MINISTERE DE LA JEUNESSE DE L'ÉDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE

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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'ÉDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la vie et de la terre MÉMOIRE Présenté par Marc LE VEE Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Protéines de transport membranaire de xénobiotiques : optimisation des modèles d'études in vitro et étude des mécanismes de régulation de leur expression. Soutenu le 26 septembre 2006 devant le jury suivant : Professeur Jean CHAMBAZ Président Professeur Jean-Michel SCHERRMANN Examinateur Professeur Robert FARINOTTI Examinateur Professeur Bernard LACOUR Directeur d'étude Professeur Olivier FARDEL Directeur de stage LABORATOIRE DE STAGE : INSERM U620 DETOXICATION ET REPARATION TISSULAIRE Faculté de Pharmacie Université de Rennes1 2, avenue du Professeur Léon Bernard 35 000 - Rennes Directeur de stage : Pr Olivier FARDEL LABORATOIRE EPHE : MEDICAMENTS ET INTESTINS Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques – EA 2760 Rue J.-B. Clément 92 290 – Châtenay-Malabry Directeur : Pr Bernard LACOUR Ecole pratique des hautes études SCIENCE ET VIE DE LA TERRE PROTEINES HEPATIQUES DE TRANSPORT MEMBRANAIRE DE XENOBIOTIQUES : OPTIMISATION DES MODELES D'ETUDE IN VITRO ET ETUDE DES MECANISME DE REGULATION DE LEUR EXPRESSION. LE VEE MARC Soutenu le 26 septembre 2006 EPHE Banque de Monographies SVT 1

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Publié le : vendredi 1 septembre 2006
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’ÉDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE  ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la vie et de la terre  MÉMOIRE Présenté par  Marc LE VEE  Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes    Protéines de transport membranaire de xénobiotiques : optimisation des modèles d’études in vitro et étude des mécanismes de régulation de leur expression.  Soutenu le 26 septembre 2006 devant le jury suivant :  Professeur Jean CHAMBAZ Président Professeur Jean-Michel SCHERRMANN Examinateur Professeur Robert FARINOTTI Examinateur Professeur Bernard LACOUR Directeur d’étude Professeur Olivier FARDEL Directeur de stage  LABORATOIRE DE STAGE :  INSERM U620 DETOXICATION ET REPARATION TISSULAIRE Faculté de Pharmacie Université de Rennes1 2, avenue du Professeur Léon Bernard 35 000 - Rennes  Directeur de stage : Pr Olivier FARDEL Olivier.fardel@univ-rennes1.fr     LABORATOIRE EPHE :  MEDICAMENTS ET INTESTINS Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques – EA 2760 Rue J.-B. Clément 92 290 – Châtenay-Malabry     Directeur : Pr Bernard LACOUR Ecole pratique des hautes études SCIENCE ET VIE DE LA TERRE    PROTEINES HEPATIQUES DE TRANSPORT MEMBRANAIRE DE XENOBIOTIQUES : OPTIMISATION DES MODELES D’ETUDE IN VITRO ET ETUDE DES MECANISME DE REGULATION DE LEUR EXPRESSION.    
LE VEE MARC  Soutenu le 26 septembre 2006
 Les transporteurs hépatiques jouent un rôle majeur dans l’élimination biliaire des xénobiotiques et interviennent par conséquent dans les paramètres pharmacocinétiques des médicaments. De ce fait, pour les médicaments, notamment ceux en cours d’évaluation dans l’industrie pharmaceutique, l’identification des transporteurs hépatiques les prenant en charge est requise ; de plus, leurs effets sur l’activité et/ou l’expression de transporteurs, pouvant être à l’origine d’interactions médicamenteuses et/ou d’effets indésirables, sont importants à déterminer. Pour cela, il est nécessaire d’identifier des modèles d’études in vitro adéquats ; nos travaux s’inscrivent dans ce cadre et ont visé à caractériser l’expression fonctionnelle et la régulation de transporteurs de médicaments dans des cultures de cellules hépatiques. Nous avons d’abord analysé l’expression fonctionnelle des transporteurs d’influx de médicaments au niveau d’hépatocytes en culture primaire. Nos résultats décrivent un maintien de la fonction de ces transporteurs dans les hépatocytes humains au cours de la culture alors qu’une diminution importante est observée dans les hépatocytes de rat dès le premier jour de culture. Nous avons ensuite entrepris la caractérisation de l’expression fonctionnelle des transporteurs dans la lignée cellulaire d’hépatome HepaRG. Les résultats que nous avons obtenus indiquent que ces cellules HepaRG pourraient servir de modèle de substitution aux hépatocytes humains pour l’étude d’interaction médicaments/transporteurs. En effet, nous détectons dans ces cellules une activité de tous les transporteurs sinusoidaux d’influx de type Solute Carrier (SLC) (NTCP, OATPs, OCT1) et des transporteurs canaliculaires d’efflux de type ATP-binding cassette (ABC) (MRPs, MDR1) testés ; l’activité de ces protéines de transport est néanmoins plus faible que celle observée dans les hépatocytes humains. Enfin, nous avons analysé dans les hépatocytes humains la régulation de transporteurs comme MDR1 et MRP2 en réponse à des traitements avec des activateurs de récepteurs nucléaires spécifiques. Les résultats confirment des données déjà rapportées dans la littérature, ce qui valide ce modèle de culture primaire pour l’étude de la régulation de transporteurs hépatiques ; de nouvelles régulations, concernant notamment le transporteur ABC BCRP, ont de plus été mises en évidence. Au total, nos données ont démontré l’intérêt et la faisabilité de l’utilisation d’hépatocytes en culture primaire et de cellules HepaRG pour préciser la nature des interactions entre xénobiotiques et transporteurs hépatiques et étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués.   MOTS CLEFS : Transporteur, hépatocyte, médicament, régulation de l’expression, activité fonctionnelle, modèle in vitro . TABLE DES MATIERES                                                                                                                         Pages                                                                                                                                         
       LISTE DES ABREVIATIONS   
2-AAF : 2-acetylaminofluorène ABC : ATP Binding Cassette AC : Acide Cholique ACDC : Acide Chenodéoxycholique ADN : Acide désoxyribonucléique AhR : Aryl Hydrocarbon Receptor AMPc : Adénosine MonoPhosphate cyclique ARNm : Acide RiboNucléique messager ASBT : Apical Sodium-dependent Bile acid Transporter ATP : Adenosine Tri-Phosphate AUDC : Acide ursodéoxycholique BCRP/bcr : Breat Cancer Resistance Protein
BSEP/bsep : Bile Salt Export Pump BSP : Bromosulfophtaléine CAR : Constitutive Androstane Receptor CCK-8 : Cholecystokinine-8 CCL4 : Tétrachlorure de Carbone C/EBP : CAAT/Enhancer Binding Protein CFA : carboxydichlorofluorescéine diacétate CITCO : 6-(4-chlorophenyl)imidazo[2,1-b][1,3]thiazole-5-carbaldehyde O-(3,4-dichlorobenzyl)oxime CL3 : Cytoplasmic Loop = boucle cytoplasmique CPF : cholestérol-7 α -hydroxylase promoter factor CYP : Cytochrome P450 DHEAS : Dihydroépiandrostérone DMSO : Diméthylsulfoxide DNase : Désoxyribonucléase DR-4 : Direct Repeat DTT : Dithiotreitol E2-17-β -D-G : 17beta-estradiol-17-beta-D-glucuronide EP1-4 : E-prostanoid 1-4 ERK : Extracellular signal-Regulated Kinase ES : Estrone-3-Sulfate FTF : α 1-fetoprotein transcription factor FXR : Farnesoid X Receptor GMPc : Guanosine MonoPhosphate cyclique GR : Glucocorticoid receptor GST :  Glutathion-S-transférase HEPES : 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane-sulfonic acid HIF-1 : Hypoxia Inducing Factor HNF : Hepatocyte Nuclear Factor IL6/IL1beta : Interleukin 6/ Interleukin 1beta IR-1 : Inverted Repeat JNK : c-Jun NH(2)-terminal kinase LPS : Lipopolysaccharide LRH-1 : Liver receptor homologue 1 LST-1 : Liver-Specific Transporter LTC4 : leukotriène C4 LXR : Liver X receptor MDR/mdr : Multiple Drug Resistance MRP/mrp : Multidrug Resistance Protein MSD : Membrane Spanning Domain NBD : Nucleotide Binding Domain NF-kB : Nuclear Factor – kappa B NHR : Nuclear Hormone Receptors Nrf2 :  Nuclear factor E2 p45-related factor 2 NTCP/ntcp : Na(+)-taurocholate cotransporting peptide OAT/oat : Organic Anion Transporter OATP/oatp : Organic Anion Transporting Polypeptide OCT/oct : Organic Cation Transporter OPZ : Oltipraz PAH : Paraaminohyppurate PB : Phénobarbital PBS : Phosphate Buffer Saline PCN : Pregnenolone-16alpha-carbonitrile PGE 2 : Prostaglandin E2 P-gp : P-glycoprotéine PI3K : Phosphoinositide-3-kinase PKA : Protein kinase A PKC : Protein Kinase C PMSF : Phenylmethylsulphonylfluoride PPAR : Peroxysome Proliferator Activated Receptor PXR : Pregnane X receptor Q-PCR : Quantitative Polymerase Chain reaction RAR : Retinoic Acid Receptor RIF : Rifampicine RT : Reverse Transcription RXR : Retinoid X Receptor SAB : Serum Albumine Bovine SDS : Sodium Dodecyl Sulfate SHP : Short Heterodimer Protein SLC : Solute Carrier SPGP : Sister P-glycoprotein STAT5 : Signal Transducer and Activator of Transcription SVF : Serum Veau Foetal TBS : Tris Buffer Saline TCDD : Dioxine TCPOBOP : 1,4-bis[2-(3,5-dichloropyridyloxy)] benzene TEA : Tétraéthylammonium THBQ : Tertbutylhydroquinone TMD : Transmembrane Domain
TNF α : Tumor Necrosis Factor alpha TTBS : Tween-Tris Buffer Sal INTRODUCTION   Dans la société actuelle et plus particulièrement dans les pays industrialisés, l’espérance de vie augmente régulièrement. Ceci est principalement dû à un système de santé qui ne cesse de progresser et de se perfectionner en terme de prévention et de soins. Néanmoins, en vieillissant, notre organisme subit des altérations qui peuvent conduire à l’apparition de cancers ou d’autres maladies. La médecine dispose aujourd’hui de traitements, souvent médicamenteux, afin de lutter contre une maladie (le cancer notamment) ou prévenir son arrivée. Mais certains patients développent des mécanismes de résistance (chimiorésistance) à ces traitements pouvant entraîner une diminution voire une suppression totale de leur efficacité. Aussi, dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, les industries pharmaceutiques sont désormais tenues de démontrer que les produits qu’elles synthétisent ne sont pas soumis à des phénomènes de chimiorésistance. Elles tentent avant tout d’évaluer la biodisponibilité de leur médicament au niveau de l’organisme et de préciser leurs paramètres pharmacocinétiques, des informations requises lors de la constitution des dossiers d’Autorisation de Mise sur le Marché. Pour ce faire, elles s’intéressent au devenir de leurs produits au niveau d’organes tels que le foie, les reins, les intestins et la barrière hémato-encéphalique qui sont capables par la présence de transporteurs membranaires spécifiques d’absorber et d’éliminer ces produits. Ces industriels devront connaître les voies de régulation de l’expression de ces transporteurs afin d’évaluer la capacité de leurs molécules à induire l’expression de certains d’entre eux et ainsi provoquer une chimiorésistance et si elles peuvent être à l’origine d’interactions médicamenteuses en modifiant la prise en charge par les transporteurs de médicaments associés.          I)             Pourquoi le foie ?  Le foie est l'organe le plus volumineux du corps humain (il pèse environ 1,5 kg). Très vascularisé, il favorise des échanges importants avec le sang. Il peut être assimilé à une glande digestive par la production et la sécrétion de la bile (sécrétion exocrine vers le duodénum). Il est également doué d’une forte capacité à métaboliser des produits endogènes ou exogènes à l’organisme. Il intervient aussi dans d’autres fonctions vitales : participation à la synthèse de protéines, à la synthèse et à la dégradation des lipides, à l’homéostasie glucidique, etc…. Le foie est donc un organe indispensable à la vie.  a)    Anatomie structurale du foie  Le foie est constitué d'unités appelées lobules hépatiques. Sur des coupes microscopiques, ces lobules de forme hexagonale sont cernés par des espaces formés de tissu conjonctif appelés espaces de Kiernan ou espaces portes. Le lobule hépatique est constitué de travées de Remak, de capillaires radiés (ou capillaires sinusoïdes) et de canalicules biliaires: - les travées de Remak rayonnent à partir du centre du lobule occupé par une veine, la veine centrolobulaire. Ce sont les hépatocytes, cellules spécialisées du foie, qui constituent ces travées. - les capillaires radiés ou capillaires sinusoïdes sont de gros capillaires ayant la même orientation que les travées de Remak. Ils n'ont pas de membrane basale et la paroi endothéliale est discontinue et formée de deux types cellulaires : les cellules endothéliales et les cellules de Küpffer (cellules réticulaires bordantes ou macrophages bordants). Les capillaires sinusoïdes assurent la circulation sanguine depuis les vaisseaux contenus dans les espaces portes jusqu'à la veine centrolobulaire. La circulation du lobule hépatique est donc centripète. - les canalicules biliaires ont eux aussi la même orientation que les travées de Remak. Ils sont mis en évidence en microscopie par des techniques spéciales (injection d'encres, imprégnation de Gomori) et se révèlent être dépourvus de paroi propre. En effet, c’est l’écartement des membranes plasmiques d'hépatocytes voisins en vis-à-vis qui va permettre la formation d’un petit canalicule biliaire fermé étroitement par des complexes de jonction (de type occludens) afin d’éviter le passage de la bile dans les espaces intercellulaires. Ces canalicules formés vont ainsi véhiculer la bile de façon centrifuge en direction des espaces portes et, ensuite, via le passage de Hering, aboutir au canal biliaire.
 b)    Le foie : organe de détoxication.  Etant très vascularisé, le foie effectue de nombreux échanges, principalement avec le sang provenant de la veine porte. En effet, c’est cette veine qui conduit au foie le sang chargé de toutes les substances absorbées au niveau de la paroi du tube digestif. L’artère hépatique quant à elle va amener au foie du sang oxygéné de composition stable permettant son bon fonctionnement. Le foie est un organe majeur essentiel à notre survie puisqu’il métabolise les glucides, lipides et protéines et participe ainsi à la régulation de leur concentration dans l’organisme. Il intervient également dans le cycle de l’urée et dans la synthèse de nombreuses protéines plasmatiques (albumine). Mais surtout, et c’est ce qui nous intéressera plus particulièrement tout au long de cette étude, il assure une fonction de détoxication primordiale dans l’élimination des xénobiotiques de l’organisme. Le métabolisme hépatique peut se découper en quatre phases : - La Phase 0, correspondant à l’entrée passive (ou facilitée) ou active des xénobiotiques par des transporteurs membranaires d’influx (au niveau sinusoïdal ou vasculaire). - La Phase I, comprenant des réactions d’oxydation, de réduction et d’hydrolyse. Ces étapes font intervenir plusieurs systèmes enzymatiques dont les monooxygénases à cytochrome P450s (CYPs) qui permettent la libération ou la formation de groupements réactifs (-OH). - La Phase II, une étape de conjugaison des produits issus de la phase I à des composés endogènes présents dans le foie (comme le glutathion). Cette étape peut se faire grâce à la présence d’enzyme de conjugaison comme les glutathion-S-transférases (GSTs), les glucuronyl transférases, les époxydes transférases ou encore les sulfotransférases. - La Phase III permettant l’élimination de ces composés hydrophiles suite à l’intervention de protéines de transport. Phase IIIa : Excrétion dans la bile (au niveau biliaire) Phase IIIb : Réexcrétion dans le sang des métabolites pour une élimination rénale secondaire (cas du transporteur MRP3) (au niveau sinusoïdal).  c)     Localisation des transporteurs membranaires hépatiques :  Dans cette étude, nous nous intéressons principalement aux transporteurs membranaires se trouvant au niveau des cellules parenchymateuses spécialisées du foie : les hépatocytes. Les hépatocytes sont des cellules polyédriques de grande taille au noyau central, rond, volumineux et au cytoplasme éosinophile granuleux. Certains d’entre eux peuvent être binucléés. Ils sont aussi polarisés et trois pôles sont définis au niveau de l’hépatocyte : le pôle sinusoïdal, le pôle latéral (jonction entre les hépatocytes), et le pôle biliaire (pôle communicant avec les canalicules biliaires).  1)     Le pôle sinusoïdal  Le pôle sinusoïdal des hépatocytes, encore appelé pôle basal, est un domaine représentant environ 70% de la surface membranaire des hépatocytes. Il est très riche en microvillosités et se trouve au contact des espaces de Disse, eux-mêmes en relation avec les sinusoïdes. Toutes les conditions sont donc réunies pour faciliter les échanges entre le sang et les hépatocytes. Le pôle sinusoïdal est en mesure de capter les nutriments ou xénobiotiques apportés par la veine porte. Pour permettre leur entrée dans ces cellules, la présence de transporteurs spécifiques est requise. Ainsi, on trouve, au niveau du pôle sinusoïdal, des protéines de transport appartenant principalement à la famille des SLC (pour Solute Carrier) transporteurs.  2)     Le pôle latéral  Le domaine latéral est lisse et représente environ 15% de la surface membranaire de l’hépatocyte. Ce pôle permet la sécrétion de substances produites par les hépatocytes (notamment des métabolites) dans la circulation générale. La sécrétion de ces substances s’effectue par l’intermédiaire d’un transport actif réalisé par des protéines appartenant à la famille des ABC (pour Adénosine Tri-Phosphate (ATP) Binding Cassette) transporteurs.  3)     Le pôle biliaire  Le pôle biliaire ou pôle apical est hautement spécialisé et riche en microvillosités. Il représente 10 à 15% de la surface totale des hépatocytes. L’abondance d’acide sialique, l’augmentation du rapport cholestérol/phospholipides et la diminution du rapport phospholipides/sphingomyéline confèrent à la membrane plasmique de ce pôle une résistante plus importante à l’action détergente des acides biliaires, propriété que ne possèdent pas les pôles décrits précédemment. Au niveau du pôle biliaire, on retrouve d’autres transporteurs membranaires (figure 6) appartenant à la famille des ABC transporteurs
qui permettent l’excrétion dans la bile de substances endogènes ou exogènes à l’organisme. Via le canal biliaire, ces substances seront éliminées du foie, stockées dans la vésicule biliaire et enfin excrétées dans la lumière intestinale.  
 
 
                Figure 6 : Schématisation de la répartition des transporteurs membranaires présents au niveau des hépatocytes de rongeurs ou d’homme.     1 : Pôle sinusoïdal ; 2 : Pôle biliaire ; 3 : Pôle latéral  NTCP ou Ntcp : Sodium taurocholate co-transporting polypeptide OATPs ou Oatps : Organic anion transport protein OCTs ou Octs : Organic cation transporter OATs ou Oats : Organic anion transporter MRPs ou Mrps : Multidrug resistance protein MDR ou Mdr : Multidrug resistance BSEP ou Bsep : Bile salt export pump BCRP ou Bcrp : Breast cancer resistance protein  Les majuscules sont attribuées aux transporteurs présents chez l’homme et les minuscules aux transporteurs présents chez le          II)         Les transporteurs membranaires hépatiques :  Nous avons pu voir précédemment que le foie permet l’absorption et l’élimination d’un certain nombre de composés endogènes ou exogènes, et donc le maintien de l’homéostasie de ces composés au niveau de l’organisme. Nous allons maintenant nous intéresser aux différents acteurs participant à ce système de transport.  a)    Qu’est-ce qu’un système de transport :  Etant donné le degré de complexité d’un organisme vivant, une coopération entre les différentes cellules qui le composent est impérative. Chacune d’entre elles, constitue un élément clé où s’effectue la gestion de toutes les grandes fonctions physiologiques (respiration, métabolisme…). Par conséquent, afin de favoriser les échanges avec son environnement, la cellule devra permettre l’entrée ou la sortie de substances endogènes ou exogènes au travers de sa membrane plasmique via différents modes de transport (Saier, 2000).  1)     Transport passif :  
- Diffusion simple :  Passage libre de molécules hydrophobes ou non chargées au travers de la membrane phospholipidique selon leur gradient de concentration. Passage d’ions au travers de canaux ioniques, qui constituent de véritables « trous » dans la membrane à l’état ouvert ou fermé. - Diffusion facilitée :   Passage de certains xénobiotiques selon leur gradient de concentration par l’intermédiaire de protéines membranaires spécifiques.  2)     Transport actif : - Le transport actif primaire :  Il concerne l’ensemble des ABC transporteurs. Ce type de transport nécessite un apport d’énergie fourni par l’hydrolyse de l’ATP. - Le transport actif secondaire :  Il concerne l’ensemble des SLC transporteurs. Ce type de transport nécessite, lui aussi, un apport d’énergie qui peut se faire par co-transport, d’un ion le plus souvent (Ex : Le Na +  dans le cas du transporteur NTCP), ou par un transport antiport, c’est-à-dire que l’élimination d’un composé intracellulaire va permettre l’entrée d’un composé extracellulaire (Ex : les OATPs et le glutathion).         3)     Transport par endocytose ou exocytose :  Ce type de transport non décrit dans le schéma ci-dessus concerne les macromolécules et implique des mécanismes de fusion membranaire.  b)    Les transporteurs membranaires de la famille SLC :  Nous avons pu voir que les transporteurs membranaires de la famille SLC se situent au niveau du pôle sinusoïdal des hépatocytes. L’emplacement de ces transporteurs est en étroite relation avec leur fonction qui est de capter et d’importer dans le foie des xénobiotiques ou des métabolites endogènes présents dans la circulation sanguine. La famille des transporteurs SLC compte aujourd’hui 43 sous-familles (cf le site : ) contenant elles-mêmes différents membres. Ces différentes sous-familles sont classées en fonction de leur structure et de leurs fonctions. Dans notre étude, nous nous sommes focalisés sur des transporteurs membranaires spécifiques du foie, pour la plupart, et appartenant à trois sous-familles différentes des transporteurs SLC : -       La sous-famille SLC10 -       La sous-famille SLC21 ou SLCO -       La sous-famille SLC22  1)     La sous-famille SLC10 :  La sous famille SCL10 était composée initialement de 2 transporteurs (NTCP et ASBT (pour Apical Sodium-dependent Bile acid Transporter)) dont la caractéristique est de faire entrer les acides biliaires, conjugués ou non, en co-transport avec les ions Na + dans la cellule (Hagenbuch and Dawson, 2004; Geyer et al., 2006). Par la suite, 3 autres transporteurs présentant une forte homologie de séquence avec NTCP et ASBT ont pu être classés dans cette sous-famille mais leur fonction n’est pas encore établie. De récentes études montrent que ces protéines sont formées de neufs domaines transmembranaires qui subissent des modifications post-traductionnelles comme l’insertion d’alanine et la glycosylation. Pour nos travaux, nous nous sommes principalement intéressés à la protéine NTCP très fortement exprimée dans les hépatocytes. C’est une glycoprotéine constituée de 349 acides aminés et dont la masse molaire est de 56 kDa. Située au niveau de la membrane sinusoïdale des hépatocytes, elle permet une extraction efficace des acides biliaires présents au niveau de la veine porte. Chez le rat et la souris, ce transporteur partage 80% d’homologie avec le transporteur humain. Néanmoins, il existe chez la souris des variants (Hagenbuch and Dawson, 2004): Ntcp1 (362 aa) et Ntcp2 (317 aa). Le transporteur NTCP est largement étudié notamment dans le cas de cholestase puisqu’il s’agit d’un transporteur très largement réprimé par les cytokines. Récemment, il a été montré que son expression en ARNm (pour Acide RiboNucléique messager) est réduite chez des patients dont le foie est atteint de cholestase : le flux d’acides biliaires étant perturbé, des dysfonctionnements profonds pourraient apparaître au niveau de l’hépatocyte (Zollner et al., 2001; Keitel et al., 2005).  2)     La sous-famille SLC21/SLCO :  La sous-famille SLC21 compte 36 membres dont la plupart sont répartis de façon assez ubiquiste dans de nombreux tissus. Nous
nous focaliserons sur les membres présents au niveau hépatique. Contrairement à d’autres transporteurs membranaires, il existe peu d’homologies au niveau des séquences en acides aminés et de la fonction des transporteurs OATPs et Oatps présents dans les hépatocytes chez le rongeur ou chez l’homme. Néanmoins, ces transporteurs ont une structure commune : il s’agit de protéines avec douze domaines transmembranaires, une large boucle extracellulaire émergeant entre les domaines transmembranaires 9 et 10, et de nombreux sites de N-glycosylation et de phosphorylation présents sur les domaines extracellulaires (Hagenbuch and Meier, 2004; Mikkaichi et al., 2004). Les transporteurs OATPs identifiés à ce jour au niveau des hépatocytes humains sont OATP-A, OATP-B, OATP-C ou LST-1 (pour Liver Specific Transporter) et OATP8. OATP-A est une glycoprotéine de 670 acides aminés et de masse molaire finale 85 kDa dans le foie. Elle présenterait le spectre de substrat le plus étendu comparé aux autres OATPs présentes au niveau du foie. La N-méthyl quinine serait un substrat spécifique de cette protéine selon une étude réalisée par Kullak-Ublick et al. (Kullak-Ublick et al., 2001). OATP-C (Abe et al., 1999) est une glycoprotéine de 691 acides aminés et de masse molaire 84 kDa (54kDa si déglycosylation). En raison de son expression exclusive au niveau du foie, OATP-C pourrait jouer un rôle crucial dans la clairance hépatique des composés organiques amphiphiles liés à l’albumine. Elle a, elle aussi, un spectre de substrat très large, mais aucun substrat spécifique n’a encore été déterminé. OATP8 est une glycoprotéine de 702 acides aminés et de masse molaire 120 kDa (65 kDa si déglycosylation). Elle est, dans des conditions physiologiques normales, exprimée exclusivement au niveau du foie mais son expression est corrélée à l’apparition de cancers dans certains autres tissus. Son rôle, dans ces cas là, n’est pas encore identifié. OATP8, avec un spectre de substrat aussi large que celui d’OATP-C, est en l’état actuel des connaissances la seule protéine OATP intervenant dans le transport de la cholécystokinine 8 (CCK-8), de la deltorphine II, de la digoxine ou de l’ouabaïne. OATP-B est une glycoprotéine de 709 acides aminés et de masse molaire 85 kDa. Comparée aux OATPs décrites précédemment, OATP-B est la protéine qui reconnaît le moins de substrats : BSP, ES, DHEAS. Les transporteurs Oatps présents au niveau des hépatocytes de rongeurs sont Oatp1, Oatp2 et Oatp4. Oatp1 et 2 sont toutes deux des protéines homologues à OATP-A humaine et elles ont donc de nombreuses caractéristiques communes avec ce transporteur. La protéine Oatp4, quant à elle, est homologue aux protéines OATP-C et OATP8 et est aussi spécifique au foie.  3)     La sous-famille SLC22 :  La sous-famille SLC22 comprend 18 membres dont, à l’instar des protéines OATPs, nombre d’entre eux sont répartis de façon assez ubiquiste (Burckhardt and Wolff, 2000; Sekine et al., 2000; Koepsell and Endou, 2004; Miyazaki et al., 2004). Nous nous focaliserons sur les membres présents au niveau du foie et tout particulièrement aux transporteurs les plus exprimés dans cet organe : OCT1 et OAT2. En raison du peu d’éléments dont nous disposions les concernant et malgré leur spécificité hépatique, nous n’avons pas inclus les transporteurs OAT5 et OCT3 dans cette étude.  OCT1 est une protéine de 554 acides aminés et de masse molaire théorique de 47 kDa. Toutefois, après Western blot chez le rat, une protéine de 70 kDa a été détectée (Denk et al., 2004). Elle serait composée de douze domaines transmembranaires (figure 10). Parmi les autres protéines OCTs, OCT1 est le transporteur qui a le spectre de substrats et d’inhibiteurs le plus étendu. La plupart de ces substrats sont des cations organiques, mais OCT1 peut aussi transporter des composés non chargés et quelques anions. Ses substrats lesplus connus sont le tétraéthylammonium (TEA), la N-méthylquinine, des médicaments comme la despramine, l’aciclovir, la metformine et des composés endogènes comme la sérotonine ou la prostaglandine E 2 (PGE 2 ). OCT1 présente les mêmes caractéristiques fonctionnelles chez le rat et chez l’homme.  OAT2 est une protéine de 546 acides aminés (Sekine et al., 1998). Elle possèderait elle aussi douze domaines transmembranaires et son poids moléculaire serait de 60 kDa chez le rat (Kojima et al., 2002). OAT2 prend en charge les composés anioniques de faible poids moléculaire et son substrat le plus connu est le paraaminohippurate (PAH). Chez le rat, les dicarboxylates, PGE 2 , l’acide salicylique et l’acide acétylsalicylique ont été caractérisés comme des substrats de rOAT2. Chez l’homme hOAT2 prend aussi en charge l’ES.  c)     Les transporteurs membranaires de la famille ABC :  Précédemment, nous avons vu que les transporteurs de la famille ABC se situent au niveau des pôles latéraux et bilaires des hépatocytes. L’emplacement de ces transporteurs membranaires est lié à leur fonction qui est d’excréter soit dans le sang, soit dans la bile, un certain nombre de composés ou métabolites endogènes ou exogènes et conjugués. Les protéines appartenant à cette famille nécessitent toutes un apport d’ATP pour fonctionner. La famille ABC compte aujourd’hui 7 sous-familles composées elles-mêmes de différents membres dont les structures primaires présentent un certain nombre d’homologies (cf le site : ). Pour notre étude, nous avons ciblé les transporteurs les plus exprimés dans le foie et connus pour leur rôle majeur dans l’élimination
de composés endogènes ou exogènes dans la bile ou dans la circulation sanguine. Ainsi, nous nous sommes intéressés plus particulièrement aux membres des sous-familles suivantes : - La sous-famille ABCB               La sous-famille ABCC -- La sous-famille ABCG         1)     La sous-famille ABCB :  La sous-famille ABCB comprend 11 membres dont 8 sont exprimés au niveau d’organites de la cellule comme les mitochondries, les lysosomes ou le réticulum endoplasmique. Pour ce projet, nous avons choisi d’étudier essentiellement les protéines MDR1 et BSEP. En effet, si le rôle de MDR3 au niveau du transport des médicaments n’est pas établi, celui de MDR1 est important lors des phénomènes de chimiorésistance. Le transporteur BSEP a, quant à lui, été récemment mis en relation avec des phénomènes d’interactions médicamenteuses (Hirano et al., 2005) et son activité peut, comme pour MDR1, être évaluée à l’aide de substrats fluorescents (Wang et al., 2003). MDR1 et BSEP possèdent deux domaines transmembranaires MSD (pour membrane spanning domain) ayant plusieurs sous-unités TDM (pour transmembrane domain). Les domaines NBD (pour nucleotide-binding domain) sont des sites de liaison à l’ATP. MDR1 connue aussi sous le nom de P-gp a été le premier transporteur de la famille ABC à être caractérisé en raison de sa forte implication lors de chimiorésistance. Cette protéine possède un large spectre de substrats incluant de nombreux médicaments anti-cancéreux et est capable d’éliminer à la fois des substrats hydrophobes comme la colchicine, l’étoposide, l’adriamycine et la vinblastine, mais également des lipides, des stéroïdes, des xénobiotiques et des peptides. BSEP est une protéine de 150 à 170 kDa selon les espèces. Elle prend principalement en charge des acides biliaires conjugués ou non. Elle ne joue pas un rôle essentiel dans l’élimination de xénobiotiques au niveau du foie (excepté pour le transport de la pravastatin (Hirano et al., 2005)), mais peut interagir avec des drogues, entraînant alors son dysfonctionnement et donc un phénomène d’hépatotoxicité (Roman et al., 2003; Wang et al., 2003).   2)     La sous-famille ABCC :  La sous-famille ABCC comprend 13 membres, dont 8 exprimés au niveau du foie. Pour cette étude, nous nous sommes principalement intéressés aux transporteurs MRP2 et 3 qui ont un rôle très important au niveau du foie puisqu’ils contribuent à l’élimination des acides biliaires. Ces deux protéines ont une structure commune à celle de MRP1 et caractéristique. Elles possèdent, comme MDR1, deux domaines NBD. En revanche, elles possèdent trois domaines MSD, au lieu de deux uniquement pour MDR1, et le domaine MSD1 possède une extrémité NH2-terminale extracellulaire. Ce domaine MSD1 va par conséquent influer sur le pourcentage d’analogie entre les différents membres de la famille MRP. En revanche, il n’intervient pas sur l’activité de transport ou sur l’adressage de la protéine à la membrane. Les domaines MSD1 et MSD2 sont reliés par une boucle cytoplasmique (CL3) qui semble être indispensable à l’activité de transport. MRP2 se situe au niveau du pôle biliaire de l’hépatocyte et permet donc l’élimination dans la bile de divers composés. Ces composés sont pour la plupart des anions organiques comme le LTC4, les acides biliaires divalents et les composés conjugués au glutathion, au glucuronide ou au sulfate. Un déficit de la protéine MRP2 va entraîner un déficit de l’élimination des anions organiques, comme dans le syndrome cholestatique ou la maladie de Dubin-Johnson. Lors de ce dernier cas, pour compenser le manque d’élimination des anions organiques au pôle biliaire, l’expression du transporteur MRP3 est augmentée (Kullak-Ublick et al., 2004). En effet, MRP3, de même que MRP2, permet le relargage d’anions organiques comme les acides biliaires monovalents ou les acides biliaires sulfo-conjugués ainsi que l’E2-17-β -D-G, l’acétaminophène glucuronide et le méthotrexate dans le sang, par sa position au pôle basolatéral.  3)     La sous-famille ABCG :  La sous-famille ABCG comprend 6 membres dont la protéine ABCG2, aussi appelée BCRP, impliquée dans le phénomène de chimiorésistance et exprimée notamment au niveau du foie (Doyle and Ross, 2003; Staud and Pavek, 2005). La protéine ABCG2 contient 655 acides aminés et possède une masse molaire de 72 kDa. Elle est formée par une extrémité NH2-terminale cytosolique reliée à un domaine NBD de liaison à l’ATP et contient un domaine transmembranaire MSD1 qui lui confère ses propriétés de liaison et d’efflux des médicaments. BCRP est considérée comme un hémi-transporteur, c’est-à-dire que pour être complètement fonctionnelle, elle va devoir former des homodimères liés par des ponts disulfures de 140 kDa environ. BCRP a une répartition ubiquiste au niveau de l’organisme. On la retrouve au niveau du placenta, du foie, de l’intestin, du muscle cardiaque, du pancréas et dans les cellules endothéliales. C’est une protéine qui, comme MDR1, intervient dans la pharmacocinétique de nombreux composés en raison de son
positionnement au niveau du foie, de l’intestin et des reins et elle contribue aux phénomènes de chimiorésistance, notamment dans les leucémies aigües myéloïdes et les leucémies aigües lymphoblastiques. Elle possède un spectre de substrat étendu et peut transporter des médicaments anti-tumoraux (mitoxanthrone, methotrexate, camptothecine, etc…), des composés endogènes (ES, E2-17-β -D-G, etc…) et des composés fluorescents (Hoechst 33342, BODIPY-prasozin, etc…). Il existe des inhibiteurs de ce transporteur, en particulier la fumitremorgine C, la novobiocine et le GF120918.       d)    Régulation de l’expression des transporteurs membranaires hépatiques :  Les transporteurs membranaires étant impliqués dans l’élimination ou l’absorption de divers composés, il semble important d’étudier la régulation de leur expression aussi bien en ARNm qu’en protéine, car de cette régulation peut dépendre une modification du transport de certains médicaments et donc de leurs paramètres pharmacocinétiques, la survenue de chimiorésistance ou encore d’autres pathologies (ex : cholestase en ce qui concerne le foie). De nombreuses études conduites en premier lieu sur les enzymes de Phase I ont montré que des xénobiotiques (rifampicine (RIF), phénobarbital (PB), benzo(a)pyrène, etc…) sont capables d’induire l’expression de certaines de ces enzymes, entraînant une modification de leur métabolisme au niveau de la cellule. En parallèle, des études ont été réalisées sur les transporteurs, mais avec pour cibles les transporteurs d’efflux dont MDR1 et MRP2 considérés jusqu’ici comme les acteurs principaux des mécanismes de chimiorésistance et de transport au niveau hépatique. Pour mieux comprendre le choix des xénobiotiques utilisés dans notre étude, nous allons faire le point sur les connaissances relatives à la régulation des transporteurs hépatiques.  1)     Régulation des transporteurs de la sous-famille ABCB :  a)     BSEP :  Bsep/BSEP étant le transporteur majoritaire des acides biliaires au niveau des hépatocytes, il paraissait intéressant d’évaluer leur impact au niveau de sa régulation. Ainsi, il a pu être montré que des souris nourries avec des acides biliaires présentent une augmentation de l’expression de Bsep au niveau de l’ARNm et de la protéine (Arrese and Ananthanarayanan, 2004). Les acides biliaires faisant partie des principaux activateurs du récepteur nucléaire orphelin FXR (pour farnesoid X receptor), l’implication de celui-ci dans ce phénomène a été mis en évidence chez des souris FXR-/- qui ne montrent qu’une induction partielle de Bsep (Kullak-Ublick, 2003; Arrese and Ananthanarayanan, 2004; Eloranta and Kullak-Ublick, 2005). De plus, ce récepteur permet une induction de Bsep/BSEP quand il s’hétérodimérise avec son partenaire le RXR (pour retinoid X receptor) (Karpen, 2002; Redinger, 2003). Ce complexe se lie alors à un élément de réponse IR-1 (pour Inverted Repeat) situé au niveau du promoteur de BSEP (Eloranta and Kullak-Ublick, 2005; Deng et al., 2006). Une étude récente montre que des ligands du LXR (liver X receptor) sont aussi capables d’induire l’expression de BSEP via une activation du FXR (Deng et al., 2006). Bsep/BSEP, par sa fonction au niveau hépatique, est particulièrement impliquée dans les cas de cholestase où une perte totale de son activité est observée. Néanmoins, chez différentes espèces (rat et homme), cette baisse d’activité n’est pas forcément due à une diminution de l’expression en ARNm ou en protéine, mais à une internalisation de la protéine ce qui impliquerait une régulation post-transcriptionnelle dépendante de certaines kinases (Protein Kinase C = PKC, P38)(Kubitz et al., 2004). Sa réinsertion au niveau membranaire ferait, quant à elle, intervenir la voie de l’AMPc (Crocenzi et al., 2005). En revanche, des patients atteints de cholestase présentent, suite à une inflammation, une diminution de l’expression de BSEP (Zollner et al., 2001) également retrouvée in vivo chez la souris (Hartmann et al., 2002).  b)     MDR1 :  La protéine MDR1 fait partie des premiers transporteurs d’efflux à avoir été impliqués dans des phénomènes de chimiorésistance. Ainsi, très tôt, de nombreuses équipes se sont attachées à tenter de comprendre les mécanismes intervenant dans sa régulation. La première voie mise en évidence dans cette régulation fait intervenir le PXR (pour Pregnane X receptor). En effet, une induction de MDR1 est observée en présence d’agonistes de ce récepteur (rifampine, clotrimazole, nifédipine, etc…) dans différents modèles intestinaux et dans des hépatocytes humains. Les différents auteurs s’accordent à dire que cette régulation se ferait suite à une liaison de PXR à un élément de réponse DR-4 (pour Direct Repeat) présent dans la région promotrice de MDR1 (Geick et al., 2001; Kullak-Ublick
and Becker, 2003; Fernandez et al., 2004; Mills et al., 2004; Albermann et al., 2005). Par ailleurs, d’autres récepteurs tels que CAR (pour Constitutive Androstane Receptor) et LXR peuvent se lier à cet élément de réponse (Geick et al., 2001). Ainsi, de récentes études montrent que CAR peut moduler l’expression de MDR1 (Burk et al., 2005b) via l’élément de réponse DR-4 (Burk et al., 2005a). Des médicaments anti-cancéreux comme le cisplatine et le paclitaxel induisent aussi l’expression de P-gp. Cette induction serait également due à une activation du PXR (Masuyama et al., 2005). D’autres métaux comme l’arsenic et le cadmium induisent l’expression de MDR1 (Fardel et al., 1996; Vernhet et al., 2001;). Certaines pathologies du foie, notamment la cholestase, peuvent se produire suite à un enchaînement de réactions inflammatoires qui provoquent la production de cytokines par les cellules de Küpffer. Lors de cholestases induites par le tétrachlorure de carbone (CCl 4 ) chez le rat, l’expression de la P-gp est augmentée (Fardel et al., 1996). Plusieurs équipes ont montré que le TNF α (pour Tumor Necrosis Factor alpha) entraîne chez le rat et la souris in vivo  et/ou in vitro  une induction de l’ARNm et de la protéine Mdr1b. L’IL-6 (pour interleukin-6) et l’IL-1 β  (pour interleukin-1beta) entraînent, quant à elle, une diminution de l’expression de Mdr1b in vivo  et in vitro chez le rat (Hartmann et al., 2002). En revanche, chez la souris, l’IL-1 β  provoque une augmentation de la protéine Mdr1b. Il y aurait donc des variations inter-espèce. Néanmoins, l’IL-6 provoque aussi une diminution de MDR1 dans les cellules HepG2 (Fernandez et al., 2004). L’action des cytokines a souvent été décrite comme passant par l’activation de la voie NF-kB (pour Nuclear Factor-kappa B) et il a été montré que ce facteur de transcription joue un rôle dans la régulation de la P-gp (Fardel et al., 2001; Fernandez et al., 2004; Puhlmann et al., 2005). La voie du stress oxydant semble également intervenir dans la régulation de MDR1. Elle passerait par une augmentation de l’expression de la cyclooxygénase 2 qui entraîne la synthèse de prostaglandines tel que le PGE 2 . Après fixation sur leurs récepteurs (EP1-4 = E-prostanoid 1-4), à la surface de la cellule, ces prostaglandines activeraient la voie de l’AMPc/PKA (pour Protein kinase A) (Ziemann et al., 2002; Puhlmann et al., 2005; Ziemann et al., 2006) à la fois chez le rat et l’homme.            2)     Régulation des transporteurs de la sous-famille ABCC :  MRP2 et MRP3 sont les MRPs majoritaires au niveau du foie. Elles assurent une fonction importante puisqu’elles permettent l’élimination d’acides biliaires et peuvent compenser l’absence de BSEP. Elles transportent aussi des xénobiotiques.  a)     MRP2 :  MDR1 étant régulée par PXR, cette piste a été très vite envisagée pour le cas de MRP2. Il a été montré que la dexaméthasone, un glucocorticoïde de synthèse, conduit à une augmentation de l’ARNm et de la protéine Mrp2/MRP2 dans des cultures primaires d’hépatocytes (Gerk and Vore, 2002; Bohan et al., 2003; Haimeur et al., 2004) de rat ou d’homme et in vivo chez le rat (Fardel et al., 2001; Johnson and Klaassen, 2002). La dexaméthasone est un activateur à la fois du récepteur aux glucocorticoïdes (GR) et de PXR. Cependant, dans le cas de MRP2, le GR n’est pas impliqué (Fardel et al., 2001; Johnson and Klaassen, 2002). La piste d’une activation par le PXR semblait donc probable et cette voie a été démontrée in vitro et in vivo , en utilisant un agoniste de PXR, le pregnenolone-16alpha-carbonitrile (PCN) (Gerk and Vore, 2002; Johnson and Klaassen, 2002; Haimeur et al., 2004; Pulaski et al., 2005). Ces résultats ont aussi été confirmés en utilisant des souris PXR-/- (Kast et al., 2002). La RIF, un autre ligand de PXR, semble donner des résultats identiques (Kast et al., 2002; Kauffmann et al., 2002). Le 2-acétylaminofluorène (2-AAF) a également été montré comme entraînant une induction de Mrp2/MRP2 à la fois chez le rat et chez l’homme dans des cellules dérivant du foie(Fardel et al., 2001; Schrenk et al., 2001; Gerk and Vore, 2002; Haimeur et al., 2004). Un article récent de Anapolsky et al (Anapolsky et al., 2006) montre que son action passerait par une activation de PXR. Des acides biliaires comme l’acide cholique (AC), l’acide ursodéoxycholique (AUDC) et l’acide chénodéoxycholique (ACDC) peuvent, via une activation du complexe FXR/RXR α , augmenter l’expression de MRP2 (Zollner et al., 2003). Mrp2/MRP2 est en outre régulée par le PB sur différents types de cellules dérivant du foie(Schrenk et al., 2001; Courtois et al., 2002; Gerk and Vore, 2002; Johnson and Klaassen, 2002; Payen et al., 2002; Haimeur et al., 2004) (souris, homme, rat), mais pas in vivo chez le rat (Fardel et al., 2001; Courtois et al., 2002; Gerk and Vore, 2002; Johnson and Klaassen, 2002; Haimeur et al., 2004). Une étude réalisée par Kast et al. synthétise ces résultats en montrant que Mrp2/MRP2, qu’elle soit d’origine humaine, murine ou de rat, est régulée par les différents récepteurs nucléaires CAR, PXR et FXR, et que cette régulation se ferait au niveau d’un élément de réponse ER-8 commun aux différents complexes avec RXR α (Cherrington et al., 2002; Kast et al., 2002). L’impact de médicaments anticancéreux (cisplatine et arsenic) et d’antioxydants (oltipraz = OPZ, sulforaphane, terbutylydroquinone = THBQ et dioxine = TCDD) a aussi été démontré. Le cisplatine et l’arsenic provoquent une augmentation de Mrp2/MRP2 sur des cultures primaires d’hépatocytes de rat et d’homme (Schrenk et al., 2001; Vernhet et al., 2001; Gerk and Vore, 2002; Haimeur et al., 2004), de même que l’OPZ (Fardel et al., 2001; Johnson and Klaassen, 2002; Payen et al., 2002; Haimeur et al., 2004), le sulforaphane (Haimeur et al., 2004) et le THBQ (mais pas dans les hépatocytes pour ce dernier) (Bock et al., 2000; Kauffmann et al., 2002). Le mécanisme d’action de ces trois derniers produits pourrait passer par l’activation de la voie Nrf2 (pour Nuclear factor E2 p45-related factor 2) (Maher et al., 2005). En revanche, concernant l’effet de la TCDD, une publication de Bock et al montre qu’elle n’influence pas l’expression de MRP2 dans des cellules caco2 provenant d’un carcinome de colon humain (Bock et al., 2000) alors que l’équipe de
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