MINISTERE DE LA JEUNESSE DE L'EDUCATION NATIONALE

Christine Chevalier - Mariette

Description

Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par Christine Chevalier-Mariette Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes MULTIPLICITÉ DES FACTEURS CONTRIBUANT À LA VARIABILITÉ DES NIVEAUX D'EXPRESSION DE TRANSGÈNES COMBINANT LACZ ET DES PROMOTEURS DE GÈNES UBIQUISTES ET ÉLUCIDATION DE LA BASE MOLÉCULAIRE DE L'EFFET SILENCER DE LACZ Soutenu le : 11 décembre 2003 Devant le jury composé de : Monsieur le Professeur Jean-Luc Vayssière Président Monsieur le Professeur Andràs Paldi Rapporteur Monsieur le Docteur Jean-François Nicolas Examinateur Madame le Docteur Sylvie Mémet Examinateur Monsieur le Docteur Shahragim Tajbakhsh Examinateur Laboratoire E.P.H.E. (Sciences de la Vie & de la Terre) Directeur d'étude : Andràs Paldi Institut Jacques Monod Laboratoire de Biologie moléculaire 2, place Jussieu-Tour 43 75251 PARIS Cedex 05 Institut Pasteur Directeur: Jean-François Nicolas Unité de Biologie moléculaire du Développement 25, rue du Dr Roux 75724 PARIS Cedex 15 ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE EPHE Banque de Monographies SVT 1

• lacz


• méthylation des séquences du gène lacz au moment de la méthylation de novo de l'adn dans l'embryon


• mécanisme de protection de l'îlot cpg


• lignées de souris


• lignée


• expression des gènes étrangers


• gènes rapporteurs

Sujets

• Institut Pasteur
• Soriano
• Lignée

Informations

• Publié par: chaeh
• Publié le: 01 décembre 2003
• Nombre de lectures: 43

Extrait

MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE
ET DE LA RECHERCHE



ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
Sciences de la Vie et de la Terre

MEMOIRE
présenté
par

Christine Chevalier-Mariette

Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes


MULTIPLICITÉ DES FACTEURS CONTRIBUANT À LA VARIABILITÉ DES NIVEAUX D’EXPRESSION
DE TRANSGÈNES COMBINANT LACZ ET DES PROMOTEURS DE GÈNES "UBIQUISTES" ET
ÉLUCIDATION DE LA BASE MOLÉCULAIRE DE L’EFFET "SILENCER" DE LACZ



Soutenu le : 11 décembre 2003 Devant le jury composé de :

Monsieur le Professeur Jean-Luc Vayssière Président le Andràs Paldi Rapporteur
Monsieur le Docteur Jean-François Nicolas Examinateur
Madame le Sylvie Mémet
Monsieur le Docteur Shahragim Tajbakhsh Examinateur


Laboratoire E.P.H.E. (Sciences de la Vie & de la Terre) Directeur d’étude : Andràs Paldi
Institut Jacques Monod [e-mail] de Biologie moléculaire
2, place Jussieu-Tour 43 75251 PARIS Cedex 05

Institut Pasteur Directeur: Jean-François Nicolas
Unité de Biologie moléculaire du Développement [e-mail]
25, rue du Dr Roux 75724 PARIS Cedex 15
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE
EPHE Banque de Monographies SVT 1
MULTIPLICITÉ DES FACTEURS CONTRIBUANT À LA VARIABILITÉ DES NIVEAUX D’EXPRESSION DE
TRANSGÈNES COMBINANT LACZ ET DES PROMOTEURS DE GÈNES "UBIQUISTES" ET ÉLUCIDATION DE
LA BASE MOLÉCULAIRE DE L’EFFET "SILENCER" DE LACZ

Christine Chevalier-Mariette

Le 11 décembre 2003

Résumé

Pour beaucoup d’études biologiques en particuliers chez la souris, il est nécessaire d’exprimer certains
transgènes de manière très reproductible dans tous les tissus et à tous les stades du développement. La
combinaison du gène d’intérêt avec les promoteurs de gènes ubiquistes ne permet pas d’obtenir une expression
généralisée des transgènes. La compréhension de la base moléculaire de ce problème reste méconnue. Par
contre, en utilisant un rétrovirus recombinant spécialement adapté au piégeage des promoteurs, Philippe
Soriano a détecté un locus du génome de la souris, le locus ROSA, permettant l’expression large du gène
LacZ. La lignée Rosa26bgeo a depuis été très largement utilisée par les embryologistes comme source de
matériel génétiquement repérable.
Nous avons tenté de déterminer les causes moléculaires de l’absence d’expression généralisée du
transgène LacZ associé au promoteur du gène ubiquiste du facteur d’élongation a de la traduction. Dans cette
approche, nous avons utilisé des gènes LacZ contenant différents taux de dinucléotides CpG. Cette répression
est très vraisemblablement due à une interférence entre le mécanisme de protection des îlots CpG du génome,
dans lequel est inclue la majorité des promoteurs des gènes à expression large, et la méthylation des séquences
du gène LacZ au moment de la méthylation de novo de l’ADN dans l’embryon.
Nous avons alors analysé en détail des lignées Rosa dont l’expression du gène LacZ semblait pouvoir
constituer une exception. Il en ressort que Rosa ne constitue pas une exception. Le mécanisme de protection
de l’îlot CpG, incluant le promoteur du gène Rosa, est perturbé. Des phénomènes de variabilité d’activité b-
galactosidase et de variégation d’expression ont été décelés. Les contributions relatives des facteurs génétiques
et épigénétiques à ces phénomènes ont pu être précisées. 1) La présence d’éléments rétroviraux du transgène
Rosa26bgeo entraîne des différences considérables d’expression d’un organe à l’autre et diminue très
fortement le niveau d’activité dans tous les tissus. 2) Le polymorphisme génétique, apporté par la non
consanguinité de la lignée Rosa26bgeo, contribue pour une bonne part à l’hétérogénéité des niveaux d’activité
de la b-galactosidase entre individu. 3) Des facteurs épigénétiques, mis en évidence avec la lignée
consanguine Gtrosa, agissent modérément sur le niveau d’activité de la b-galactosidase et sur la dispersion des
profils observés entre différents individus.
Ces résultats nous ont permis de déterminer précisément quel matériel doit être utilisé pour
approfondir la question de l’ubiquitarité de Rosa. Il apparaît clairement que de multiples facteurs modulent
l’expression des gènes étrangers intégrés dans le génome.


Mots clés : souris, développement, gène ubiquiste, gènes rapporteurs, expression génique, LacZ, LagoZ, Rosa, rétrovirus
recombinant, variabilité, variégation, facteurs génétiques, facteurs épigénétiques, îlot CpG, méthylation.








EPHE Banque de Monographies SVT 2TABLE DES MATIERES

LISTE DES ABREVIATIONS.....................................................………………….. 1

INTRODUCTION...................................................…………………………………….. 3

MATERIEL ET METHODES.....................................................………………….. 6

I. Les lignées de souris
transgéniques…………………………………………………….. 6
I.1. Les lignées Rosa.....................................................……………….…………. 6
I.1.1. La lignée
Rosa26bgeo.................................................................................. 6
I.1.2. La lignée Rosa26reporter........................................................................
…. 7
I.1.3. La lignée
Rosa33LacZ................................................................................. 7
I.1.4. Maintien des souris transgéniques..........................................................
…. 7
I.2. Les lignées EF1aLacZ, YEF1aLacZ, EF1aLagZ et EF1aLagoZ.................…. 8
I.2.1. Les lignées EF1aLacZ...................................................................
……...... 8
I.2.2. Les lignées
YEF1aLacZ.............................................................................. 8
I.2.3. Les lignées EF1aLagZ et
EPHE Banque de Monographies SVT 3EF1aLagoZ........................................................ 9
I.2.4. Maintien des souris
transgéniques............................................................... 9

II. Extraction de l’ADN..............................................................................................
…….. 10
II.1. Avec l’isopropanol........................................................................................…. 10
II.2. Avec le phénol-chloroforme............................................................................... 10

III. Technique du Southern blot.................................................................................
……. 12

IV. Technique du MUG : mesure de l’activité de la b-
galactosidase…………………… 13
IV.1. Traitement des tissus........................................................................................ 14
IV.2. Extraction des protéines................................................................................... 14
IV.3. Dosage des protéines par la méthode de Bradford............................................ 14
IV.4. Mesure de l’activité b-galactosidase................................................................ 15
IV.5. Traitement des résultats............................................................................….. 16

V. Récupération des embryons avant et après implantation…………………….....
…… 17
V.1. Superovulation.........................................................