Purification et activités de méroterpènes isolés de l'ascidie Aplidium aff. densum

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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par Annabel SIMON-LEVERT Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Purification et activités de méroterpènes isolés de l'ascidie Aplidium aff. densum Soutenu le 21 novembre 2003 devant le jury suivant : Mr M. Pichon Président Mme C. Coustau Examinateur Mr Y. Benyamin Examinateur Mr B. Banaigs Examinateur Centre de Phytopharmacie, Université de Perpignan 52 avenue Paul Alduy, 66860 Perpignan cedex Responsable extérieur : Mr. B. Banaigs () Laboratoire EPHE de Motilité cellulaire, Université de Montpellier Directeur EPHE : Mr. Y. Benyamin () EPHE Banque de Monographies SVT 1

  • ponte de l'oursin paracentrotus

  • tests sur le développement des œufs

  • colonisation par les bactéries

  • ascidies

  • processus de colonisation des surfaces en milieu marin

  • œufs d'oursin

  • activité antifouling

  • identification de terpènes d'aplidium aff

  • densum ·

  • évaluation de l'activité biologique


Publié le : samedi 1 novembre 2003
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MEMOIRE
présenté par
Annabel SIMON-LEVERT
Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE  ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES  Sciences de la Vie et de la Terre             Purification et activités de méroterpènes isolés de l'ascidieAplidium aff. densum     Soutenu le 21 novembre 2003 devant le jury suivant :   Mr M. PichonPrésident Mme C. Coustau Examinateur Mr Y. BenyaminExaminateur Mr B. BanaigsExaminateur      Centre de Phytopharmacie,Université de Perpignan 52 avenue Paul Alduy, 66860 Perpignan cedex Responsable extérieur :Mr. B. Banaigsrep-rf.p)(nabas@igivun  Laboratoire EPHE de Motilité cellulaire,Université de Montpellier Directeur EPHE :Mr. Y. Benyamin(be)fron-m2.tp.tirvinumaync@ni
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERE   PURIFICATION ET ACTIVITÉS DE MÉROTERPÈNES ISOLÉS DE L'ASCIDIE APLIDIUM AFF. DENSUM  Annabel SIMON-LEVERT  Mémoire soutenu le 21 novembre 2003    RÉSUMÉ   Les premiers travaux significatifs en Chimie des Substances Naturelles Marines datent du milieu du 20ème siècle. isolées Les chercheurs, fascinés par la nouveauté des structures chimiques d'algues ou d'éponges, se sont contentés dans un premier temps de réaliser un inventaire de nouvelles molécules. Par la suite, la chimie des substances naturelles marines a évolué vers l'interface Chimie -Biologie avec l'étude des métabolites d'intérêt thérapeutique et l'écologie chimique. Le travail réalisé au Centre de Phytopharmacie (Université de Perpignan) s'inscrit dans ce contexte : purification des métabolites secondaires de l'ascidieAplidium aff. densumet évaluation de l'activité biologique de ces composés. Cinq méroterpènes, dont deux nouveaux, ont été purifiés et caractérisés par les techniques de chromatographie et de spectroscopie. L'espèce étudiée semblant efficacement protégée des prédateurs et totalement dépourvue d'épibiontes, nous avons voulu vérifier une hypothèse souvent formulée : les métabolites secondaires isolés des invertébrés marins, organismes sédentaires et sans protection physique pour la plupart, ont une fonction de défense chimique. Les méroterpènes d' Aplidium aff. densum sont modérément antibactériens et inhibent la fixation des larves de balanes ; ce sont des agents antifouling naturels. Les méroterpènes de l'ascidie aff. densum A. ayant montré des activités biologiques sur des organismes marins, nous avons étendu nos investigations à d'autres modèles biologiques présentant un intérêt en thérapeutique humaine. Afin de déterminer leur pouvoir antiprolifératif, deux types cellulaires ont été utilisés : les œufs d'oursin (Sphaerechinus granularis) et des cellules cancéreuses (lignées lymphoblastique humaine : CCRF CEM). Le potentiel antibactérien a été évalué sur deux types de bactéries pathogènes (Escherichia colietMicrococcus luteus). Trois des cinq méroterpènes présentent des activités intéressantes sur embryons précoces d'oursin. Sur lignée cellulaire lymphoblastique deux de ces trois métabolites possèdent une activité antiproliférative. Un méroterpène est faiblement bactéricide contre des bactéries gram + et - alors que deux autres sont légèrement bactériostatiques.  Mots clés : ascidie,Aplidium aff. densum, méroterpènes, activités antifouling, larves de balanes, bactéries marines, activités pharmacologiques, œuf d'oursin, cellules cancéreuses, bactéries  Table des matières :  Introduction  Chapitre 1 : Purification et caractérisation de métabolites secondaires de l'ascidieAplidium aff. densum ·  Les ascidies         
·                         Historique de la découverte des ascidies ·                         Classification ·                         Biologie des ascidies 1.3.1. Morphologie et organisation 1.3.2. Filtration de l’eau de mer : respiration et nutrition 1.3.3. Modes de reproduction          Stratégies défensives chez les ascidies · 1.5 densum. Aplidium(GIARD, 1872) ·       Extraction, purification et identification de terpènes d'Aplidium aff. densum    ·            Matériels et Méthodes              2.1.1. Extraction liquide / liquide 2.1.2. Fractionnement sur colonne de silice 2.1.3. Chromatographie Liquide Haute Performance en phase inverse 2.1.4. Identification par Résonance Magnétique Nucléaire et Spectrométrie de Masse                          Résultats et discussion · 2.2.1. Fractionnement sur colonne de silice 2.2.2. Chromatographie Liquide Haute Performance 2.2.3. Identification des composées purifiés 2.3. Conclusion  Chapitre 2 : Activités antifouling des méroterpènes d'Aplidium aff. densum ·          Mécanismes du "fouling" et produits naturels à activité antifouling ·                         Les organismes du "fouling" et les processus de colonisation des surfaces en milieu marin 1.1.1. Conditionnement biochimique 1.1.2. Colonisation par les bactéries et les champignons 1.1.3. Colonisation par les eucaryotes unicellulaires 1.1.4. Colonisation par les eucaryotes pluricellulaires                          Lutte contre l'installation du fouling · 1.2.1. Historique 1.2.2. Problèmes liés à l'utilisation du TBT ·          Tests d’inhibition de la croissance des bactéries ·                         Les bactéries marines                          Matériels et méthodes · ·                         Résultats et discussion ·          Test d’inhibition de la fixation des larves de balanes ·                         Les balanes ·              Matériel et méthodes            3.2.1. Tests d'inhibition de la fixation des cypris 3.22. Tests de toxicité sur les larves de nauplii 3.2.3. Analyse statistique ·                         Résultats et discussion Conidione Methoxyconidiol Didéhydroconicol . Épiconicol Cordiachromène A Récapitulatif  
Chapitre 3 : Activités pharmacologiques           Un modèle animal : les œufs d'oursin · ·Développement des oursins                          1.1.1. Le cycle cellulaire 1.1.2. Les échinodermes 1.1.3. Morphologie 1.1.4. Reproduction  1.1.4.1. Les gamètes  1.1.4.2. La fécondation  1.1.4.3. Le clivage  1.1.4.4. La gastrulation 1.1.5. Développement larvaire et métamorphose ·                         Matériels et méthodes 1.2.1. Tests sur le développement des embryons 1.2.2. Tests de toxicité sur le sperme d'oursin 1.2.3. Tests de toxicité sur les gamètes femelles d'oursin 1.2.4. Marquage de la tubuline et coloration de l'ADN en immunofluorescence 1.2.5. Incorporation et détection de BrdU ·                         Résultats et discussion 1.3.1. Tests sur le développement des œufs fécondés 1.3.2. Tests de toxicité sur les gamètes 1.3.3. Le méthoxyconidiol inhibe la formation du fuseau mitotique 1.3.4. Le méthoxyconidiol et la réplication de l'ADN ·          Activités antiprolifératives des cinq méroterpènes d'Aplidium aff. densum ·                         Cancer et molécules anticancéreuses 2.1.1. Régulation du cycle cellulaire et cancer 2.1.2 Agents antitumoraux et phénomènes de résistance aux agents anticancéreux 2.1.2.1. Les agents anticancéreux 2.1.2.2. Résistance aux agents anticancéreux ·            Matériels et méthodes              2.2.1. Cellules utilisées 2.2.2. Conditions de culture 2.2.3. Estimation du pouvoir antiprolifératif des molécules ·                         Résultats et discussion ·          Activités antibiotiques ·    Bactéries et antibiotiques 3.1.1 Anatomie bactérienne 3.1.2. Les antibiotiques     Matériels et méthode · 3.2.1. Bactéries utilisées 3.2.2. Protocole ·    Résultats et discussion  Conclusion et perspectives  Références bibliographiques  LISTE DES ONTIIAÉVARBS
AcOEt: Acétate d'éthyle ADN: Acide Desoxyribonucléique Ara A :Arabinosyl Adénine Ara C :Arabinosyl Cystéine ARN :Acide Ribonucléique ATP :Adénosine Triphosphaté ATA: 3-amino-1,2,4 - triazole  BrdU: Bromodeoxyuridine BSA :Bovine Serum Albumine CCM :Chromatographie sur Couche Mince CFB :Cytophagales Flavobacterium Bacteroides CH2Cl2 : Dichlorométhane CL50 :Concentration Létale 50% CLHP: Chromatographie Liquide Haute Performance CMB: Concentration Minimale Bactéricide CMI: Concentration Minimale Inhibitrice CO2: dioxyde de carbone CPMM :Comité de la Protection du Milieu Maritime DAPI: 4,6,Diaminp, 2-phenylindole dihydrochloride DDT :iDhcolorD-piéhynl-Trichloréthane DMSO: Diméthylsufoxyde DO: Densité Optique EMF :Eau de Mer Filtrée FBS: Foetal Bovine Serum (Serum de veau foetal) FITC: fluorescein 5 (6) isothioocyanate H2O: eau HCl: Acide chlorydrique HPLC: High Performance Liquid Chromatography M: Molaire MDR :Multi Drug Resistance MeOH: Méthanol MgCl2: dichlorure de magnésium MHB :Mueller Hington Browth mM :millimolaire NaCl :Chlorure de Sodium NCLSS :National Committee of Laboratory Safety and Standards OMI :Organisation Maritime Internationale PLP :Protéine de Liaison aux Pénicillines RMN: Résonance Magnétique Nucléaire SVF :Sérum de Veau Foetal TBT :Tributyletain UV: Ultra-Violet VLB: vinblastine WT :Wild-Type   Introduction Dans le milieu marin, nombreux sont les organismes ne possédant pas d’organe de la vision, du toucher ou de l’ouïe. Pourtant, la plupart d'entre eux, se transmettent des informations de manière intra et/ou interspecifique. Ils utilisent donc un moyen de communication différent des sens caractéristiques des mammifères. Il s’agit de médiateurs chimiques par lesquels sont transmis tous les messages nécessaires à la survie et au mode de vie de l’espèce (recherche de nourriture, d’habitat, de partenaire sexuel, prévention du danger…..). Ainsi, la synchronisation de la copulation et la ponte de l'oursinParacentrotus lividus et la réception desont liées à des mécanismes basés sur la production signaux chimiques. Dans ce cas, le déclenchement de la ponte chez les individus matures est stimulé lorsque l’eau contient des spermatozoïdes (LEGAL, 1988). Dans les années 50, les éponges, invertébrés marins apparemment sans protection physique et
pourtant sans véritable prédateur, ont été étudiées par Bergmann qui a découvert que les métabolites qu'elles renferment possèdent un très grand potentiel thérapeutique (BANNERGM& FEENEY, 1951). Ces travaux ont été à l’origine dans les années 1970 de nombreuses investigations et découvertes de molécules isolées d'algues ou d'invertébrés marins, principalement d'éponges, d'ascidies ou de gorgones. C’est en effet à partir de cette période que la plongée sous marine s’est démocratisée, permettant aux chercheurs d’aller récolter directement sous l’eau les organismes. Pendant une vingtaine d’années, les scientifiques se sont contentés d'établir un « catalogue » de nouvelles molécules et ce n’est qu’à la fin des années 1980 qu'ils se sont intéressés à leurs potentiels pharmaceutiques. En 1996, Hay écrit que les invertébrés marins sont une source préférentielle de molécules à activité cytotoxique (HAY, 1996).  Citons deux médicaments particulièrement bien connus, isolés d’une éponge marine (Cryptotethia crypta), l’Ara C (Arabinosyl cytosine) et l’Ara A (BNNGRAME B &URKE, 1955). La première possède une action antiproliférative sur les leucémies myéloïdes et les lymphomes non Hodgkiniens et la seconde est un médicament antiviral utilisé notamment pour le traitement de l’Herpès.  Outre les éponges très largement étudiées, d’autres organismes marins sont sources de métabolites secondaires et notamment les ascidies. Ainsi, les acides stoloniques A et B isolés d'une ascidie récoltée dans l'Océan indienStolonica sp.sont des métabolites cytotoxiques (DAVIES-COLEMAN et alDes méthylsulfates cytotoxiques ont été isolés de l'ascidie, 2000). Halocynthia papillosa(AIELLO et al, 2000). Les pigments aromatiques, Rubrolides I à N, isolés deSynoicum blochamannipossèdent des activités cytotoxiques très élevées (ORTEGA et al de, 2000). De plus, les Rhopaladines A-D sont puissants agents antibactériens isolés deRhopalaea sp.(SATO et al, 1998). Toutes les ascidies citées ici sont donc sources de métabolites actifs et il ne s'agit que de quelques exemples parmi de nombreux autres. Les ascidies font partie du sous-embranchement des tuniciers (ou Urochordés), regroupant environ 1300 espèces appartenant à 4 classes se différenciant par leur mode de vie. Parmi celles-ci se trouve la classe des Ascidiacea, classe la plus largement représentée et à laquelle appartient l'espèce que nous avons étudiée.  Les ascidies, comme de nombreux invertébrés marins, sont des animaux fixés, souvent vivement colorés et dépourvus de carapace et de coquille. Elles ont donc besoin de se protéger d'un certain nombre d'agressions (exposition aux rayons Ultra-Violet, pression de colonisation, prédation...). Toutes les ascidies n'ont pas développé les mêmes stratégies de défense. Certaines possèdent une tunique pourvue de spicules, ce qui leur assure une protection physique. D'autres, plus fragiles, se réfugient dans des habitats comme les grottes ou les cavités. D'autres enfin, sont exposées, sans défenses physiques, possèdent une surface dépourvue d'épibiontes et semblent se développer sans craindre d’éventuels prédateurs. En fait, ces espèces sont capables de synthétiser des substances de défense. Ces mécanismes de protection mettent en jeu des métabolites secondaires à cibles souvent spécifiques. Les ascidies constituent la classe la plus productive en métabolites dérivant d'acides aminés : les alcaloïdes et les peptides (POMPONI, 1999).   C'est dans la lignée de ces études que nous avons décidé, au Centre de Phytopharmacie où j'ai effectué mon diplôme EPHE de nous intéresser à une ascidie récoltée en mer d'Oman,Aplidium aff. densum. Après avoir purifié et caractérisé plusieurs métabolites secondaires de cette espèce, nous avons évalué leurs activités biologiques pour essayer d'appréhender le rôle de ces molécules pour l'organisme producteur et pour estimer leur potentiel pharmacologique.                   Aplidium aff.densum une ascidie coloniale massive, de couleur blanchâtre; dépourvue est d'épibiontes et de trace de prédation; la présence de substances biologiquement actives dans cette espèce était donc à priori probable.
 Les bactéries sont parmi les premiers organismes colonisateurs d'une surface immergée: nous avons donc évalué l'activité antibactérienne des composés isolés sur diverses bactéries fournies par le Dr LEBARONde Banyuls sur Mer. Les bactéries ne sont pas les seuls organismes Laboratoire Arago  du responsables des salissures marines. En effet, les balanes sont des organismes fréquemment rencontrés dans les problèmes de fouling. Nous avons donc débuté une collaboration avec les Dr HELLIO et CLAREau département des sciences marines de l'Université de Newcastle en Grande-Bretagne afin de réaliser des tests d'inhibition de la fixation des larves cypris de Balanes (Balanus amphitrite). Au delà de l'aspect fondamental de l'étude de la fonction des métabolites secondaires pour l'organisme prédateur, l'enjeu de ces différents tests est de trouver de nouveaux agents antifouling d'origine naturelle. En effet, le développement d'organismes colonisateurs sur les surfaces immergées telles que les coques des navires, les installations piscicoles etc... est un réel problème économique, diminuant nettement l'efficacité des bateaux et des structures immergées.Des solutions ont rapidement été trouvées, notamment en enduisant les coques de peintures antifouling à base d'oxyde de cuivre dans les années 1970 puis de tributylétain (TBT). Cependant, la grande efficacité associée à l'utilisation à outrance de ce type de peintures a été à l'origine de perturbations très graves dans l'écosystème marin (GIBBSde trouver des solutions de remplacement s'est donc, 1993). La nécessité fait sentir et les organismes marins entre autres sont apparus comme une alternative idéale (CLARE et al, 1992 ; CLARE, 1996 ; DENYS et al, 1995 ; RITTSCHOF H, 2000 ;ELLIO et al, 2000) permettant de minimiser les conséquences sur l'environnement. Une des premières étapes lorsqu'une molécule présente un potentiel antifouling contre différents organismes colonisateurs est donc de vérifier sa non-toxicité envers les autres espèces aquatiques. Nous avons donc estimé la toxicité de chacun des métabolites sur les larves nauplii deBalanus amphitrite.   Par ailleurs, les ascidies constituent également une source importante de nouveaux métabolites secondaires à potentiel pharmacologique. Un modèle fréquemment utilisé dans l'étude du potentiel antiprolifératif des métabolites secondaires est l'œuf d'oursin. Afin de réaliser cette étude, nous avons débuté une collaboration avec le Dr GENIÈEVRE Laboratoire Arago (Banyuls au sur Mer) où nous avons réalisé des tests sur les œufs deSpaerechinus granularis, oursin de Méditerranée. Les tests ont été menés sur les gamètes mâles et femelles d'une part, pour observer la réussite de la fécondation et sur les œufs fécondés d'autre part, pour mettre en évidence une action sur la division des œufs et / ou sur le développement des embryons. Nous avons ensuite réalisé des tests sur des cellules cancéreuses humaines (CEM-WT, CEM-VLB 100 et CEM-VM1) et ce travail a été effectué en collaboration avec le Dr SALMON laboratoire de biophysique et dynamique des systèmes au intégrés, de l'Université de Perpignan.  Les produits ayant montré des activités sur les bactéries marines, nous avons voulu savoir si c'était le cas sur des terrestres et pathogènes pour l'homme. Donc, et afin de compléter la gamme de tests entrepris, nous les avons naturellement testé sur deux souches de bactéries pathogènes : Escherichia colietMicrococcus luteus.   Trois chapitres composent ce mémoire. Le premier "Purification et caractérisation de métabolites secondaires de l'ascidieAplidium aff. densum chimie effectué" est consacré au travail de surAplidium aff. densumavec l'extraction, le fractionnement , la purification et la caractérisation des métabolites secondaires. Dans le second chapitre "Activités antifouling des méroterpènes d'Aplidium aff. densum", la fonction de défense chimique de chaque  deméroterpène a été estimé par des tests toxicité sur larves nauplii de balanes, d'inhibition de croissance des bactéries marines et d'inhibition de la fixation de larves cypris de balanes. Enfin, dans le dernier chapitre "activités pharmacologiques des méroterpènesd'Aplidium aff.densum" sont évalués les potentiels pharmacologiques des produits sur différents modèles : oeufs d'oursin, cellules cancéreuses et bactéries.    
Chapitre 1 : Purification et caractérisation de métabolites secondaires de l'ascidieAplidium aff. densum  Les organismes marins étant une source importante de métabolites à potentiel pharmacologique, les éponges et les ascidies sont particulièrement étudiées au Centre de Phytopharmacie. Les ascidies sont des invertébrés marins présents dans toutes les mers et océans du globe. Elles vivent dans des profondeurs comprises entre 0 et -400 mètres, fixées sur des fonds rocheux, sableux ou vaseux ; quelques espèces ont même été retrouvées dans les abysses. Ce sont des organismes filtreurs, la densité de population dépend donc de la quantité de particules organiques en suspension. De plus, elles abritent souvent des organismes symbiotiques tels que des algues ou des protozoaires.  L'ascidie étudiée dans ce travail a été récoltée en mer d'Oman. L'extraction chimique réalisée a pour but d'étudier la composition en métabolites secondaires de cette ascidie.  1. Les ascidies  1.1. Historique de la découverte des ascidies  Les ascidies ont été mentionnées pour la première fois par Aristote qui les a décrites comme étant des mollusques sans coquille ou des coraux mous ou pierreux (MONNIOT et al, 1991). Jusqu'en 1785, leur dénomination reste ambiguë. À cette date, Linné les classe parmi les mollusques lorsque leur mode de vie est solitaire, et parmi les zoophytes lorsque celui-ci est colonial. Il faudra attendre 1816 pour que Savigny prouve définitivement leur unité de structure et crée la classe des Tunicata (BRIAN, 1948). À la fin du 19ème siècle (1866-71), le russe KOWALEVSKY les tuniciers dans la classification place animale et crée le groupe des Prochordés : en observant la larve, il se rend compte de la relation qui existait entre les Tuniciers et les Chordés.  1.2. Classification  Les ascidies appartiennent au règne animal et à l'embranchement des Chordés. Ce sont des métazoaires marins à symétrie bilatérale primitive, pourvus de cœlome (cavité limitée par un épithélium dérivé du mésoderme). Le sous-embranchement est celui des Urochordés ou Tuniciers. Ce sous-embranchement regroupe environ 1300 espèces et se décompose en 4 classes d'animaux marins présentant une notochorde (corde nerveuse dorsale vide) dans au moins une étape de leur vie.  Quatre classes distinctes ont été identifiées :  -     Ascidiacea: classe la plus largement représentée. Il s'agit de tuniciers fixés. Dans cette classe sont actuellement répertoriés 3 ordres, 19 familles, plus de 90 genres et plus de 370 espèces. -     Thaliacea leur perdent tuniciers pélagiques adaptés à la vie planctonique. Ils : appendice caudal au stade adulte. -     Appendicularia: tuniciers planctoniques et nageurs possédant une queue et une corde caudale persistantes. -     Sorberacea toujours tuniciers benthiques ou abyssaux. Cette classe n'est pas : différenciée selon les auteurs.  1.3. Biologie des ascidies  1.3.1. Morphologie et organisation  L'épiderme sécrète une tunique qui recouvre l'ensemble de son corps et qui correspond à un exosquelette flexible constitué de tunicine. Cette tunique ainsi formée assure l'ancrage de l'animal à son substrat, maintient activement la cohésion de sa structure (GRASSE et al, 1970) et assure sa
protection. Une ascidie adulte possède deux ouvertures : un siphon buccal et un siphon cloacal. (figure 1). La cavité branchiale ou pharyngienne est un sac percé de nombreuses fentes (ou stigmates), entouré d'une cavité péribranchiale communiquant avec le cloaque. Le système nerveux est rudimentaire. Les nerfs tapissent la paroi du corps et sont reliés à un unique ganglion cérébroïde situé entre les deux siphons dans la partie dorsale du manteau. Le système circulatoire n'est pas fermé. Le sang, plasma incolore ou vert très pâle, circule grâce à un organe pulsatile, le cœur, formé par un péricarde et un myocarde qui contient le sinus cardiaque. Ses contractions dirigent le flux sanguin dans des directions qui s'inversent avec une fréquence de quelques minutes (2 ou 3 minutes).  Figure 1 : Schéma de structure d'une ascidie.  1.3.2. Filtration de l’eau de mer : respiration et nutrition  La filtration de l'eau de mer, assurant les fonctions de nutrition et de respiration des ascidies, peut se résumer par le schéma suivant (figure 2) :  Figure 2 : Circuit schématique de l'eau de mer à l'intérieur d'une ascidie  1.3.3. Modes de reproduction  Les ascidies sont des animaux hermaphrodites, les organes reproducteurs sont présents simultanément dans un même individu, mais sont indépendants. On trouve, chez ces animaux, une unique gonade à gonocytes séparés. Les gonades matures sont expulsées vers la cavité péribranchiale. Si les deux organes sont matures en même temps l'autofécondation est possible (MONNIOT et al,1991). Certaines ascidies ne se reproduisent que par voie sexuée et vivent isolées. Ce sont des ascidies solitaires ovipares dont le développement des zoïdes sexués passe par un stade larvaire libre ou têtard. Ces têtards possèdent quelques caractéristiques des chordés, à savoir une métamorphose en 3 étapes succédant à la fixation précoce de l'animal : ·    régression et disparition de la queue larvaire (notochorde),     apparition et développement des organes adultes, · ·    rotation générale du corps.  Les ascidies coloniales (colonies formées de plusieurs zooïdes) sont souvent ovipares et incubent leurs œufs dans une poche incubatrice. Les larves lecitotrophes  dans le(qui ne se nourrissent pas plancton) sont souvent plus évoluées et bourgeonnent prématurément avant leur métamorphose par un processus de reproduction asexuée pour former les premiers zooïdes de la colonie.  1.4. Stratégies défensives chez les ascidies  Les ascidies ont besoin de se défendre pour assurer leur espace de colonisation (contre d'autres ascidies, éponges ou cnidaires) et contre les prédateurs car elles constituent une proie immobile donc facile, tant pour les prédateurs "généralistes" (ex: les poissons) que "spécialistes" (tels que certains plathelmintes ou nudibranches). Toutes les ascidies n'ont pas développé les mêmes stratégies de défense. Certaines possèdent une tunique pourvue de spicules, leur assurant une défense physique dissuadant les prédateurs. D'autres, plus fragiles, se réfugient dans des habitats comme les grottes ou les cavités. D'autres possèdent un pH très acide ; STOECKER (1980 hautes a) suggère même que de concentrations de vanadium peuvent être utilisées comme moyen efficace de défense. D'autres, enfin, sont exposées et possèdent une surface dépourvue d'épibiontes mais semblent se développer sans être affectées par les prédateurs. En fait, ces espèces sont capables de fabriquer des défenses chimiques. Ces mécanismes de protection mettent en jeu des métabolites secondaires à cibles spécifiques (IRELAND et al productive de métabolites, 1988). Ces organismes marins constituent la classe la plus dérivant d'acides aminés, alcaloïdes et peptides.
 1.5.Aplidium densum(GIARD, 1872)  L’Aplidiumétudiée a été récoltée par le Dr Banaigs lors de l’expédition Ardoukoba, menée en 1999. Elle a été trouvée très localement, proche de l’île de Masirah en mer d’Oman (Annexe 1 et 9), entre 3 mètres de profondeur. Son identification a été réalisée par le Dr Turon (Université de Barcelone). Il s’agit d’uneAplidium, mais elle demeure affinitédensum car elle n’a jamais été décrite en mer d’Oman et les organismes récoltés ne présentent pas d'incrustation de sable sur leur tunique, comme habituellement sur cette espèce.  CLASSEAscidiacea ORDREEnterogona FAMILLEPolyclinidacea (8 genres, 62 espèces) GENRE Aplidium(40 espèces) ESPÈCE:densum  Aplidium densum est également connue sous d’autres dénominations :Amaroucium densum (GIARD, 1872, HANRANT & VESERINRE, 1933) etAplidium proliferum (MILNE EDWARDS, 1841), mais la seule valable estAplidium densum(GIARD, 1872).  Il s’agit d’une ascidie coloniale en forme de lobes, large à sa base mais de petite taille (maximum 3 cm de haut). La tunique est transparente ou marron, de consistance gélatineuse. De plus, elle possède des incrustations de sable, d’un grain plus ou moins variable. Les zooïdes peuvent faire jusqu’à 10 mm de long (figure 3).  Figure 3 : Dessin de zooïde d'Aplidium densum (TURON, 1987)  Le siphon buccal possède 6 lobes et l’ouverture cloacale est située entre la 1èreet la 6ème rangée de fentes, elle est dotée d’un simple appendice. Les branchies sont situées entre la 9ème la 11 etème rangée de stigmates. L’estomac possède de 12 à 14 plis bien marqués. L’anus s’ouvre au niveau de la 3ème rangée de stigmates en partant de la fin. Les gonades et les larves n’ont pas de caractères spéciaux.  Il existe une certaine confusion entreAplidium densum,Aplidium nordmanni(MILNEEDWARDS, 1841) etAplidium proliferum (MILNE EDWARDS, 1841). La différence est faite sur le nombre de plis stomacaux qui est inférieur chezA. densum, même si certains auteurs proposent quand même de regrouper ces 3 espèces (THOMPSON, 1934, BERRILL, 1950 et KOTT, 1952).  Cette espèce vit dans pratiquement tous les habitats entre 4 et 50 mètres de profondeur. Elle est relativement fréquente sur le littoral catalan nord et sud (TURON, 1985), et abondante de manière plus générale dans les mers et Océans européens (BERRILL, 1950). SALDANHA(1974) en fait état au Portugal et elle est retrouvée en grande quantité autour des Iles Lede (RAMOS, 1984).  Aplidium aff. densum une espèce peu décrite dans la recherche de produits est potentiel à pharmacologique, laissant imaginer qu'elle possède des nouveaux métabolites secondaires. De plus, elle a été récoltée en grande quantité, nous avons donc pu envisager son extraction.   Chapitre 2 : activités antifouling des méroterpènes isolésd’Aplidium aff. Densum  Dès l’immersion d’une surface vivante ou non, dans l’eau de mer, un processus complexe de colonisation est initié, appelé "le fouling". Dans le milieu marin, tout substrat exposé, non défendu et persistant est colonisé par des organismes comme des bactéries, des diatomées, des protozoaires, des
algues et des invertébrés (EVANS& SMITH, 1975). Le fouling est un phénomène irréversible touchant toutes les surfaces immergées artificiellement par l’homme comme les coques de bateaux, les cages piscicoles, les quais, constructions off-shores ou encore les canalisations, provoquant parfois de graves problèmes de détérioration prématurée des installations (colmatage, obturation, freinage des engins...) mais aussi sur les rochers, les coraux, les coquilles et même sur certains mammifères marins. En s’installant sur les coques de bateaux, les organismes sont à l’origine d’un autre problème, celui de l’introduction d’espèces non indigènes et parfois nuisibles (GOLLASCH& RIEMAN-ZÜRNECK, 1996). Il est donc indispensable de protéger ces engins immergés de cet envahissement. Pour cela on utilise des peintures dites antifouling efficaces contre l’adhésion mais possédant de nombreux produits toxiques, dommageables pour l’environnement. L’enjeu est donc de découvrir de nouvelles substances possédant des propriétés antifouling mais non toxiques pour le milieu marin. Notons que nous parlerons ici du fouling en mer mais on en trouve également en eau douce, dans les lacs, les rivières, les étangs. On en parle également dans les domaines aussi variés que la dentisterie (désigne la formation de la plaque dentaire), l'ophtalmologie (lentilles de contact) ou encore la chirurgie (cathéter, pacemaker, prothèse). Dans tous ces exemples, le fouling entraîne des problèmes, mais il est limité au développement d'un film bactérien et n'est donc d'aucune mesure avec le fouling que l'on peut rencontrer en milieu marin. C'est la raison pour laquelle on ne parle de fouling en réalité lors de salissures marines. Les ascidies sont des organismes ne possédant pour la plupart, aucun organisme colonisateur sur leur surface. Ceci laisse penser qu'elles possèdent des défenses chimiques (étant donné qu'elles n'ont aucun moyen physique de défense) permettant de les protéger.Aplidium aff. densumfait partie de ces ascidies, dépourvues de colonisateurs. C'est la raison pour laquelle nous avons cherché à évaluer l'activité antifouling de chacun des terpènes isolés et décrits dans le chapitre précédent. Bien avant que des macroorganismes ne se fixent aux structures immergées, un film bactérien s'est développé à la surface de celles-ci. L'installation des bactéries constituant l'une des premières étapes du processus de colonisation, nous avons dans un premier temps évalué l'activité des produits contre des bactéries marines. Ensuite, des tests ont été réalisés contre des organismes très fréquemment rencontrés lors de problèmes liés aux salissures marines : les balanes. Pour cette étude, nous avons travaillé sur les larves cypris deBalanus amphitrite. Cette partie du travail nous a permis d'entamer une collaboration avec le Pr Clare et le Dr Hellio au laboratoire des Sciences Marines l'Université de Newcastle (Grande-Bretagne) où j'ai passé trois semaines. Enfin, et afin de compléter l'estimation de l'activité antifouling des méroterpènes, il est nécessaire d'évaluer leur toxicité. Le composé antifouling idéal aurait une action spécifique contre les organismes colonisateurs sans détruire l'ensemble de la faune et la flore qui l'entourent. Les tests de toxicité ont été réalisés sur les larves nauplii de balanes (au laboratoire des Sciences Marines de Newcastle).  1. Mécanismes du "fouling" et produits naturels à activité antifouling.  1.1. Les organismes du fouling et les processus de colonisation des surfaces en milieu marin.  EGAN(1987) et WAHL(1989) ont proposé un modèle d’installation du fouling en quatre phases (figure 13) :  ·            Conditionnement biochimique ·       Colonisation bactérienne       ·             Installation d’espèces unicellulaires ·             Installations des espèces pluricellulaires.  Figure 13 : Schéma des étapes de fixation du fouling, d'après Wahl, 1989.  1.1.1. Conditionnement biochimique
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