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Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur Strasbourg I Discipline : Aspects moléculaires et cellulaires de la Biologie Mention Biologie Structurale par Muriel Uhring Contribution à l'étude structure/fonction du facteur de transcription TFIIH Soutenue publiquement le 16 décembre 2004 Membres du Jury Directeur de thèse : Dr Dino MORAS Rapporteur interne : Prof Etienne WEISS Rapporteur externe : Dr Eric LE CAM Rapporteur externe : Prof Yves MECHULAM Examinateurs : Dr Arnaud POTERSZMAN Dr Patrick SCHULTZ

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Publié le : mercredi 1 décembre 2004
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Source : scd-theses.u-strasbg.fr
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Thèse
présentée pour obtenir le grade de
Docteur de l'Université Louis Pasteur
Strasbourg I

Discipline : Aspects moléculaires et cellulaires de la Biologie
Mention Biologie Structurale

par Muriel Uhring


Contribution à l'étude structure/fonction
du facteur de transcription TFIIH

Soutenue publiquement le 16 décembre 2004

Membres du Jury

Directeur de thèse : Dr Dino MORAS
Rapporteur interne : Prof Etienne WEISS
Rapporteur externe : Dr Eric LE CAM
Rapporteur externe : Prof Yves MECHULAM
Examinateurs : Dr Arnaud POTERSZMAN
Dr Patrick SCHULTZ











à mes parents,
à Eric,






























Remerciements

Tout d’abord je veux remercier les membres du jury d’avoir bien voulu accepter
d’évaluer ce travail de thèse : le Professeur Etienne Weiss, le Docteur Eric Le Cam ainsi que
le Docteur Yves Mechulam.

Je remercie mon directeur de thèse, le Docteur Dino Moras, pour m’avoir donné
l’opportunité d’effectuer ma thèse dans un environnement scientifique et technique de qualité
au sein de son laboratoire.

Je remercie particulièrement le Docteur Arnaud Poterszman qui, tout au long de ces
années, a su me guider dans mes choix, en toute liberté et dans la bonne humeur.

Je remercie vivement le Docteur Jean-Marc Egly et toute son équipe pour le partage
et l’échange de connaissances.

Je remercie sincèrement le Docteur Patrick Schultz pour m’avoir fait découvrir avec
plaisir la microscopie électronique. Mille mercis à Corinne de m’avoir initié avec joie aux
techniques microscopiques, à Christine pour son aide précieuse à tout moment et à toute
épreuve, à Véronique pour ces belles discussions partagées, merci à toutes pour votre aide.
Merci à Bruno et Sacha notre bien-aimé suisse-américano.

Je tiens à remercier toutes les personnes des équipes communes pour leur
disponibilité, leur expertise et leur gentillesse, et particulièrement Jean-Luc et Isabelle (la
culture de cellules), Serge (les séquences), Pascal (la synthèse de peptides), Edouard et
Pascal (la synthèse d’oligonucléotides), Noëlle et Hélène (la spectrométrie de masse), Jean-
Marie (le clonage), Maité et Hélène (la bibliothèque).

Je remercie chaudement tous les acteurs de l’équipe TFIIH pour avoir instauré une
sincère camaraderie : Florence, Wassim et Marc (et pour tous les cafés partagés !)

Merci à toute l’équipe du laboratoire, pour leur aide de tous les jours : Alain,
Alexandra, Anne-Catherine, André, Bénédicte, Catherine, Christiane, Christophe, David et

Lydia, Denis, Didier, Gilbert, Isabelle, Jean, Fabrice, Luc, Marc, Natacha, Odile, Olivier,
Pierre, Sylvia, Sylvie, Raymond, Thierry, Thomas, Vincent C., Vincent D., Yann.
Merci à notre équipe voisine, James, Cyril, Liliane (pour son écoute et sa présence), Georges
(en retraite joyeuse et active), Renata (aux nombreuses qualités, culinaires, et autres).

Merci aux personnes qui ont corrigé ce manuscrit ou qui ont participé, même indirectement, à
son avancement.

De manière générale, je remercie tout le personnel de l’IGBMC qui regorge de personnalités
talentueuses et enthousiasmantes.

Inciter les jeunes filles à s’engager dans des carrières scientifiques et techniques, promouvoir
l’image de la science chez les femmes et l’image des femmes dans les sciences, c’est à travers
l’association « Femmes et Sciences » que je m’y suis engagée.

Merci à l’Association de la Recherche contre le Cancer qui m’a en partie financée au cours
de mes études doctorales.

Merci à tous mes amis, qui m’ont entourée pendant la rédaction de ce manuscrit, bercée par
mes airs d’opéra préférés. Merci à mes amis d’enfance, Nicolas, Christian, Jean-David, Vali
et Christian. Merci à Brat, Sandrine et Véronique. Merci à Isabelle, Grace et Sylvie. Pour
répondre à leurs curiosités scientifiques, ils trouveront en fin de manuscrit un aperçu plus
éthéré...

Merci de tout cœur à ma famille, à mon frère, Frédéric et à ma belle sœur, Betty, à
Adalric et Louise, à mes beaux-parents Yolande et Jean-Marie. Merci à Raymond.

Et je veux plus que jamais remercier ma tendre moitié, Eric, pour sa patience, son
soutien continuel et avec qui je me réjouis de partager ma vie.

Comment remercier comme ils le méritent mes chers parents, sans qui rien ne serait…
« La bonté de mon père est plus haute que la montagne, la bonté de ma mère plus profonde
que l’océan… »






















La diversité se trouve à la racine même de la biologie. Les gènes, qui constituent le
patrimoine de l’espèce, s’associent et se séparent au fil des générations, formant ces
combinaisons toujours différentes et toujours fugitives que sont les individus. C’est cette
combinaison infinie des gènes qui rend chacun de nous unique. C’est elle qui donne à l’espèce
sa richesse et sa variété.
François Jacob -Extraits-












Avant Propos


9Le génome humain, composé d’environ 3 x 10 paires de bases (pb), comprendrait
quelque 30,000 gènes répartis plus ou moins uniformément le long des 48
chromosomes (Gruetzner et al., 1999), (Venter et al., 2001), (Lander et al., 2001).
D’autres estimations soutiennent que le génome humain est plutôt composé de
50,000 à 120,000 gènes (Aparicio, 2000), (Liang et al., 2000)). Au-delà des chiffres,
une interrogation fondamentale demeure : quels sont les mécanismes qui orchestrent
l'expression de tous ces gènes? La quête de la réponse à cette question a contribué
à l’essor et au développement de la biologie cellulaire, moléculaire et structurale au
milieu du vingtième siècle et de nombreuses équipes cherchent aujourd’hui à
élucider les mystères de l’expression génique (Broder et Venter, 2000), (Bentley,
2000b).

Au cours du développement de l'embryon humain, les cellules, contenant pourtant la
même information génétique, se spécialisent et se multiplient pour former divers
organes et tissus. Comme certains gènes remplissent une fonction très spécifique, il
est impératif qu’ils soient exprimés aux moments opportuns et dans les tissus
appropriés. Sans régulation de la transcription, l'expression anarchique des gènes
nuirait vraisemblablement au maintien du métabolisme cellulaire normal et
conséquemment au développement et à la survie de l’organisme lui-même. La
régulation de l’expression des gènes apparaît donc comme un phénomène
indispensable à la vie. Les cellules sont ainsi pourvues de divers mécanismes
complexes qui assurent l’expression ordonnée de chacun de leurs gènes. Tout
dérèglement de l’un de ces mécanismes peut avoir des conséquences dramatiques
non seulement pour la cellule mais également pour l’organisme entier. Les médecins
et les biologistes du développement fondent beaucoup d’espoir sur la contribution
que pourrait apporter la compréhension de l'expression différentielle des gènes à la
lutte contre certaines maladies congénitales, au vieillissement et au cancer (Bentley,
2000a), (Warren et al., 2002).


Ainsi, les différentes étapes menant d'un gène à son produit, et plus particulièrement
la transcription, sont finement contrôlées. La cellule doit également préserver
l'intégrité de son génome. Pour cela, elle a développé différents mécanismes qui
permettent de détecter et de réparer les nombreuses lésions occasionnées à l'ADN
par des agents exogènes (rayonnements ionisants et ultraviolets, agents
cancérogènes et autres produits chimiques), mais aussi par des agents endogènes
(radicaux libres, instabilité chimique des bases). Ces deux processus fondamentaux,
transcription et réparation de l’ADN, agissent de manière coordonnée. C’est ainsi
qu'un complexe multi protéique se trouve à l’interface des deux mécanismes
cellulaires : c'est le facteur TFIIH. Ce complexe de 10 sous-unités a été initialement
associé à la transcription des gènes de classe II (Lu et al., 1992) et le clonage des
différentes sous-unités qui le composent a révélé une forte relation avec la réparation
de l’ADN par NER (Nucleotide Excision Repair) (Wang et al., 1994b), (Schaeffer et
al., 1994; Hwang et al., 1996b).

L'objet de mes études doctorales a été d'étudier les relations qui existent entre la
structure et la fonction du facteur multi protéique TFIIH portant les activités
enzymatiques hélicase et kinase. Du fait de sa grande taille et de sa complexité,
diverses approches ont été utilisées pour cette étude. Tout d'abord, l’architecture du
facteur entier a été abordée en combinant microscopie électronique et analyse
biochimique des interactions protéines-protéines. Ensuite, des études qui relèvent de
la génomique structurale, ont visé à déterminer la structure à l’échelle atomique d'un
homologue de l'hélicase humaine de TFIIH chez une archaebactérie. Finalement,
des travaux combinant données structurales et fonctionnelles, ont eu pour but de
comprendre comment TFIIH s’intègre dans des complexes physiologiques.

Abréviations

ADN acide désoxyribonucléique
ADNss acide désoxyribonucléique simple brin
ATP adénosine tri-phosphate
ARN acide ribonucléique
ARNm acide ribonucléique messager
BER réparation par excision de base
CAK kinase activant les Cdks (Cdk-activating kinase)
Cdk kinase dépendante des cyclines (cyclin-dependent kinase)
CS syndrome de Cockayne
CTD domaine carboxy-terminal de la grande sous-unité de l'ARN polymérase II
(carboxy-terminal domain)
3D trois dimensions
FTC fonction de transfert de contraste
GST glutatione S transférase
HCV virus de l'hépatite C
MAT1 ménage à trois 1
NER réparation par excision resynthèse des nucléotides
pb paire de base
PEG polyéthylène glycol
TAF facteur de classe II associé à la TBP (TBP associated factor) II
TBP protéine de liaison à la boîte TATA (TATA binding protein)
TFII facteur de transcription de classe II
TTD trichotiodystrophie
SDS sodium dodecyl sulfate
Sf9 Spodoptera frugiperda
ss Sulfolobus solfataricus
TF transformée de Fourier
UV rayonnement ultraviolet
XP Xeroderma Pigmentosum



TABLE DES MATIERES


Chapitre I : INTRODUCTION

A. Mise en situation……………………………………..…………...…………………...1
1. La chromatine……………………………………………………………………………………1
2. Le promoteur……………………………………………………………………………...……..4

B. La machinerie transcriptionnelle de base……………………………………………...6
1. Le complexe de préinitiation de la transcription……………………………………………..6
2. Assemblage du complexe de préinitiation……………………………………………………8
3. Données structurales sur la transcription……………………………………………..……10

C. La réparation de l’ADN………………………………………………………..……13
1. La réparation par excision resynthèse des nucléotides (NER)…………………………..13
2. Les étapes du NER……………………………………………………………………………14
3. Données structurales sur la réparation de l'ADN par NER………………………..……...16

D. Le facteur de transcription TFIIH…………………………………………………..17
1. Présentation du facteur TFIIH………………………………………………………………..17
2. Les sous-unités de TFIIH…………………………………………………………………….19
2.1 Les sous-unités du core…………………………………………………………….....19
2.2. Les sous-unités du CAK…………….………………………………………………...21
2.3. La dixième sous-unité TTD-A/p8……………………………...……………………..23
3. Données structurales sur TFIIH…………………………………………………………….24
4. TFIIH, un facteur aux interacteurs multiples………………………………………………25
5. TFIIH à l’interface entre réparation et transcription de l’ADN……………………………28

E. Synthèse Médecine et Sciences « Les hélicases et les maladies associées : Quand la
double hélice ne s’ouvre plus »…………………………………………………………………29





Chapitre II : ORGANISATION QUATERNAIRE DE TFIIH

I. La microscopie électronique

A. Généralités sur la microscopie………………………………………………………...32
1. Coloration négative……………………………………………………………………………32
2. Cryomicroscopie………………………………………………………………………...…….34
3. Cryocoloration négative……………………………………………………………………....36
4. Coloration négative à froid……………………………………………………………………37
5. Cristaux bidimensionnels……………………………………………………………………..37

B. L’analyse d’image de molécules isolées………………………………………………38
1. Pré-traitemant des images …………………………………………………………………..39
2. Alignement en rotation et en translation…………………………………………………….39
3. Partionnement des images…………………………………………………………………..40
3.1. L’analyse factorielle des correspondances………………………………………….40
3.2. La classification hiérarchique ascendante…………………………………………..41
4. Alignement multi-références…………………………………………………………………41

C. La reconstruction tridimensionnelle d’un objet à partir de ses projections…………...43
1. Reconstruction cylindrique moyenne………………………………………………………..45
2. Méthode conique aléatoire de collection des données……………………………………45
3. Méthode des lignes communes……………………………………………………………...46

D. Limitations du microscope et fonction de transfert de contraste…………………...…47

E. Mesure de la résolution des reconstructions…………………………………………50


II. Etude du facteur TFIIH par microscopie électronique

……………………………………………………………………..51 A. Objectifs du travail

B. Modèle de TFIIH en microscopie par coloration négative à froid……………………..52

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