MINISTÈRE DE LA JEUNESSE DE L'ÉDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE

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MINISTÈRE DE LA JEUNESSE, DE L'ÉDUCATION NATIONALE, ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la Vie et de la Terre MÉMOIRE Présenté par Else Marit Inderberg-Suso pour l'obtention du diplôme de l'École Pratique des Hautes Études DÉVELOPPEMENT D'UN MODÈLE MURIN DE MÉLANOME INDUCTIBLE EXPRIMANT UN ANTIGÈNE TUMORAL DÉFINI ET CARACTÉRISATION IMMUNOLOGIQUE Soutenu le 20 décembre 2005, devant le jury suivant : Pr EXBRAYAT Jean-Marie - Président Pr Cordier Geneviève - Rapporteur Dr Schmitt-Verhulst Anne-Marie - Examinateur Dr Aubert Denise - Examinateur Laboratoire EPHE Interactions cellulaires, rétrovirus et cancer IFR 128 Biosciences Lyon-Gerland UMR 754 INRA-ENVL-UCBL Rétrovirus et pathologie comparée, 50 avenue Tony Garnier, 69366 Lyon cedex 07 Directeur : Pr Geneviève Cordier () Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy CNRS INSERM Université de la Méditerranée Parc Scientifique et Technologique de Luminy Case 906, 13288 Marseille Cedex 9 Directeur de stage: Dr Anne-Marie Schmitt-Verhulst () DÉVELOPPEMENT D'UN MODÈLE MURIN DE MÉLANOME INDUCTIBLE EXPRIMANT UN ANTIGÈNE TUMORAL DÉFINI ET CARACTÉRISATION IMMUNOLOGIQUE EPHE Banque de Monographies SVT 1

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Publié le : jeudi 1 décembre 2005
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MINISTÈRE DE LA JEUNESSE, DE L’ÉDUCATION NATIONALE, ET DE LA RECHERCHE  ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES  Sciences de la Vie et de la Terre   MÉMOIRE  Présenté par Else Marit Inderberg-Suso  pour l’obtention du diplôme de l’École Pratique des Hautes Études   DÉVELOPPEMENT D’UN MODÈLE MURIN DE MÉLANOME INDUCTIBLE EXPRIMANT UN ANTIGÈNE TUMORAL DÉFINI ET CARACTÉRISATION IMMUNOLOGIQUE    Soutenu le 20 décembre 2005, devant le jury suivant : Pr EXBRAYAT Jean-Marie -Président Pr Cordier Geneviève -Rapporteur Dr Schmitt-Verhulst Anne-Marie -Examinateur Dr Aubert Denise -Examinateur   Laboratoire EPHE "Interactions cellulaires, rétrovirus et cancer" IFR 128 Biosciences Lyon-Gerland UMR 754 INRA-ENVL-UCBL" Rétrovirus et pathologie comparée", 50 avenue Tony Garnier, 69366 Lyon cedex 07 Directeur : Pr Geneviève Cordier (gcordier@lyon1-univ.fr)   Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy CNRS INSERM Université de la Méditerranée Parc Scientifique et Technologique de Luminy Case 906, 13288 Marseille Cedex 9 Directeur de stage: Dr Anne-Marie Schmitt-Verhulst (verhulst@ciml.univ-mrs.fr )    DÉVELOPPEMENT D’UN MODÈLE MURIN DE MÉLANOME INDUCTIBLE EXPRIMANT UN ANTIGÈNE TUMORAL DÉFINI ET CARACTÉRISATION IMMUNOLOGIQUE
 
Présenté par Else Marit INDERBERG-SUSO  RÉSUMÉ L’immunothérapie est une approche attractive pour le traitement des cancers, en particulier le mélanome. Des études pré-cliniques dépendent normalement de modèles où des cellules tumorales cultivées in vitro sont injectées dans des souris syngéniques. Cependant, ces modèles ne récapitulent pas les interactions hôte-tumeur de long terme. Notre modèle de mélanome inductible, se rapproche plus à ce qui se passe chez le patient. Suite à un traitement par 4-hydroxy-tamoxifène, la recombinase Cre est activée et induit la perte du gène Ink4a/Arf et l’activation de la voie Ras, deux événements fréquemment observés dans le mélanome chez l’homme. La recombinaison induite par Cre, entraine l’expression de P1A, un gène codant pour un antigène tumoral bien caractérisé et reconnu par des lymphocytes T cytotoxiques dans le contexte d’une molécule CMH classe I, H-2L d . Nous avons transféré tous nos transgènes sur le fond génétique de la souche B10.D2 possédant cette molécule CMH. Nous nous sommes servis de ce modèle pour étudier le développement tumoral ainsi que la réponse immunitaire de la souris à l’aide de cellules possédant un TCR spécifique pour P1A et des tétramères qui reconnaissent ces cellules. Dans un premier temps, nos résultats induiquent que dans l’absence ou au stade précoce du mélanome, l’expression de P1A dans les mélanocytes n’induit pas de réponse immunitaire, mais l’antigène est ignoré. En effet, les cellules T spécifiques pour P1A ignorant l’antigène semblent garder la capicité d’être activées ex vivo  par des lignées tumorales exprimant P1A. Nous avons également pu montrer que dans une souris présentant un mélanome d’une taille importante, le mélanome est capable d’activer des cellules T spécifiques pour P1A in vivo et in vitro. Dans un deuxième temps, nous avons généré une souche de souris inductible pour la délétion du gène P1A. Cette souche a été croisée avec une souche exprimant la recombinase Cre de façon ubiquitaire, et nous avons caractérisé la souris obtenue déficiente de P1A. Cette dernière souche a un phénotype normal et est fertile. Cette souche pourrait servir à des études visant à comprendre les mécanismes de tolérance immunitaire qui diminuent l’immunogénicité des tumeurs exprimant des antigènes codés par des gènes de types « cancer germline ». Notre modèle de mélanome inductible serait donc utile dans la caractérisation des interactions entre le système immunitaire et une tumeur se développant naturellement dans l’hôte, ainsi que pour optimiser des traitements immunothérapeutiques ciblant un antigène tumoral défini.  MOTS-CLES: mélanome, P1A, Ink4a/Arf, Ras, Cre/loxP, tolérance, immunothérapie, gènes « cancer germline »        TABLE DES MATIÉRES  LISTE D’ABBRÉVIATIONS vi   1                INTRODUCTION  1.1 Le mélanome 1 1.1.1 Incidence 1 1.1.2 Pathologie 2
1.1.3 Traitement 3 1.1.4 Facteurs de risque 3 1.1.5 Antigènes tumoraux 4  1.2 Réponses immunitaires 6 1.2.1 Immunosurveillance 6 1.2.2 Lymphocytes T 8 1.2.3 Lymphocytes T régulateurs 13  1.3 Gènes impliqués dans les cancers 15 1.3.1 Oncogène Ras 16 1.3.2 Ink4a/Arf 18  1.4 Modèles murins de mélanome 22  1.5 Objectifs de l’étude 24  1.6 Notre modèle 25             LISTE D’ABBRÉVIATIONS  AAT antigènes associés aux tumeurs Arf alternative reading frame pb paires de bases CDK4 kinase dépendant de cycline 4 CFSE 5-(and 6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester CMH complexe majeure d’histocompatibilité Cre-ER Δ D  Cre fusionné au domaine d’association du ligand du récepteur muté d’œstrogène CTL lymphocyte T cytotoxique CPA cellules présentatrices d’antigène DC cellules dendritiques DCre souche Cre-deleter Del (ou -) délété DMBA 9, 10-dimethyl-1, 2-benzanthracene DMSO dimethyl sulfoxide EDTA ethylenediaminetetraacetic acide EGF epidermal growth factor ERK extracellular signal-regulated kinases ES cellule souche embryonnaire Flox (ou F) flanqué par des sites lox P GAP GTPase activating proteins GEF guanine nucleotide exchange factors GITR glucocorticoid-induced tumour necrosis factor receptor GST gènes suppresseurs de tumeur H-Ras Harvey-Ras Hsp90 heat shock protein 90 IL-2 interleukin-2 IL-10 interleukin-10 INF-γ  interferon-gamma IRES internal ribosomal entry site kb kilobase
k/o knockout MAGE antigène de mélanome MAPK protéine kinase activée par mitogène MART 1 antigène de mélanome reconnu par des cellules T 1 MC1R melanocortin 1 receptor NKT cellules Natural Killer T iTreg cellules T régulatrices induites nTreg cellules T régulatrices naturelles 4-OHT 4-hydroxy tamoxifène P-I3Kinase phosphatidylinositol-3-kinase PCR polymerase chain reaction RAG-1 recombination-activating-gene-1 Rb rétinoblastome RTK récepteur de tyrosine kinase SH2 sequence homology 2 SOS son of sevenless SV40 simian virus 40 TCR récepteur de cellules T TEC cellules épitheliales du thymus TGF-b tumour growth factor-beta    TNF-a tumor necrosis factor-alpha UV ultraviolet VEGF vascular endothelial growth factor      1 INTRODUCTION 1.1 Le mélanome  Le mélanome est une tumeur maligne qui se développe à partir de cellules de la peau, les mélanocytes. Les mélanocytes sont des cellules d’origine neuro-ectodermique qu’on trouve au niveau de l’épiderme mais aussi dans d’autres localisations anatomiques comme l’uvée de l’œil ou les méninges. Leur fonction principale est de produire du pigment mélanocytaire. Le mélanome peut se développer dans n’importe quelle zone comportant des mélanocytes, mais environ 90% des tumeurs développées sont des tumeurs cutanées dont les cancers les plus fréquents et les moins graves sont les carcinomes baso-cellulaires et épidermoïdes représentant plus de 90% de ceux-ci. Le mélanome est la plus grave des tumeurs cutanées notamment en raison de son pouvoir métastasant. Le terme mélanome désigne toujours une tumeur maligne, opposant le terme naevus qui est une tumeur mélanocytaire bénigne.  1.1.1 Incidence Le mélanome est un cancer plus rare qui touche le plus fréquemment des sujets de 40 à 50 ans et exceptionnellement des enfants. En France, 4 à 5 mille nouveaux cas de mélanomes sont diagnostiqués chaque année, et cette maladie est responsable de plus de mille décès (Source: FNCLCC et ANAES,http://www.sante.gouv.fr/htm/actu/melanome). En Europe, on observe un gradient nord-sud, avec une incidence plus élevée dans les zones où vit une population à peau claire. L’incidence dépend de la pigmentation de la population ainsi que des habitudes d’exposition solaire (de Vries et al, 2003). Dans le monde, 2 à 3 millions de cancers cutanés, et au moins 132 000 mélanomes malins sont diagnostiqués chaque année, avec une forte
augmentation depuis les années soixante-dix. L’incidence chez les Américains du Nord est un sur cinq et un Australien sur deux va développer une forme de cancer de la peau durant leur vie. Il y a des plus en plus de cancer de la peau diagnostiqué, mais le taux de mortalité reste stable d’où un certain optimisme (Source: WHO, http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs261/en).  1.1. 2 Pathologie Les mélanomes sont classifiés histologiquement en raison de  leur localisation et de leur stade de progression. (Clarck, 1991). Les critères de ces cinq stades histologiques sont 1) des nevi congénitaux sans changement dysplasique, 2) Des nevi dysplasiques avec changements de structure et d’architecture, 3) Mélanome en phase de croissance radiale, 4) Mélanome en phase de croissance verticale, et 5) Mélanome métastasiant. Les nevi bénins et dysplasiques sont présumés être le stade précoce du mélanome et sont caractérisés par un nombre élevé de mélanocytes et une réduction du nombre de kératinocytes confinés à la jonction derme-épiderme de la peau. Ces lésions peuvent progresser pour devenir des mélanomes en phase de croissance radiale, toujours avec une croissance latérale et confinés à l’épiderme. La progression en phase de croissance verticale est caractérisée par l’invasion des cellules tumorales du derme et le tissu sous-cutané en traversant la jonction derme-épiderme. Cette transition de croissance radiale à une croissance verticale, est un stade crucial dans l’évolution du mélanome car les cellules acquièrent un potentiel métastasiant et le pronostic clinique est mauvais. Ceci est confirmé par les caractéristiques histologiques où la croissance des cellules de mélanome en phase de croissance radiale reste dépendante d’ancrage et des facteurs de croissance exogènes fournis par les kératinocytes. En revanche, les cellules de mélanome en phase de croissance verticale ne sont plus sous le contrôle des kératinocytes et leur croissance est indépendante de facteurs de croissance et d’ancrage. Ces cellules sont tumorigènes chez les animaux et très métastatiques chez le patient et les animaux d’expérimentation (Hsu et al, 2002).  1.1.3 Traitement Le traitement des formes diagnostiquées précocement permet la guérison, lorsque la tumeur n’est pas trop épaisse et que son développement reste sans métastase. L’objectif du traitement est la guérison par l’éradication chirurgicale de la lésion, avant la dissémination. Le mélanome ayant un très grand potentiel métastatique, des récidives tardives (après plus de dix ans) sont possibles suite à une ablation. Chez les patients en phase métastatique un traitement chirurgical complémentaire ou la chimiothérapie est indiquée (Source: FNCLCC et ANAES, http://www.sante.gouv.fr/htm/actu/melanome). Des patients ayant des métastases à distance ont peu d’espoir de guérison avec une survie moyenne de 6-10 mois et moins de 5% de survie plus de 5 ans (Tsao et al, 2004). A ce jour, aucune thérapeutique n’a démontré d’efficacité sur la survie globale, ce qui renforce le besoin de développer les mesures préventives et l’incitation au diagnostic précoce.  1.1.4 Facteurs de risque Le facteur de risque principal est l’exposition solaire excessive, surtout intense et intermittente dans l’enfance, particulièrement chez les sujets à peau claire. Cependant, ce cancer touche aussi des sujets à peau noire ou pigmentée, essentiellement sur les paumes et les plantes des pieds. Des facteurs génétiques jouent aussi un rôle dans le développement du mélanome. Dans le mélanome familial, il y a aussi deux gènes de susceptibilité, Ink4a/Arf (CDKN2A) et CDK4 (Kinase Dépendant de Cycline 4) (Tucker et al, 2003) qui seront discutés plus tard. Des variations dans d’autres gènes tels que MC1R (une hormone stimulant les mélanocytes), sont associés à un risque élevé de mélanome concerne en particulier MC1R. MC1R et d’autres gènes de pigmentation sont étudiés dans les familles à risque et dans des plus grandes populations pour les études épidémiologiques (Hayward et al, 2003) et MC1R a aussi été associée à un risque élevé de mélanome chez les personnes à peau plus pigmentée (Palmer et al, 2000). Il reste à comprendre les interactions de facteurs de risques génétiques et environnementaux : peau/cheveux pigmentation/sensibilité au soleil avec des expositions différentes au soleil et aux rayons UV (Tucker et al, 2003).  
1.1.5 Antigènes tumoraux Une réponse immunitaire spécifique nécessite la présence d’antigènes capables d’être reconnus comme étrangers par le système immunitaire. Les cellules cancéreuses sont des cellules normales transformées et ont donc peu de différences avec les cellules normales. Cependant, elles expriment souvent des antigènes associés aux tumeurs (AAT) qui peuvent être reconnus par des cellules effectrices du système immunitaire. Les antigènes peuvent être des protéines de surface, des sucres, des peptides ou des éléments solubles qui peuvent avoir plusieurs origines ; une origine infectieuse, des mutations, des dérégulations quantitatives ou qualitatives. Leur statut immunologique peut être très différent. Il  peut s’agir de véritables néo-antigènes, des antigènes de virus transformants ou des antigènes de mutations, certaines combinaisons de sucres, ou il peut s’agir d’antigènes pourtant exprimés dans l’organisme, mais jusqu’alors ignoré par le système immunitaire. Ces derniers ont pu être exprimés pendant l’embryogenèse, pendant la différenciation tissulaire, ou dans des organes privilégiés, ou avoir eu un très faible niveau d’expression normale. Les antigènes peuvent aussi être le résultat de mutations ; la mutation d’un antigène codé par un gène exprimé de façon ubiquitaire qui est muté dans la tumeur génère un nouvel épitope, ou il peut s’agir de protéines codées par des gènes qui sont surexprimés dans les tumeurs et qui sont donc semi spécifiques de la tumeur. Des antigènes dérivant de virus oncogènes ainsi que des protéines plus ou moins glycosylées sont également aussi des antigènes tumoraux potentiels. Parmi ces gènes, la famille des gènes MAGE est intéressante d’un point de vue immunothérapique car les antigènes sont exprimés dans des tumeurs différentes telle que le mélanome, le carcinome du poumon, et le sarcome de la vessie. De plus, les antigènes MAGE sont spécifiques aux tumeurs car ces gènes ne sont pas exprimés dans le tissu normal sauf dans les cellules germinales chez le mâle, qui expriment le gène, mais qui n’expriment pas les molécules CMH classe I nécessaire à la présentation de l’antigène à la surface cellulaire. (Boon et al, 1994 ).  L’expression d’un ou plusieurs gènes membres de la famille MAGE est observé dans 75% des mélanomes chez l’homme. Plusieurs essais cliniques d’immunisation contre ces antigènes ont montré que ce traitement peut être cliniquement bénéfique aux patients avec des mélanomes (Coulie, 2002). Dans le modèle murin, nous avons choisi l’antigène murin P815AB, codé par le gène P1A dont le profil d’expression tissulaire ressemble à celui des antigènes MAGES chez l’homme (Van den Eynde et al, 1991). Le peptide antigénique P815AB est localisé aux acides aminés 35-43 de la protéine P1A et est reconnu par des CTL dans le contexte de la molécule de classe I du CMH L d (Van den Eynde et al, 1994). La réponse immunitaire à P1A est suffisante pour permettre le rejet tumoral du mastocytome P815 dans une souris pré immunisée par P1A (Brändle et al, 1998). L’utilisation des souris transgénique pour le récepteur du TCR (Récepteur de Cellules T) spécifique à P1A (dorénavant appelées souris TCRP1A) fait de P1A une cible idéale pour étudier la réponse immunitaire à cet antigène de type MAGE dans notre modèle murin de mélanome spontané.  1.2 Réponses immunitaires  1.2.1 Immunosurveillance Afin de développer une réponse anti-tumorale efficace, il faut comprendre pourquoi, initialement, le système immunitaire est le plus souvent incapable de détecter des cellules transformées et devient ensuite tolérant à la croissance et aux métastases tumorales. La présentation antigénique non efficace limite la réponse immunitaire adaptative, ce qui peut être le résultat d’un échec du système immunitaire inné dans la perception de la tumeur comme un danger. La théorie de la surveillance immunitaire des tumeurs, basée sur les premières expériences de W. Coley en 1893 avec des extraits de bactéries pyrogènes, a été élaborée par Burnet et Thomas en 1957 et 1967 (Ada, 1999). La notion de surveillance immunitaire a été réactualisée chaque fois qu’il y a eu des progrès majeurs en immunologie. Cette théorie est soutenue par des observations cliniques et expérimentales. Telle que le fait qu’un nombre élevé de cancers est observé chez des patients immunodéprimés ou que leur incidence est plus élevée chez les sujets transplantés ayant reçu de la ciclosporine ou d’autres immunosuppresseurs. Le développement tumoral est aussi facilité chez des animaux immunodéficients (Shankarran et al, 2004). Ils ont démontré que suite à un traitement par
un carcinogène chimique, les souris immunodéficientes développaient plus de tumeurs que les souris sauvages. Les cellules T, NKT (Natural Killer T) et les cellules B sont donc essentielles pour l’inhibition du développement tumoral et le système immunitaire dépend des actions d’IFN-γ dirigé à l’immunogénicité de la tumeur. Leurs expériences montraient aussi que les tumeurs se développant dans un hôte immunocompetent sont moins immunogéniques que celles venant d’un hôte immunodéficients. Les actions du système immunitaire induisent donc la croissance des tumeurs capables d’échapper à sa détection. Ces observations ont conduit à la théorie de la surveillance immunitaire qui suppose que des néo-antigènes sont exprimés par des cellules tumorales après une ou plusieurs mutations oncogéniques. Ces antigènes sont reconnus par le système immunitaire de l’hôte qui, peut alors rejeter la cellule mutée. La tumeur pourrait échapper au système immunitaire ou se développer si la réactivité du système immunitaire est réduite, surtout aux âges extrêmes de la vie ou dans des situations d’immunodépression induite. Plusieurs observations confirment aussi l’existence des lymphocytes spécifiques aux tumeurs : Si une souris est immunisée par l’injection de cellules tumorales, le transfert adoptif de lymphocytes T de cette souris dans une nouvelle souris transmet une protection contre la tumeur de ce même type. La première expérience de vaccination contre les cellules tumorales remonte à 1953. (Foley et al, 1953). Depuis, de nombreuses expériences ont été menées chez la souris, certaines suivies par des essais cliniques chez l’homme, avec des résultats souvent spectaculaires chez la souris, mais généralement moins démonstratifs chez l’homme. Cependant, avec la vaccination des patients porteurs de mélanomes métastasiques exprimant des antigènes associés aux tumeurs (AAT) tels que les antigènes « cancer germline genes » comme P1A, il y une régression tumorale dans 10-20% des cas (Coulie et al, 2002). Cependant, cette immuno-surveillance est souvent insuffisante et la question se pose de comprendre pourquoi les antigènes tumoraux sont peu ou mal reconnus. Parmi les antigènes tumoraux, certains sont : -       des néo-antigènes (provenant par exemple de protéines ou d’oncogènes mutés) -       des antigènes normalement exprimés à un certain stade de développement et dérégulés et exprimés fortement lors de la « tumorisation » tels que P1A/MAGE -       d’autres proviennent de protéines surexprimées lors du développement de la tumeur (Tyrosinase) Certains devraient être reconnus comme étrangers (par exemple oncogènes mutés) et ne le sont pas. Dans le modèle de reconnaissance des antigènes du « soi » et étrangers (« non-soi »), la reconnaissance des nouveaux épitopes dépend d’une inflammation associée (modèle du danger, présenté par P. Matzinger). Dans le cas de croissance tumorale, si la tumeur se développe en absence de processus inflammatoire, les néo-antigènes ou l’antigène surexprimé est ignoré par le système immunitaire.  1.2.2       Lymphocytes T La question de la discrimination entre le « soi » et « non soi » est une des plus fondamentales dans l’immunologie. La sélection positive des lymphocytes T dans le thymus implique une reconnaissance du « soi », constitué de peptides sélectionnés et présentés par des molécules CMH (Complexe Majeure d’Histocompatibilité) de l’individu et contribue à façonner un répertoire T « utile ». Les peptides rares du « soi » sont ignorés et appartiennent donc au « non soi ». Tout ce qui reconnaît le « soi » serait éliminé, physiquement par l’apoptose ou fonctionnellement par l’anergie. Ceci est l’essence de la théorie de la sélection clonale de Burnet (Foley et al, 1953). Cependant, elle n’explique pas les cas de tolérance dominante et ne laisse pas de place à l’auto réactivité physiologique Dans le thymus, une reconnaissance de forte avidité entraîne l’apoptose ou une anergie profonde. Une reconnaissance de moyenne avidité pourrait faire émerger un phénotype « régulateur ». Dans la périphérie, la plupart des cellules T ne survivent pas en l’absence de CMH et continuent donc à reconnaître le « soi ». Ici, une reconnaissance de forte avidité entraîne soit l’activation de la cellule T si d’autres signaux sont présents conjointement, soit la tolérisation de la cellule T si ces signaux sont
absents. Le nombre de cellules T différentes chez l’homme et la souris (3.10 7 et 2.10 6 environ) est insuffisant pour couvrir l’ensemble des peptides étrangers. Cependant, il est rare d’identifier un « trou » dans le répertoire T, duquel la spécificité est remarquable grâce à des ajustements successifs et à l’intégration des signaux différents. Le récepteur des cellules T (TCR) reconnaît des complexes de peptides dérivés de pathogènes associés aux molécules de CMH sur la surface de la cellule cible. Il existe deux classes de molécules CMH: CMH classe I qui s’associe aux peptides dérivés des protéines synthétisées et dégradées dans le cytosol et CMH classe II qui s’associe aux peptides dérivés des protéines dégradées dans les vésicules endocytiques. En plus de la reconnaissance des molécules CMH par des TCRs, ces molécules sont aussi reconnues par des molécules co-réceptrices CD4 et CD8, qui caractérisent les deux sous population majeures des cellules T. Les cellules T CD8+ reconnaissent les complexes de CMH classe I - peptide et sont activées pour tuer les cellules présentant des peptides étrangers dérivés de pathogènes cytosoliques comme les virus. Les cellules T CD4+ reconnaissent les complexes de CMH classe II - peptide et sont spécialisées pour activer d’autres cellules effectrices du système immunitaire, par exemples des cellules B et des macrophages, contre les antigènes étrangers ou les pathogènes qu’elles ont absorbés. Les deux classes de molécules CMH livrent donc des peptides de compartiments cellulaires différent à la surface cellulaire où ils sont reconnus par des cellules T différentes qui effectuent leurs actions appropriées. Le CMH classe II est exprimé par les CPA comme les cellules dendritiques (DC), les lymphocytes B, et les cellules épithéliales thymiques, tandis que le CMH classe I est exprimé par la majorité des cellules nucléées de l’organisme. La fréquence des précurseurs d’une cellule T spécifique pour un antigène donné est très limitée dans une souris naïve. Afin de pourvoir suivre le développement tumoral dans notre modèle inductible, analyser des réponses immunitaires à la tumeur et l’état d’activation des cellules T CD8+ spécifiques pour l’AAT P1A, nous utilisons donc des cellules présentant un TCR spécifique pour P1A obtenues à partir des souris transgéniques (appelées souris TCR P1A+). Comme l’expression des chaînes TCR inhibe le réarrangement continu des loci TCR, le TCR codé par le transgène est exprimé par la majorité des cellules T dans la souris transgénique, au moins avant les influences sélectives sur le répertoire (Uematsu et al, 1988). Afin de tracer ces cellules transgéniques pour un TCR spécifique, nous pourrons utiliser des tétramères CMH. Des tétramères CMH sont des complexes de quatre molécules CMH (dans notre cas H2-L d ) qui sont associées à un peptide spécifique (dans notre cas P1A) et conjugés à un fluorochrome. Ces complexes s’associent à un TCR distinct sur une sous population de cellules T CD8+, et peuvent être utilisés afin de détecter toutes les cellules T spécifiques pour un peptide et son allèle CMH associé. Nous pourrons donc mesurer la réponse cellulaire contre un peptide spécifique. D’après la vue conventionnelle de l’immunité adaptative, les signaux émis par les cellules transformées peuvent activer des cellules présentatrices d’antigène (CPA) L’importance de cette étape est soulignée dans le modèle de danger de Matzinger (Matzinger et al, 1994) où le sytème immunitaire utilise les CPA « professionnelles » pour détecter du danger dans les tissus. Une fois activées, les cellules dendritiques induisent et contrôlent la réponse immunitaire dirigée vers l’antigène tumoral. Par exemples, des AAT comme MAGE 1 (Melanoma Antigen 1) et MART 1 (Melanoma Antigen Recognized by T cells 1), exprimés sur des mélanomes humains, sont absorbés par des cellules Langerhans de la peau qui deviennent activées, exprimant des molécules co-stimulatrices, et qui migrent dans les ganglions drainant la peau pour induire une réponse des lymphocytes T. Il existe plusieurs mécanismes permettant aux cellules tumorales d’échapper au système immunitaire : diminution de l’expression des molécules CMH I, diminution de l’expression de leurs antigènes tumoraux, production ou induction de la production des molécules immunosuppressives comme TGF-b (Tumour Growth Factor Beta), VEGF (Vascular Epidermal Growth Factor), IL-10 (Interleukin-10), et l’ Oxide Nitrique, résistance à l’apoptose, et l’induction d’anergie. Un des mécanismes d’induction d’anergie est par des lymphocytes T régulateurs: Le système immunitaire d’un organisme doit maintenir un équilibre entre la réponse aux agents inféctieux et la maintenance de la tolérance au « soi ». L’autoréactivité est régulée par des sous-populations de
leukocytes, dont en particulier les lymphocytes T CD4+ CD25+ dérivés du thymus appelés T reg naturelles (nTreg). Le mécanisme exact de régulation n’est pas encore connu, mais il semble requérir un contact cellule-cellule et peut impliquer une lyse d’effecteurs cytotoxique et l’induction d’autres cellules régulatrices, la diminution de la fonction CPA (Cellules Présentatrices d’Antigène) et la transduction de signaux suppressifs par des molécules B7 sur des cellules T cibles. La fonction régulatrice peut aussi être induite (iTreg) dans des lymphocytes T périphériques par de nombreux facteurs environnementaux. Ces cellules régulatrices sont appelées Tr1 et Th3 et sont CD4+ CD25-. Contrairement aux cellules régulatrices CD4+ CD25+ dérivées du thymus, ces dernières exercent leur suppression par des voies dépendantes de cytokines. (Berthelot et al, 2004). Les Tr1 sont suppressives surtout par leur production d’IL-10, tandis que les Th3 produisent du TGF-b. Fontenot et al ont montré que le facteur de transcription Foxp3 uniquement exprimé dans les cellules T α  β est un marqueur spécifique aux cellules T régulatrices. Dans les ganglions, la majorité des cellules exprimant Foxp3 expriment aussi CD4+. Par contre, il y avait deux populations de cellules CD4+, Foxp3+ exprimant ou non CD25 qui étaient capables de supprimer la prolifération de cellules CD4+ in vitro. Les souris déficientes de Foxp3 développaient aussi une maladie    lymphoproliférative. Ces résultats suggèrent que Foxp3 serait un meilleur marqueur de cellules T régulatrices que CD25 (Fontenot et al, 2005). Dans le cas où CD25 (la chaîne alpha du récepteur d’IL-2) est toujours le marqueur de surface qui distingue les cellules T régulatrices d’origine thymique, CD25 est aussi exprimé par des cellules T périphériques activées. Par contre, à l’inverse des cellules T activées, les cellules T régulatrices ne produisent pas d’IL-2 elles mêmes et dépendent d’IL-2 produite par d’autres cellules. Il y a un besoin important de trouver de nouveaux marqueurs de surface plus spécifiques que CD25 afin de distinguer les cellules T régulatrices des cellules T activées. Les marqueurs comme GITR (Glucocorticoid-Induced Tumour necrosis factor Receptor), CTLA-4 (CD152), CD38, CD62L, OX-40L et d'autres molécules de surfaces sont étudiées, mais ne sont pas non plus exclusives aux cellules régulatrices.  1.3 Gènes impliqués dans les cancers Les cancers constituent la classe la plus importante des maladies génétiques acquises. Les altérations génétiques sont de deux types majeurs : Les gènes suppresseurs de tumeur (GST) dirigent des activités cellulaires différentes comme l’arrêt du cycle cellulaire en cas de mutations, détection et réparation de dommages de l’ADN signalisation mitogénique, différenciation et migration cellulaire. Les gènes suppresseurs de tumeur sont récessifs et sont inactivés sur les deux allèles avant de perdre leur fonction. Donc, l’héritage d’un allèle muté augmente déjà la susceptibilité tumorale. Les mêmes gènes sont aussi souvent mutés dans des cancers sporadiques. La transformation des mélanocytes requiert ainsi que la perte des gènes suppresseurs de tumeur, aussi l’activation des voies stimulatrices de croissance cellulaire. Plusieurs gènes impliqués dans la signalisation de facteurs de croissance sont des proto-oncogènes qui deviennent spécifiques aux tumeurs quand mutées soit par des mutation ponctuelles, des amplifications ou des translocations. Il existe trois groupes de proto-oncogènes ; des facteurs de croissance et leurs récepteurs, des molécules de signalisation et des proto-oncogènes nucléaires. L’expression sporadique d’ARNm codant des gènes type « germline cancer » a recemment été détectée dans les cellules épithéliales du thymus (TEC) (Gotter et al, 2004). L’absence de tolérance du « soi » a précédemment été attribué à l’absence de leur expression dans le thymus et le système immunitaire périphérique pour ces gènes dites spécifiques aux tissus. Les gènes type « germline cancer » sont exprimés dans les cellules germinales mâles et les antigènes de différenciation de mélanome sont exprimés dans des mélanocytes et des mélanomes. Tous les gènes testés par Gotter et al ont étaient exprimés par les TEC purifiées, à niveaux variables, mais peut-être suffisant pour induire de la tolérance dans les cellules T déjà dans le thymus. Cette expression thymique a aussi été démontré pour P1A, S100 β  et Tyrosinase par Derbinski et al (Derbinski et al, 2001).  
1.3.1 Oncogène Ras Les protéines Ras sont membres de la superfamille de Guanine nucléotide binding proteins qui contrôlent les voies de signalisation clés, y compris les voies Raf/MEK/ERK et P-I3Kinase/Akt. Ras cycle entre la forme active associée à GTP et la forme inactive, associée à GDP. Le cycle de GTPase est catalysé par les interactions de Ras avec GEFs (Guanine nucleotide exchange factors) et des GAPs (GTPase activating proteins). Les protéines Ras contrôlent plusieurs fonctions cellulaires comme la prolifération, la différenciation, et l’apoptose. Le génome humain code pour quatre isoformes de ras : H-Ras, N-Ras, et deux formes de K-Ras qui sont générés par de l’épissage alternatif du codon quatre du gène. H-ras et N-Ras sont chacun indispensables dans le développement murin. Des études de souris transgéniques ont montré que des mutations activant H-Ras dans les mélanocytes peuvent induire une prolifération aberrante (Powell et al, 1995). Le rôle de Ras dans le maintien du mélanome établi et non seulement l’induction du mélanome a aussi été montré dans un modèle transgénique où l’expression de Ras ainsi que la perte de l’expression étaient inductibles (Chin et al, 1999).  3.2 Ink4a/Arf Un des gènes suppresseur de tumeur le plus important dans le mélanome est INK4a/Arf (aussi connu comme CDKN2A) . Délétions et mutations du gène INK4a/Arf sont liés au mélanome familial et sont responsables de la susceptibilité du mélanome dans 25-40% des familles avec mélanome. Les lésions les plus courantes chez les patients avec des mélanomes sont la perte du locus INK4a/Arf trouvée dans 50% des mélanomes chez l’homme, et la mutation de l’oncogène B-RAF, vue dans 60% des mélanomes en culture (Flores et al, 1996, Daniotti M, 2004, Davies et al, 2002). Le gène B-RAF codant pour une kinase Sérine/Thréonine qui est activée en s’associant aux protéines RAS et qui signale par la voie de signalisation MEK/ERK en réponse à des signaux de croissance (Peyssonnaux et al, 2003). Le gène INK4a/Arf est complexe et contient deux exons alternatifs en amont, 1a et 1b, qui sont des promoteurs différents qui donnent deux transcrits alternatifs partageant les exons 2 et 3 en aval. L’exon 2 est utilisé dans des « cadres de lectures » alternatifs et donc, les produits p16 INK4a et p14 Arf sont distincts et exercent leurs fonctions par des voies différentes. Ink4a/Arf codant pour deux protéines suppresseurs de tumeur p16 Ink4a  et p14 Arf (p19 Arf chez la  souris) qui exercent leurs actions par deux voies différentes. Ink4a est un inhibiteur des CDK 4/6 (Kinases Dépendantes des Cyclines) et empêche la phosphorylation et l’activation de la protéine Rb (Rétinoblastome) ce qui arrête le cycle cellulaire (Serrano et al, 1993). Rb se lie à et inactive le facteur de transcription E2F et empêche l’entrée en phase S du cycle cellulaire. En absence de Rb, l’entrée en phase S est facilitée. Les cellules n’ont plus besoin de tous les signaux extracellulaires de croissance apportés par l’expression et l’activation du complexe cycline D/cdk 4 pour continuer. Rb hypo-phosphorylé r este en complexe avec le facteur de transcription E2F et recrue des déacetylases d’histone qui empêchent la transcription des gènes cibles et le cycle cellulaire s’arrête en G1. En absence d’inhibition, CDK4/6 forme un complexe avec cycline D qui phosphoryle Rb et des facteurs de transcription sont libérés. E2F peut alors activer des gènes nécessaires pour la progression du cycle cellulaire. Arf est un antagoniste des fonctions de Mdm2, un régulateur négatif de p53, qui induit l’arrêt du cycle cellulaire ou l’apoptose par p53. Arf est aussi impliqué avec c-myc et empêche c-myc à induire la progression non contrôlée du cycle cellulaire (Qi Y et al, 2004). Des souris déficientes en p16 Ink4a  et p14 Arf sont très susceptibles au développement tumoral spontané, en particulier des fibrosarcomes et des lymphomes de cellules B. D’autres membres de la famille INK4, comme INK4b (CDKN2B) sont localisé proche du gène INK4a/Arf et sont très homologues. p15 INK4b  inhibe aussi CDK4 et CDK6 et sa délétion est souvent observée chez les patients de mélanomes et des souris déficientes pour le gène INK4b ne sont que légèrement plus sensibles au développement tumoral que les souris sauvages (Latres et al, 2000).  
1.4 Modèles murins de mélanome La première souris Ink4a -/-Arf -/- avec les deux gènes INK4a et Arf délétés par l’ablation de l’exon 2 a été fait par Serrano et collègues (Serrano et al, 1996). La délétion de INK4a/Arf rendait leurs souris susceptibles au développement de plusieurs tumeurs, mais pas le mélanome. Par contre,  les fibroblastes embryonnaires de ces souris avaient un taux de prolifération élevé et étaient transformées par H-ras. Afin d’évaluer la contribution du gène Arf à ce phénotype, Kamijo et collègues (Kamijo et al,1997) ont créé une souris avec une délétion de l’exon 1ß, faisant une souris Arf -/- avec Ink4a intact. Ces souris montraient un phénotype très similaire aux souris Ink4a -/-Arf -/-, suggérant que Arf plutôt que Ink4a était responsable du phénotype du modèle de Serrano. Suite aux résultats de - -transformation des fibroblastes embryonnaires Ink4a / Arf -/- avec H-Ras, Chin et collègues (Chin et al, 1997) ont croisé les souris Ink4a -/-Arf -/- avec des souris transgéniques exprimant H-Ras sous le contrôle du promoteur de tyrosinase, une enzyme spécifique aux mélanocytes. La progéniture de ce croisement développait des mélanomes cutanés avec une forte pénétrance. Ces mélanomes n’étaient pas métastatiques, mais localement invasifs, ce qui indique le besoin d'une lésion génétique additionnelle afin de progresser au stade final de mélanome. Afin de compléter les études Krimpenfort et collègues (Krimpenfort et al, 2001) et Sharpeless et collègues (Sharpeless et al, 2001) ont créé des souris avec des invalidations spécifiques pour Ink4a. Le groupe de Krimpenfort a introduit un codon stop dans l’exon 2, donnant une protéine Ink4a instable, mais n’affectant pas  Arf, tandis que le groupe de Sharpeless a fait une souris avec une délétion de l’exon 1 α , affectant seulement Ink4a. Les souris des deux groupes étaient susceptibles au développement de tumeurs différentes, donc confirmant le rôle d’INK4a comme gène suppresseur de tumeur. Les deux souches de souris développaient des mélanomes spontanés, mais non fréquents. Un traitement avec des carcinogènes n’augmentait pas l’incidence de mélanome. Des fibroblastes embryonnaires de ces deux souches transfectées avec H-Ras ont été trouvés résistants à la transformation contrairement aux fibroblastes Ink4a -/-Arf -/-et aux fibroblastes Arf-/- de Serrano et Kamijo. La transformation des fibroblastes par H-Ras pourrait donc être dépendante de l’abrogation d’Arf, ainsi que la perte d’INK4a. Dans l’expérience du groupe de Krimpenfort, les souris qui avaient la mutation rendant Ink4a instable, lors de croisements avec des souris Arf hémizygotes, développaient des mélanomes desquels la pénétrance augmentaient de 8 à 50% suite à un traitement avec le carcinogène DMBA. L’effet d’haploinsuffisance d’Arf sur le fond Ink4a -/-, suggère une collaboration entre les deux voies Ink4a et Arf dans le développement de mélanome. Des expériences récentes de Sviderskaya et al (Sviderskaya et al, 2002) avec des mélanocytes murins cultivés des souris Ink4a -/-Arf -/-suggèrent qu’INK4a est impliqué dans la sénescence tandis qu’Arf est impliqué dans l’apoptose.  Le développement des stratégies d’invalidation conditionnelle, la suppression des régions de régulations utiles à la sélection des événements recombinants et l’utilisation de la recombinaison homologue pour mimer des événements cytogénétiques acquis, sont des outils indispensables dans la recherche oncologique. Les tumeurs transplantées correspondent à des stades tumoraux tardifs et pourraient avoir des niveaux variables d’expression d’AAT et d’autres molécules de surface contrôlant leurs interactions avec les tissus environnants, et ne constitue pas un modèle approprié pour la récapitulation des événements de tumorigenèse. L’injection des cellules tumorales peut aussi induire des réactions inflammatoires et générer une réponse immunitaire sur le site d’injection. Par contre, dans un modèle de tumeur inductible, la tumeur se développe plus normalement et ses interactions avec les tissus environnants sont comparables à ceux des cancers humains.  1.5 Objectifs de l’étude Notre but est de développer chez la souris un modèle de mélanome inductible par la délétion des gènes suppresseurs de tumeurs avec l’expression concomitante d’un antigène connu. De cette façon, nous pourrons suivre l’état immunologique de la souris et révéler l’existence de réponses adaptatives. Afin d’étudier l’état d’activation des cellules T spécifiques à l’AAT avant et après vaccination, nous allons utiliser des outils comme des tétramères de molécules CMH classe I. Nous pouvons aussi
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