« LES ANOMALIES CONGENITALES DE GLYCOSYLATION DE TYPE I »

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  • mémoire


MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Christiane LE BIZEC Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes « LES ANOMALIES CONGENITALES DE GLYCOSYLATION DE TYPE I » Soutenu le 21 décembre 2005 devant le jury suivant Président : M. Le Professeur Jean CHAMBAZ Examinateurs : M. Le Professeur Bernard LACOUR Mme Le Professeur Nathalie SETA M. Le Professeur Jacques ELION Mme Le Docteur Pascale DE LONLAY Laboratoire du Métabolisme minéral des mammifères Directeur : EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) M. le Professeur Bernard LACOUR UMR 1154 INRA-Physiologie-EPHE, Faculté de Pharmacie, 92296 Chatenay-Malabry cedex Laboratoire de Biochimie Métabolique et Nutrition Directeur : Hôpital Bichat 75018 Mme le Professeur Nathalie SETA Résumé EPHE Banque de Monographies SVT 1

  • mutation

  • étape de transfert de l'oligosaccharide sur la chaîne peptidique

  • dosage de l'activité alg

  • recherche de mutations sur le gène correspondant

  • glycoprotéines dans le réticulum endoplasmique

  • atteintes sévères du système nerveux

  • cdg ib

  • anomalies congénitales de glycosylation

  • recherche de mutations sur les gènes


Publié le : jeudi 1 décembre 2005
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE   ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre   MEMOIRE Présenté par   Christiane LE BIZEC  Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes    «  LES ANOMALIES CONGENITALES DE GLYCOSYLATION DE TYPE I  »  Soutenu le 21 décembre 2005 devant le jury suivant    Président : M. Le Professeur Jean CHAMBAZ   Examinateurs : M. Le Professeur Bernard LACOUR  Mme Le Professeur Nathalie SETA          M. Le Professeur Jacques ELION      Mme Le Docteur Pascale DE LONLAY    Laboratoire du Métabolisme minéral des mammifères Directeur : EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) M. le Professeur Bernard LACOUR                 UMR 1154 INRA-Physiologie-EPHE, Faculté de Pharmacie, 92296 Chatenay-Malabry cedex             Laboratoire de Biochimie Métabolique et Nutrition Directeur : Hôpital Bichat 75018 Mme le Professeur Nathalie SETA  Nathalie.seta@bch.aphp.fr  Résumé
   Les anomalies congénitales de glycosylation ou Congénital Disorders of Glycolysation de type I (CDG I) sont des maladies génétiques rares de transmission autosomique récessive affectant plus précisément la synthèse et son transfert de la partie glycannique des N- glycoprotéines. Actuellement, douze CDG I sont identifiés (Ia à Il) mais seuls, deux peuvent être typés par dosage des activités enzymatiques intracellulaires dans notre laboratoire. Le déficit de l’activité entraîne la recherche de mutations sur le gène correspondant. Le typage des autres CDG I reste donc moléculaire uniquement.   Ce travail expose dans un premier temps les connaissances moléculaires rapportées dans la littérature sur les CDG. En un second temps, en suivant le déroulement chronologique de plusieurs diagnostics, les plus marquants, nous montrons les difficultés rencontrées pour aboutir à un typage.   Ainsi, dans le CDG Ia, parmi les nombreuses mutations différentes identifiées, nous avons mis en évidence un effet fondateur pour la mutation « française » E139K ; nous avons vérifié systématiquement l’effet délétère des nouvelles mutations faux sens par expression dans E. coli ; et  enfin, nous avons mis en évidence un nouveau type de mutation d’épissage au niveau de sites de branchement. Parallèlement, nous avons découvert un cas de CDG Ia asymptomatique chez un père d’un enfant atteint de CDG Ix. Dans le CDG Ib, nous avons prouvé a  posteriori que le syndrome décrit sous le nom de « syndrome du lac Saguenay-Saint Jean » était en fait un CDG Ib. Enfin, nous avons mis en évidence le second cas de CDG Ij au niveau mondial dans une fratrie. A ce jour , neuf patients (environ 10%) restent non typés et sont classés CDG Ix.   MOTS-CLES : CDG I, N-glycosylation, diagnostic moléculaire, mutation, mutagenèse                                              Table des matières
1       INTRODUCTION                                                                                                                                        5
2        ETAT DES CONNAISSANCES                                                                                                     6 2.1         Les anomalies congénitales de glycosylation de type I  7 2.1.1          Mise en évidence du déficit de glycosylation  7 2.1.2          CDG Ia  8 2.1.3          CDG Ib  9 2.1.4          CDG Ic  10 2.1.5          CDG Id  10 2.1.6          CDG Ie  11 2.1.7          CDG
If  11 2.1.8          CDG Ig  11 2.1.9          CDG Ih  11 2.1.10        CDG Ii  12 2.1.11        CDG Ij  12 2.1.12        CDG Ik  12 2.1.13        CDG Il  13 2.1.14        CDG Ix  13 2.2         Les CDG I caractérisés à ce jour                                              
3        OBJECTIF                                                                             
4        MATERIELS ET METHODES                                    4.1         Matériel pré-analytique                                                                   4.1.1          Contexte de l’étude moléculaire                                       4.1.2          Purification de l’ADN génomique                                   4.1.3          Etude de l’ARN                                                                        4.2         Techniques générales                                                                        4.2.1          Amplification d’une séquence d’intérêt                        4.2.2          Séquençage                                                                                 4.2.3          Les techniques de restriction ou RFLP                           4.2.4          Les marqueurs microsatellites                                            4.3         Applications au CDG I                                                                     4.3.1          CDG Ia                                                                                          4.3.2          CDG Ib                                                                                         4.3.3          CDG Ij                                                                                           4.3.4          Les autres CDG                                                                         
5        RESULTATS                                                                        5.1         CDG Ia                                                                                                     5.1.1          Bilan des diagnostics CDG Ia                                            5.1.2          Calcul de la fréquence allélique des mutations          5.1.3          Analyse des haplotypes                                                        5.1.4          Mutagenèse                                                                                 5.1.5          Les diagnostics particuliers                                                5.2         CDG Ib                                                                                                     5.2.1          Bilan des mutations                                                                 5.2.2          Syndrome du Lac Saguenay-Saint Jean (SLSJ)         5.3         CDG Ij                                                                                                      5.3.1          Etude du gène hALG 7 à partir de l’ADN génomique
5.3.2          Etude de l’ADNc de hALG7                                              5.3.3          Clonage dans un plasmide bactérien                              5.3.4          Dosage de l’activité ALG 7                                                 5.3.5          Discussion                                                                                   5.4         CDG Ic à Ik                                                                                           5.4.1          Les mutations                                                                             5.4.2          Les polymorphismes                                                              5.5         Les CDG incomplets                                                                          5.5.1          Les patients restant CDG Ix                                                5.5.2          Diagnostics CDG Ia restant incomplets à ce jour    
6        DISCUSSION ET PERSPECTIVES                       
7        RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES                                                                                    1  3
8        ANNEXES                                                                              
 
LISTE DES ABRÉVIATIONS UTILISÉES :  ADN : acide désoxyribo nucléique ADNc : acide désoxyribo nucléique complémentaire ALG : asparagine-linked-glycosylation ARN : acide ribo nucléique C I : cas index CDG : congenital disorders of glycosylation ddNTP : didésoxynucléotide-triphosphate dNTP : 2-désoxynucléotide 5’triphosphate Dol-P : dolichol-phosphate DPM : dol-P-Man synthase DHPLC : chromatographie liquide à haute pression en condition dénaturante EST : expressed sequence tags Glc : glucose GlcNAc : N -acétylglucosamine GPT : dolichol phosphate N -acétylglucosaminyl transférase HPLC : chromatographie liquide à haute pression Man : mannose ND : non déterminé OST : oligosaccharyl transférase Pb : paire de base PCR : polymerase chain reaction ou réaction de polymérisation en chaîne PMI : phosphomannose isomérase PMM : phosphomannomutase RE : réticulum endoplasmique RFLP : Restriction fragment length polymorphism SSCP : Single-strand conformation polymorphism Tm : température de fusion UTR : Untranslated region ou région non traduite des ARN messagers.
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