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Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur Strasbourg I Discipline : Sciences du vivant - Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie par Elizabet Petkovski Polymorphismes ponctuels de séquence et identification génétique Etude par spectrométrie de masse MALDI-TOF Soutenue publiquement le 10 février 2006 Membres du jury Directeur de Thèse : M. Bertrand Ludes, Professeur, Université Louis Pasteur, E.A. 3428 Rapporteur Interne : M. Jean-Marc Jeltsch, Professeur, Université Louis Pasteur, UMR 7175 Rapporteurs Externes : M. Peter M. Schneider, Professeur, Institut de Médecine Légale, Université de Cologne M. Daniel Rougé, Professeur, Institut de Médecine Légale, Université Paul Sabatier Examinateurs : M. Eric Crubézy, Professeur, Université Paul Sabatier, UMR 8555, CNRS M. Alain Van Dorsselaer, HDR, Université Louis Pasteur, UMR 7512

  • thèse de doctorat

  • moment

  • sciences du vivant - aspects moléculaires

  • directeur de la recherche


Publié le : mercredi 1 février 2006
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Thèse présentée pour obtenir le grade de
Docteur de l’Université Louis Pasteur
Strasbourg I

Discipline :
Sciences du vivant - Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

par Elizabet Petkovski

Polymorphismes ponctuels de séquence
et identification génétique
Etude par spectrométrie de masse MALDI-TOF

Soutenue publiquement le 10 février 2006

Membres du jury
Directeur de Thèse :
M. Bertrand Ludes, Professeur, Université Louis Pasteur, E.A. 3428
Rapporteur Interne :
M. Jean-Marc Jeltsch, Professeur, Université Louis Pasteur, UMR 7175
Rapporteurs Externes :
M. Peter M. Schneider, Professeur, Institut de Médecine Légale, Université de Cologne
M. Daniel Rougé, Professeur, Institut de Médecine Légale, Université Paul Sabatier
Examinateurs :
M. Eric Crubézy, Professeur, Université Paul Sabatier, UMR 8555, CNRS
M. Alain Van Dorsselaer, HDR, Université Louis Pasteur, UMR 7512




Notre vie est toujours emportée par le temps, qui ne cesse de nous échapper.
Jacques-Bénigne Bossuet
1627 - 1704








A la mémoire de mon père
Il a été et restera un modèle pour moi. Il m’a tout appris, tout donné. Mes actions, mes
pensées, mes gestes sont "imprégnés" de lui.


A ma mère
Son soutien, sa patience, sa confiance, sa générosité et sa tendresse immense sont le moteur
de mon avancée.


A ma sœur
Pour son encouragement et son affection.



Ce travail n’aurait vu le jour sans la confiance et la patience de mon directeur de recherche
Monsieur le Professeur Bertrand LUDES qui m'a accueillie au sein de son équipe pendant ces
années de thèse. Je tiens à lui exprimer toute ma reconnaissance d'avoir su m'encadrer, me
conseiller et me soutenir tout en me laissant travailler très librement.


Mes plus sincères remerciements vont à Monsieur le Professeur Jean Marc JELTSCH qui m'a
fait l'honneur d'accepter de juger mon travail et dont l'enseignement et la passion de ce dernier
resteront des exemples pour moi.


Je remercie vivement Monsieur le Professeur Peter SCHNEIDER de l'honneur qu'il me fait en
acceptant la charge de rapporteur de ma thèse. La grande estime et admiration que je lui porte
m'ont naturellement conduit à solliciter son jugement.


Je remercie Messieurs les Professeurs Daniel ROUGÉ et Eric CRUBEZY qui ont eu la
gentillesse d'accepter de juger mon travail.


Ce travail a bénéficié de la patience et des compétences de Monsieur le Docteur Alain VAN
DORSSELAER et de son équipe, qui m'a accueillie de nombreuses fois (tous les vendredis de
toutes les semaines de tous les mois ...). Sa présence dans ce jury, pour laquelle je le remercie,
est un grand honneur.


Je remercie le Docteur Rémi HIENNE pour m'avoir accueillie au sein du laboratoire Codgene
et pour m'avoir accordé sa confiance en m'offrant la possibilité de poursuivre ce travail.


Je tiens à exprimer ma reconnaissance au Docteur Christine KEYSER qui m'a encouragé et
soutenue dans mes moments d'enthousiasme étincelant comme dans les moments de doute
inconsolables.
Merci à ceux qui étaient mes collègues mais sont aujourd'hui des amis précieux. Ces
personnes exceptionnelles se reconnaîtront car ils m'ont inlassablement encouragé, supporté et
soutenu en participant aux moments joyeux et aux épreuves dures de ma vie.


Je dois ajouter que ce travail n’a pu être possible que grâce à la contribution de toutes les
personnes travaillant à l'Institut de Médecine Légale et au laboratoire Codgène. Ils m'ont
chacun à sa manière, à un moment ou à un autre, aidé, guidé, soutenu ou tout simplement ont
pris de leur temps pour converser avec moi.


Merci à l'Association Nationale pour la Recherche Technique (ANRT) et au Ministère de
l'Enseignement Supérieur et de la Recherche pour le soutien financier qui a rendu possible la
réalisation de ce travail.


Je ne puis citer tous ceux qui de près ou de loin ont contribué à mon travail mais je ne les
oublie pas. Je ne peux pas ignorer que la réalisation de cette thèse de doctorat n'aurait jamais
été possible sans leur contribution. Merci à toutes et à tous!


Table des matières

Table des matières...................................................................................................................... 1
Liste des figures ......................................................................................................................... 7
Liste des tableaux.......... 9
Liste des abréviations............................................................................................................... 11
Introduction générale................................................................................................................ 12
I. Données de la littérature................................................................................................... 14
I.1. Les empreintes génétiques ....................................................................................... 15
I.1.1. Polymorphisme de longueur des fragments de restriction ............................... 16
I.1.2. Polymorphisme de répétition ........................................................................... 16
I.1.2.1. Minisatellites................................................................................................16
I.1.2.1.1. Les sondes multiloculaires.....................................................................17
I.1.2.1.2. Les uniloculaires........................................................................18
I.1.2.1.3. Développement de la PCR 18
I.1.2.2. Microsatellites..............................................................................................19
I.1.3. Les marqueurs haplotypiques........................................................................... 20
I.1.3.1. Marqueurs du chromosome Y...................................................................... 21
I.1.3.2. L'ADN mitochondrial...................................................................................22
I.1.4. Détermination du sexe...................................................................................... 24
I.1.5. Domaines d'applications24
I.1.5.1. Transplantations...........................................................................................25
I.1.5.2. Détermination du sexe.................................................................................. 26
I.1.5.3. Identification d’un individu et des liens de parenté ..................................... 26
I.1.5.4. L'ADN extrait de tissus anciens ................................................................... 27
I.2. Qualité et quantité des échantillons d'ADN ............................................................. 29
I.2.1. Dégradation de la molécule d’ADN................................................................. 30
I.2.1.1. Ruptures de brin...........................................................................................30
I.2.1.2. Lésions hydrolytiques..................................................................................31
I.2.1.3. Lésions oxydatives.......................................................................................31
I.2.2. Facteurs environnementaux..............................................................................31
I.2.2.1. La quantité d'oxygène32
1
I.2.2.2. La température..............................................................................................32
I.2.2.3. L'humidité....................................................................................................32
I.2.2.4. Le pH............................................................................................................32
I.2.2.5. Les UV.........................................................................................................33
I.3. Avantages et inconvénients des techniques actuelles .............................................. 34
I.4. Polymorphisme ponctuel de séquence ..................................................................... 35
I.4.1. Intérêt des marqueurs SNP autosomaux........................................................... 37
I.4.2. Technologies : Génotypage de SNP................................................................. 38
I.4.2.1. Technologies de discrimination allélique..................................................... 38
I.4.2.1.1. Hybridation............................................................................................38
I.4.2.1.1.1. Phares moléculaires........................................................................38
I.4.2.1.1.2. Technologie 5'Nuclease..................................................................39
I.4.2.1.1.3. Technologie Light Cycler ............................................................... 40
I.4.2.1.2. Clivage invasif.......................................................................................41
I.4.2.1.3. Ligature..................................................................................................42
I.4.2.1.4. RFLP......................................................................................................43
I.4.2.1.5. Extension d'amorce................................................................................44
I.4.2.1.5.1. Extension de sonde allèle spécifique .............................................. 44
I.4.2.1.5.2. Extension allèle spécifique d'amorce 45
I.4.2.2. Méthodes de détection des produits de la discrimination allélique.............. 46
I.4.2.2.1. Electrophorèse et détection directe de fluorescence .............................. 46
I.4.2.2.2. Puces à ADN et détection directe de fluorescence ................................ 46
I.4.2.2.3. Transfert résonant d’énergie de fluorescence ........................................ 47
I.4.2.2.4. Polarisation de fluorescence..................................................................48
I.4.2.2.5. Luminescence........................................................................................49
I.4.2.2.6. Spectrométrie de masse.......................................................................... 49
I.4.2.3. Possibilités d'enchaînement des technologies .............................................. 50
I.5. Spectrométrie de masse MALDI-TOF..................................................................... 51
I.5.1. Historique.........................................................................................................51
I.5.2. La source MALDI ............................................................................................ 53
I.5.2.1. Ionisation......................................................................................................54
I.5.2.2. Extraction retardée.......................................................................................55
I.5.2.3. Matrices et modes de dépôt.......................................................................... 56
I.5.2.3.1. Les matrices...........................................................................................57
2
I.5.2.3.2. Les modes de dépôt................................................................................ 58
I.5.3. L'analyseur TOF...............................................................................................59
I.5.3.1. Principe.........................................................................................................59
I.5.3.2. Quelques formules fondamentales ............................................................... 59
I.5.3.3. Mode linéaire................................................................................................60
I.5.3.4. Mode réflectron............................................................................................61
I.5.3.5. Filtrage des ions de basse masse .................................................................. 61
I.5.4. Avantages et inconvénients de la spectrometrie de masse MALDI-TOF........ 62
I.6. Problématique...........................................................................................................64
II. Matériel et Méthodes........................................................................................................ 65
II.1. Choix des SNP ......................................................................................................... 66
II.1.1. SNP autosomaux..............................................................................................66
II.1.1.1. Critères de sélection..................................................................................... 66
II.1.1.2. Sources66
II.1.1.3. Aspects techniques......................................................................................66
II.1.2. SNP du chromosome X.................................................................................... 68
II.1.3. e Y 68
II.2. Echantillons.............................................................................................................. 69
II.2.1. Consentement éclairé.......................................................................................69
II.2.2. Echantillons d'optimisation et validation technologique.................................. 70
II.2.2.1. SNP autosomaux et du chromosome X ....................................................... 70
II.2.2.2. SNP du chromosome Y ............................................................................... 70
II.2.3. Echantillons de population française................................................................ 70
II.2.4. Echantillons anciens : étude des SNP-Y .......................................................... 71
II.3. De l'ADN dans l'échantillon à l'ADN dans le tube .................................................. 71
II.3.1. Extraction d'ADN.............................................................................................71
II.3.2. Purification de l'ADN.......................................................................................71
II.3.2.1. Précipitation à l'éthanol ............................................................................... 71
TMII.3.2.2. Purification à l'aide du kit Clean-Mix (Talent)........................................ 72
II.3.3. Quantifications de l'ADN par PCR en temps réel............................................ 72
II.3.4. Concentration et purification par ultrafiltration ............................................... 73
II.3.5. Utilisation de la technologie FTA® (Whatman, Inc)....................................... 73
II.4. Amplification par PCR............................................................................................. 74
II.4.1. Dessin et construction d'amorces PCR............................................................. 74
3
II.4.2. Optimisation des réactions de PCR.................................................................. 75
II.4.2.1. Plan d'expérience.........................................................................................76
II.4.2.2. Les autres paramètres de réaction PCR ....................................................... 76
II.4.2.3. Détection des amplicons.............................................................................. 77
II.5. Séquençage............................................................................................................... 77
II.6. Extension d’amorce..................................................................................................78
II.6.1. Dessin d'amorces PEX ..................................................................................... 78
II.6.2. Optimisation PEX............................................................................................78
II.6.2.1. Plan d'expérience.........................................................................................79
II.6.2.2. Les autres paramètres de réaction PEX ....................................................... 79
II.6.3. Purification des produits PEX.......................................................................... 80
II.7. Les réactions simultanées 80
II.8. Spectrométrie de masse MALDI-TOF..................................................................... 81
II.8.1. Préparation de la matrice.................................................................................. 81
II.8.2. Préparation du dépôt.........................................................................................82
II.8.3. Analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF ......................................... 82
II.8.4. Determination de la masse ............................................................................... 83
II.9. Analyse des SNP du chromosome Y........................................................................ 83
II.10. e X.................................................................... 84
II.11. Analyses statistiques............................................................................................85
II.11.1. Paramètres spécifiques des loci 85
II.11.2. Utilisation du logiciel Genepop 86
II.11.3. Probabilités de paternité...................................................................................87
III. Résultats....................................................................................................................... 88
III.1. Les marqueurs autosomaux.................................................................................. 89
III.1.1. Sélection théorique...........................................................................................89
III.1.2. Tri "expérimental"............................................................................................89
III.1.2.1. La PCR simple 89
III.1.2.2. Le séquençage90
III.1.2.3. La PEX simple 91
III.1.2.4. Analyse en spectrométrie de masse MALDI-TOF..................................... 91
III.1.2.4.1. Préparation de la matrice et du dépôt.................................................. 91
III.1.2.4.2. Analyse des produits d'extension d'amorce......................................... 92
III.1.2.4.3. Détermination de la masse .................................................................. 93
4
III.1.2.5. Les réactions "multiplexes"........................................................................ 94
III.1.2.6. Les hauteurs de pics ................................................................................. 101
III.1.3. Résultats de l’évaluation statistique ............................................................... 102
III.1.3.1. Les marqueurs..........................................................................................102
III.1.3.2. Les génotypes...........................................................................................103
III.1.3.3. Evaluations statistiques............................................................................106
III.1.3.3.1. Les marqueurs...................................................................................106
III.1.3.3.1.1. Fréquences et degré d’hétérozygotie.......................................... 106
III.1.3.3.1.2. Equilibre de Hardy-Weinberg .................................................... 108
III.1.3.3.1.3. Pouvoir discriminatoire..............................................................109
III.1.3.3.2. L'ensemble des marqueurs ................................................................ 109
III.1.3.3.2.1. Déséquilibre de liaison............................................................... 110
III.1.3.3.2.2. Qualité de l'ensemble des SNP................................................... 110
III.1.3.3.2.3. Fréquence du profil .................................................................... 111
III.1.4. Résultats sur les paternités ............................................................................. 111
III.2. Marqueur pour la détermination du sexe............................................................ 111
III.3. Les SNP du chromosome X ............................................................................... 113
III.4. osome Y 113
III.4.1. La détection....................................................................................................113
III.4.2. TAT, M242 et RPS4Y dans le contexte des échantillons .............................. 114
IV. Discussion.................................................................................................................. 115
IV.1. Etude de séquences de plus en plus courtes ....................................................... 116
IV.1.1. Utilisation des SNP ........................................................................................ 117
IV.1.1.1. Caractéristiques intéressantes des SNP en général .................................. 117
IV.1.1.2. Avantages des SNP par rapport aux STR ................................................ 118
IV.1.1.3. Inconvénients des SNP par rapport aux STR........................................... 118
IV.1.2. Détection par spéctrométrie de masse MALDI-TOF..................................... 119
IV.2. La problématique au niveau de chaque étape technique .................................... 120
IV.2.1. La PCR...........................................................................................................120
IV.2.2. PEX & MALDI-TOF ..................................................................................... 122
IV.3. SNP : "to be or not to be"................................................................................... 126
IV.3.1. Identification génétique..................................................................................127
IV.3.1.1. Evaluation des loci 127
IV.3.1.2. Etude de mélanges 129
5

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