LDL (Low Density Lipoprotein) qui alimentent les tissus en cholestérol. Il existe un flux physiologique de LDL vers l’espace sous-endothélial où elles peuvent ensuite être oxydées. L’accumulation et l’oxydation des LDL dans l’intima des artères est à l’origine d’une réaction inflammatoire de la paroi vasculaire qui peut conduire au développement de plaques d’athérome (Witztum & Steinberg, 1991; Berliner et al., 1995). La phosphatidylcholine, composant majeur des LDL, est transformée en lysophosphatidylcholine (LPC) au cours de leur oxydation. La LPC participe aux effets pro-athérogènes des LDL oxydées (LDLox), notamment en perturbant les fonctions endothéliales impliquées dans la vasodilatation. Un rôle potentiellement bénéfique vis à vis de la prévention, voire du traitement des maladies cardiovasculaires, est maintenant attribué aux Acides Gras PolyInsaturés (AGPI), particulièrement à ceux de la série n-3. En effet, des études montrent une nette réduction de la mortalité due aux maladies coronariennes dans les populations consommant du poisson comparativement à celles qui n'en consomment pas (Dyerberg et al., 1978). La confirmation a été obtenue expérimentalement chez l'animal où l'ingestion d'AGPI n-3 permet de freiner le développement des lésions athéromateuses (De Caterina et al., 2000). Bien qu’ayant fait l’objet de travaux nombreux, les mécanismes d’action des AGPI dans leurs effets préventifs sur le développement de la maladie athéromateuse restent partiellement connus. C’est pourquoi, notre étude porte sur les effets préventifs des AGPI n-3, et plus particulièrement l’acide eicosapentaénoïque (EPA) et de l’acide docosahexaénoïque (DHA) sur les effets délétères de la LPC sur la relaxation endothélium-dépendante des aortes de hamster syrien.
I.1 Epidémiologie de l’athérosclérose  Selon l’Organisation Mondiale pour la Santé (OMS., 2003), les pathologies cardiovasculaires ont été responsables de 16,7 millions de décès par an en 2002 soit un tiers des décès dans le monde occidentalisé.  Ces pathologies cardiovasculaires regroupent les atteintes coronariennes, les pathologies cérébrovasculaires, les congestions[1], l’hypertension, les maladies des artères, le rhumatisme cardiaque et les pathologies congénitales. Ces pathologies sont sévères et nécessitent généralement un traitement chronique, ce qui implique un coût élevé pour leur prise en charge. Parmi ces pathologies cardiovasculaires, l’ischémie cardiaque est responsable de la majorité des décès, suivie des pathologies cérébrovasculaires. Ainsi, aux Etats-Unis, d’après le centre de surveillance des pathologies cardiovasculaires pour l’OMS, les pathologies cardiovasculaires sont responsables de 41% des décès et, pour plus de la moitié des cas, il s’agit d’atteintes coronariennes sur terrain athéromateux. Diagnostiquer et traiter la maladie athéromateuse responsable de ces atteintes coronariennes constituent donc des enjeux cliniques majeurs. Si la mortalité coronarienne est à la première place des causes de décès dans le monde, son importance peut varier d’un pays à l’autre. Par exemple, pour 100 000 habitants, on note un nombre
de décès liés aux maladies cardiaques de (Chassignole, 1999) : ·               51 au Japon                95 en France · ·               255 aux Etats Unis ·               363 en Ecosse  I.2 Facteurs de risque  L’enquête prospective parisienne (7 434 policiers parisiens entre 43 et 53 ans suivis sur 5 ans), l’étude Framingham (suivi de la population d’une ville américaine depuis 1948) et l’étude MONICA (en cours depuis 1985) sont les principales enquêtes ayant permis de déterminer les facteurs de risques de l’athérome. Il existe deux grandes catégories de facteurs de risque : les facteurs modifiables et les facteurs non modifiables. Les facteurs de risque modifiables permettent des mesures de prévention en tentant de les supprimer ou, à défaut, de les atténuer (Scott, 2004). I.2.1 Les facteurs non modifiables                  L’âge et le sexe: L’athérome coronaire survient plus tardivement chez la femme que chez · l’homme, et en moyenne 8 à 10 ans après la ménopause. L’incidence est similaire pour les deux sexes à partir de 65 ans. ·    Le terrain familial: L’existence d’un accident vasculaire avant l’âge de 50 ans chez un             membre de la famille proche. ·                L’ethnie I.2.2 Les facteurs modifiables Facteurs comportementaux ·                 de cholestérol plasmatique et un stress élevéUn régime alimentaire favorisant un taux oxydant: o      riche en graisses saturées, en cholestérol, o      pauvre en fruits, en légumes et en céréales ·                Obésité                 Tabagisme · ·                Sédentarité ·            Stress émotionnels répétés     Lipides plasmatiques  Les effets des lipides plasmatiques sur les maladies cardiovasculaires dépendent de leur nature. Ainsi les low density lipoproteins (LDL) sont pro-athérogènes tandis que les high density lipoproteins (HDL) ont des effets protecteurs contre ces maladies (Glass & Witztum, 2001). Ces
lipoprotéines, responsables du transport du cholestérol dans l’organisme sont qualifiées respectivement de ‘mauvais cholestérol’ et de ‘bon cholestérol’. Il existe une autre classe de lipoproteines très athérogènes, la lipoprotéine (a), dont le taux plasmatique est génétiquement déterminé (Berglund & Ramakrishnan, 2004). Hypertension artérielle Diabète Autres facteurs de risque ·                Hyrhpesyétmocoeinimé ·                Perturbations des médiateurs de l’inflammation ·                Perturbations des facteurs de la coagulation I.3 Structure de la paroi artérielle  La paroi artérielle est constituée de trois tuniques concentriques qui sont l’adventice, la média et l’intima. I.3.1 L’adventice  C'est la tunique externe. Elle est constituée d'un tissu conjonctif peu organisé, riche en collagène et en fibres élastiques, et contenant des fibroblastes et des adipocytes. Elle assure l’ancrage de l’artère aux structures avoisinantes. Un réseau de nerfs vasomoteurs non myélinisés rejoint les fibres musculaires lisses de la media. L’adventice est irriguée par desvasa vasorumqui se prolongent dans la partie externe de la media (Toussaint et al., 2003). I.3.2 La média  C'est la tunique moyenne et la plus épaisse des trois. Elle est essentiellement constituée de cellules musculaires lisses, empilées de façon concentrique en couches appelées « unités lamellaires ». Le nombre de ces couches varie suivant le type d'artère : d'une couche pour les artérioles, à plusieurs couches pour les artères élastiques. Chaque unité lamellaire est composée de cellules musculaires lisses entourées d'une matrice extra-cellulaire constituée de protéines fibreuses et élastiques (collagène et élastine) et de muco-polysaccharides. Dans sa partie externe, la média reçoit l'irrigation desvasa vasorum lame l'adventice. La limitante élastique externe constituée d’une de d'élastine, sépare la media de l'adventice. I.3.3 L’intima  C'est la tunique la plus interne et la plus fine. Elle est constituée d'une couche unique de cellules endothéliales formant une couverture étanche : l’endothélium vasculaire. Le sous-endothélium est formé de tissu conjonctif essentiellement constitué de fibres de
collagène, quelques fibres élastiques, de fibres musculaires lisses et de fibroblastes. Les fibroblastes produisent des protéoglycannes et des glycosaminoglycannes. La couche sous-endothéliale renferme également des héparane-sulfates, du glycogène, de l’élastine et de la laminine ainsi qu’un grand nombre de cellules du système immunitaire (Munsch et al., 1995). C’est à son niveau que se forme la plaque d'athérome. La limitante élastique interne, une lame de fibres élastiques, sépare l’intima de la média.
I.4 Mécanismes de régulation du tonus vasculaire
I.4.1 La régulation de la relaxation vasculaire  Les cellules endothéliales ont un rôle essentiel dans la relaxation artérielle endothélium-dépendante (Furchgott & Zawadzki, 1980). Le contrôle de cette relaxation s’exerce par la sécrétion de différentes substances dont la synthèse dépend d’enzymes dont l’activité est régulée par le calcium cytosolique. Dans les conditions de repos, la concentration de Ca2+dans le cytosol des cellules  endothéliales est maintenue à des niveaux très faible à l’aide de transporteurs actifs qui pompent le Ca2+vers le milieu extracellulaire ou dans le réticulum endoplasmique qui contient la majorité du  Ca2+intracellulaire quiescent (Alberts et al., 1994). Lorsqu’un autacoïde se lie à son récepteur  membranaire, il induit l’activation d’une protéine G. Celle-ci stimule la production d’un second messager : l’inositol triphosphate (IP3). L’IP3, en se liant aux canaux Ca2+du réticulum  endoplasmique, permet l’ouverture de canaux et l’augmentation de la concentration cytosolique de Ca2+(Tran et al., 2002). Le Ca2+ainsi libéré dans le cytosol active différentes voies impliquées dans   la production d’EDRF (Endothelium-Derived Relaxing Factors).
I.4.1.1 La voie d’activation de la NO-synthase endothéliale (eNOs)  Furchgott et al. mirent en évidence en 1980 l’existence d’un EDRF qui fût par la suite identifié comme du monoxyde d’azote (NO) (Furchgott & Zawadzki, 1980; Palmer et al., 1987; Furchgott, 1988; Ignarro, 1991). La eNOs est une enzyme constituée de plusieurs domaines responsables de la production de NO à partir de L-arginine dans les cellules endothéliales. Elle est constituée d’un domaine N-terminal oxygénase contenant des sites de liaison pour un hème, la L-arginine et la tétrahydrobioptérine (BH4) et d’un domaine réductase contenant des sites de liaison pour le FMN, le FAD, le NADPH et la calmoduline. La eNOs fonctionnelle est un dimère constitué de deux sous-unités identiques myristoylées et palmitoylées. La BH4 serait impliquée dans la dimérisation de l’enzyme. Au cours de la synthèse de NO, des électrons issus du NADPH passent par les flavines du domaine réductase avant d’être transférés vers l’hème du domaine oxygénase. L’hème ainsi chargé peut alors réagir avec le dioxygène pour catalyser la synthèse de NO à partir de la L-Arginine. La
calmoduline, liée à des ions Ca2,+ le active la eNOs. En effet, sa fixation sur l’enzyme permet transfert des électrons du domaine réductase au domaine oxygénase (Chen et al., 1994; Abu-Soud et al., 1997; List et al., 1997; Presta et al., 1997). La régulation de l’activité de la eNOs est complexe et très controversée. En effet, son interaction avec la cavéoline-1 ainsi que la corrélation entre sa répartition subcellulaire et l’intensité de son activité restent à éclaircir. Il semblerait que la cavéoline-1, en se fixant sur un site du domaine oxygénase de la eNOs, empêcherait la liaison du complexe calmoduline- Ca2+inhibant ainsi l’activité  de l’enzyme (Couet et al., 1997; Garica-Cardena et al., 1997; Michel et al., 1997; Okamoto et al., 1998). Bien que le site de fixation supposé de la cavéoline sur l’enzyme ait été identifié, les mécanismes d’interaction entre les deux protéines restent à élucider (Raman et al., 1998). Lorsque l’enzyme est liée à la membrane plasmique par les cavéolines, elle serait inactive tandis qu’elle s’activerait une fois libérée dans le cytosol. En outre, de multiples possibilités de phosphorylation et de déphosphorylation viennent encore compliquer les voies de régulation de cette enzyme. Par ailleurs, la localisation intracellulaire de la eNOs et l’importance du NO dans la relaxation vasculaire diffèrent en fonction du lit vasculaire considéré (Andries et al., 1998).  Le NO ainsi produit diffuse alors librement au travers des membranes jusqu’aux cellules musculaires lisses. C’est en diminuant la concentration en calcium dans le cytosol des cellules musculaires lisses, via l’activation de la guanylate cyclase, que le NO induit leur relaxation  .
I.4.1.2 La voie des cyclo-oxygénases  L’activation de certains récepteurs endothéliaux conduit à l’activation de la PLC, la libération d’inositol triphosphate (IP3) et de diacylglycérol (DAG). L’IP3 stimule la libération deCa2+du réticulum sarcoplasmique, et le DAG active la PKC qui phosphoryle la phopholipase A2(PLA2). La PLA2ainsi phosphorylée est alors relocalisée vers la membrane plasmique, où elle exerce son activité lipase sur les phospholipides et libère de l’acide arachidonique. Celui-ci peut-être transformé par l’action des COX en prostacycline (PGI2). La prostacycline est un puissant vasodilatateur dont l’action passe par l’activation de l’adénylate cyclase et l’augmentation de la production d’AMPc dans les cellules musculaires lisses (Vanhoutte, 2003). Comme le GMPc, l’AMPc induit une diminution de leur concentration cytosolique de Ca2+et par conséquent leur relaxation. Elle inhibe l’agrégation plaquettaire et  possèderait aussi un effet désagrégeant. Elle inhibe l’agrégation des leucocytes et leur adhésion à l’endothélium vasculaire (Jones & Hurley, 1984). I.4.1.3 Les dérivés des mono-oxygénases  
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