UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG UFR DES SCIENCES DE LA VIE

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Niveau: Supérieur

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  • exposé


UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG UFR DES SCIENCES DE LA VIE _____________________________________________________________________ THÈSE Présentée par Peggy JOUVERT Pour l'obtention du diplôme de : Docteur de l'Université Louis Pasteur Discipline Neurosciences Régulations de l'expression du gène egr-1 en réponse à des traitements aigu ou répété de cocaïne dans le cerveau de rat Soutenue le 13 janvier 2003 devant la commission d'examen : Docteur Dominique AUNIS Président du Jury Professeur Alain BERETZ Rapporteur Interne Docteur Valérie DAUGÉ Rapporteur Externe Professeur André NIEOULLON Rapporteur Externe Docteur Jean ZWILLER Directeur de Thèse

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  • perfusion intra-cardiaque

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Publié le : mercredi 1 janvier 2003
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Source : scd-theses.u-strasbg.fr
Nombre de pages : 233
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UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG
UFR DES SCIENCES DE LA VIE
_____________________________________________________________________

THÈSE

Présentée par Peggy JOUVERT



Pour l’obtention du diplôme de :
Docteur de l’Université Louis Pasteur

Discipline Neurosciences




Régulations de l’expression du gène egr-1 en
réponse à des traitements aigu ou répété de
cocaïne dans le cerveau de rat





Soutenue le 13 janvier 2003 devant la commission d’examen :

Docteur Dominique AUNIS Président du Jury
Professeur Alain BERETZ Rapporteur Interne
Docteur Valérie DAUGÉ Rapporteur Externe
Professeur André NIEOULLON Rapporteur Externe
Docteur Jean ZWILLER Directeur de Thèse
REMERCIEMENTS


Le travail de thèse exposé dans ce mémoire a été réalisé au sein de l’Unité 338 de l’INSERM à
Strasbourg sous la direction du Docteur Jean Zwiller.

Je remercie le Docteur Valérie Daugé et les Professeurs Alain Beretz et André Nieoullon d’avoir accepté
de siéger dans ce jury de thèse et de m’avoir fait l’honneur d’examiner ce travail.

Je remercie le Docteur Dominique Aunis de m’avoir accueillie dans son unité de recherche et d’avoir
présidé ce jury.

Je remercie Jean pour sa passion de la neurobiologie et de la Science qu’il a su me faire partager. Je tiens à
lui exprimer ma reconnaissance pour la disponibilité et l’aide précieuse qu’il m’a accordées tout au long de
ces années. J’ai beaucoup appris à travers nos longues conversations scientifiques et diverses.

Au cours des années passées à Strasbourg, j’ai eu la chance et la joie d’évoluer dans différents cocons qui
m’ont permis de profiter de chaque instant. Le premier est celui du laboratoire et de mon initiation au
monde professionnel. Je remercie Marie-Odile pour ses petits gâteaux, sa disponibilité et son soutien
quotidiens; Nathalie pour ses encouragements lors de mon arrivée, nos longues conversations et son amitié
fidèle depuis Baltimore; Claude pour son humour et l’efficacité de ses recherches sur le net; Jean-Bernard
pour son enthousiasme; Keith pour son humour "so british" et ses aides technique et linguistique; Isabelle,
Laurence et Raphaël pour leur gentillesse.

J’adresse également mes remerciements à Serge Gobaille pour l’initiation aux micro-injections avec
disponibilité et sympathie; Anelise Lazaris et Suzanne Cassel pour nos conversations amicales et leur
aide technique si précieuse; Sylvie Dirrig-Grosch pour les observations en microscopie confocale; Laure
Pain pour son aimable collaboration au cours du projet "Propofol". Je remercie l’ensemble des membres de
l’Unité U338 (nouvellement U575) et du Centre de Neurochimie qui ont pu m’aider d’une façon ou
d’une autre au cours de ces années.

Un grand merci aux moniteurs/monitrices et les responsables d’enseignement que j’ai eu le plaisir de
côtoyer au cours de mon service de monitorat.

Le deuxième cocon dans lequel j’ai évolué au cours de ces années est ma famille "adoptive". Je remercie
mes "sœurs" Claire et Pauline pour les années partagées ensemble au quotidien. Je les remercie pour tous
les passionnants instants, les joies et les peines qu’on a traversé ensemble. Je remercie également "tonton"
Alexandre qui en quelques mois a su m’initier à sa belle philosophie de vie.

Je remercie mes amis théâtreux pour les inoubliables moments partagés: GG, Francky, Fred et Num; mes
amis scientifiques statutaires ou (ex-) thésards de l’Esplanade: Fred, Marco et Steph pour leurs week-
ends "découvertes" ponctués de photos concepts et aussi Anne-Marie, Yannick, Jean-Luc, Olive, Nico,
Karine, Christian, Valérie, Julien, Amar, Amyaouch, Stéphanie.

Je remercie les physiciens du LDFC (merci Simona et Rémi pour les vacances géniales à Rome), les
chimistes et "biologues" d’Illkirch que j’ai eu le plaisir de rencontrer au cours d’évènements festifs et variés.

Ainsi que mes amis non scientifiques: Aurore et Fabio. Je voudrais remercier les amis d’avant Strasbourg
qui me sont restés fidèles malgré l’éloignement géographique: Yann, Bruno, Véro, Rachel, Cécile,
Laurent, Caro, Ariane, Béa.

Mes derniers remerciements iront à ma famille, mon troisième cocon. Je remercie mes parents, mon frère,
Carine, mes grands-mères, mes cousines-cousins et leurs "p’tits bouts de chou", mes tantes et oncles de
m’avoir soutenue à plus d’un titre au cours de ces longues études. Merci d’être toujours présents.




























TABLE DES MATIÈRES

LISTE DE PUBLICATIONS _____________________________________ 1
TABLE DES ILLUSTRATIONS __________________________________ 2
TABLEAUX _________________________________________________ 5
LISTE DES ABRÉVIATIONS____________________________________ 6
DONNÉES BIBLIOGRAPHIQUES _______________________________ 11
Chapitre I. Les psychostimulants_______________________________________ 12
A. Généralités_______________________________________________________ 12
1. La cocaïne ________________________________________________________ 12
2. Les amphétamines substituées _________________________________________ 14
B. Effets psychotropes des stimulants ___________________________________ 16
1. Eléments de cinétique________________________________________________ 16
2. Effets d’une prise unique _____________________________________________ 17
3. Effets d’une consommation abusive _____________________________________ 17
C. Effets somatiques des psychostimulants ______________________________ 18
1. Manifestations neurologiques __________________________________________ 18
2. Activité anesthésique locale ___________________________________________ 19
3. Toxicité cardio-vasculaire 19
4. Toxicité pulmonaire _________________________________________________ 20
5. Toxicités diverses ___________________________________________________ 20
Chapitre II. Les neurotransmissions impliquées dans la réponse aux
psychostimulants ____________________________________________________ 21
A. Le système dopaminergique ________________________________________ 21
1. La dopamine_______________________________________________________ 21
2. La synapse dopaminergique 24
3. Le système dnergique 33
B. Interaction avec le système GABAergique _____________________________ 41
1. Le GABA_________________________________________________________ 41
2. Les récepteurs du GABA _____________________________________________ 42
3. Le système GABAergique 46
C. Interaction avec le système glutamatergique ___________________________ 50
1. Le glutamate 50
2. La synapse glutamatergique____________________________________________ 53
3. Le système glgique ___________________________________________ 58
D. Effets neurobiologiques des psychostimulants _________________________ 61
1. Cibles moléculaires __________________________________________________ 61
2. Circuits impliqués dans les effets renforçants des drogues_____________________ 62
Chapitre III. La voie de transduction du GMPc ___________________________ 69
A. Les peptides natriurétiques _________________________________________ 69
1. Synthèse et localisation _______________________________________________ 69
2. Les récepteurs des peptides natriurétiques_________________________________ 71
3. Rôles physiologiques_________________________________________________ 73
B. Le GMPc ________________________________________________________ 75
1. Synthèse du GMPc __________________________________________________ 75
2. Cibles ____________________________________________________________ 76
C. Les protéine kinases dépendant du GMPc (PKG) _______________________ 78
1. Les différentes isoformes _____________________________________________ 78
2. Mode d’action______________________________________________________ 80
3. Fonctions et substrats des PKG ________________________________________ 82
Chapitre IV. Les gènes à réponse précoce________________________________ 85
A. Les gènes de la famille egr __________________________________________ 85
1. Le gène précoce egr-1 et son promoteur __________________________________ 85
2. Le gène egr-2 _______________________________________________________ 88
3. Le gène egr-3 88
B. Les facteurs de transcription Egr_____________________________________ 89
1. Le facteur de transcription Egr-1 _______________________________________ 90
2. Le facteur de trn Egr-2 91
3. Le facteur de transcription Egr-3 91
C. Expression des gènes egr dans le SNC ________________________________ 92
1. Expression d’egr-1 dans le SNC_________________________________________ 92
2. Expression d’egr-2 dans le cerveau mature_________________________________ 93
3. Expression du gène egr-3______________________________________________ 94
D. Rôles des facteurs de transcription Egr _______________________________ 96
1. Rôles du facteur de transcription Egr-1___________________________________ 96
2. Rôle d’Egr-2_______________________________________________________ 97
3. Rôles d’Egr-3 ______________________________________________________ 97
E. Les co-répresseurs transcriptionnels NAB _____________________________ 98
1. Généralités ________________________________________________________ 98
2. Expression de NAB1 ________________________________________________ 98
3. Expression de NAB2 98
MATÉRIEL ET MÉTHODES ___________________________________ 100
A. Préparation des animaux __________________________________________ 101
1. Implantations stéréotaxiques de guide canules ____________________________ 101
2. Transfert de gène in vivo _____________________________________________ 103
3. Microdialyse sur animal vigile _________________________________________ 104
4. Injection intra-péritonéale____________________________________________ 105
5. Perfusion intra-cardiaque 105
6. Prélèvement de structures cérébrales____________________________________ 107
7. Préparation de synaptosomes 107
B. Analyse des ARN messagers par hybridation in situ ____________________ 109
1. Linéarisation des plasmides___________________________________________ 109
2. Marquage de la sonde _______________________________________________ 109
3. Hybridation in situ proprement dite_____________________________________ 111
C. Etudes immunologiques __________________________________________ 113
1. Origine des anticorps 113
2. "Western Blot" ____________________________________________________ 113
3. Marquage immunohistochimique ______________________________________ 114
4. Double marquage immunocytochimique_________________________________ 115
5. Observations en microscopie confocale et électronique _____________________ 116
D. Test de mobilité électrophorétique __________________________________ 117
1. Extraction des protéines nucléaires 117
2. Détection du complexe ADN-protéines _________________________________ 118
E. Mesure de l’activité enzymatique de la PKG __________________________ 120
F. Mesure de l’activité locomotrice spontanée ___________________________ 121
RÉSULTATS ______________________________________________ 124
A. Interactions dopamine - glutamate - GABA dans les effets de la cocaïne dans le
striatum et le cortex pré-frontal _______________________________________ 125
1. Effet d’une injection unique de cocaïne sur l’expression d’egr-1 ________________ 126
2. Effet d’une injection de kétamine ou de propofol sur l’expression d’egr-1 ________ 127
3. Effet modulateur des anesthésiques sur l’expression d’egr-1 induite par la cocaïne __ 128
B. Modulation des neurones dopaminergiques par l’activation de la voie de
transduction du GMPc ______________________________________________ 129
1. Action du neuropeptide CNP _________________________________________ 129
2. Activation de la voie du GMPc / PKG__________________________________ 142
3. Sur-expression de la protéine kinase dépendant du GMPc ___________________ 147
C. Expression différentielle des gènes de la famille Egr et de ses co-répresseurs
NAB en réponse à des injections répétées de cocaïne _____________________ 158
1. Cinétique d’expression du messager egr-1 après l’administration aiguë ou répétée de
cocaïne____________________________________________________________ 158
2. Cinétique d’expression de la protéine Egr-1 après l’administration aiguë ou répétée de
cocaïne 161
3. Mesure de l’activité de liaison de la protéine Egr-1 _________________________ 163
4. Cinétique d’expression des protéines Egr-2 et Egr-3 après l’administration unique ou
répétée de cocaïne ___________________________________________________ 165
5. Cinétique d’expression des messagers des co-répresseurs NAB1 et NAB2 après
l’administration unique ou répétée de cocaïne_______________________________ 166
DISCUSSION _____________________________________________ 170
A. Interactions dopamine - glutamate - GABA ___________________________ 172
1. Glutamate et gènes à réponse précoce __________________________________ 172
2. Propofol, gènes précoces et dopamine 173
3. Modulation par un antagoniste des récepteurs glutamatergiques de l’expression d’egr-1
induite par la cocaïne _________________________________________________ 174
4. Modulation par le propofol de l’expression d’egr-1 induite par la cocaïne_________ 174
5. Effet permissif de la dopamine dans le striatum ___________________________ 175
B. Modulation de l’activité des neurones dopaminergiques par l’activation de la
voie du GMPc _____________________________________________________ 178
1. Action du CNP____________________________________________________ 178
2. Intervention de la PKG dans la modulation des neurones dopaminergiques ______ 180
3. Perspectives ______________________________________________________ 184
C. Expression différentielle des gènes des familles egr et NAB _____________ 186
1. egr-1 ____________________________________________________________ 186
2. Expression des gènes NAB __________________________________________ 188
3. Expression d’egr-2 et egr-3 ____________________________________________ 189
4. Conclusion et perspectives ___________________________________________ 190
DISCUSSION GÉNÉRALE ____________________________________ 192
A. egr-1 et plasticité synaptique _______________________________________ 193
B. Cocaïne, gènes et dépendance______________________________________ 195
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ____________________________ 198



LISTE DE PUBLICATIONS


Nathalie Thiriet, Peggy Jouvert, Serge Gobaille, Olga Solov’eva, Bobby Gough,
Dominique Aunis, Syed Ali et Jean Zwiller.
C-type natriuretic peptide regulates cocaine-induced dopamine increase and immediate
early gene expression in rat brain.
Eur J Neurosci, 2001, 14: 1702-1708.

Peggy Jouvert, Jean-Bernard Dietrich, Dominique Aunis et Jean Zwiller.
Differential rat brain expression of Egr proteins and of the transcriptional corepressor
NAB in response to acute or chronic cocaine administration.
NeuroMolecular Med, 2002, 1: 137-151.

Peggy Jouvert, Laure Pain, Dominique Aunis et Jean Zwiller.
The anesthetic agents propofol and ketamine inhibit cocaine-induced egr-1 gene
expression in rat forebrain.
Eur J Pharmacol, 2002, 449: 239-243.

Peggy Jouvert, Keith Langley, Marie-Odile Revel, Dominique Aunis et Jean Zwiller.
Inhibition of cocaine-induced egr-1 expression by the activation of the cGMP/PKG
pathway in rat dopaminergic structures.
En préparation.
















1 TABLE DES ILLUSTRATIONS

Figure 1 : Structure de la cocaïne (ester méthylique de benzoylecgonine). _____ 13
Figure 2 : Structure de l’amphétamine. __________________________________ 15
Figure 3 : Métabolisme de la dopamine. _________________________________ 22
Figure 5: Représentation bidimensionnelle du transporteur membranaire humain
de la dopamine. _________________________________________________ 25
Figure 6: Représentation bidimensionnelle du transporteur vésiculaire des
monoamines VMAT2. ____________________________________________ 26
Figure 7: Structure du récepteur dopaminergique D1. ______________________ 28
Figure 9: Distribution des noyaux catécholaminergiques dans le système nerveux
central de rat. ___________________________________________________ 33
Figure 10 : Les voies dopaminergiques mésencéphaliques __________________ 34
Figure 11 : Métabolisme du GABA. _____________________________________ 41
Figure 12 : Représentation schématique de la structure du récepteur GABA-A. _ 43
Figure 13: Modèle tridimensionnel du récepteur GABA-B fonctionnel formé d’un
hétérodimère des sous-unités GABA-B1 et GABA-B2. 45
Figure 14 : Les principales projections GABAergiques dans le cerveau de rat. __ 48
Figure 15 : Schéma des efférences GABAergiques striatales._________________ 49
Figure 16 : Synthèse et métabolisme du glutamate et du GABA dans le cerveau_ 51
Figure 17 : Les différents transporteurs du glutamate. ______________________ 52
Figure 18 : Schéma illustrant la localisation des récepteurs métabotropes du
glutamate dans le circuit des ganglions de la base. ____________________ 57
Figure 19 : Organisation schématique de la distribution des récepteurs
dopaminergiques et des récepteurs ionotrpes du glutamate dans le circuit des
ganglions de la base. _____________________________________________ 60
Figure 20 : Séquences des peptides natriurétiques et structures secondaires. ___ 70
Figure 21 : Modèle hypothétique du cycle activation-désensibilisation du récepteur
GC-B. _________________________________________________________ 71
Figure 22 : Mécanismes d’activation et cibles du GMPc.____________________ 75 3 : Structure et homologies de séquence des PKG. __________________ 78
Figure 24 : Les éléments régulateurs du promoteur du gène egr-1.____________ 87
Figure 25 : Structure des protéines de la famille Egr. _______________________ 89
Figure 26 : Schéma d'implantation des guides canules pour les injections intra-
cérébrales._____________________________________________________ 102
Figure 27: Schéma du transfert de gène à l’aide du PEI. ___________________ 104
Figure 28: Schéma des niveaux de prélèvement des coupes et zones de
quantification de la densité optique. _______________________________ 106
Figure 29 : Description schématique de la préparation de synaptosomes de striata
de rat. ________________________________________________________ 108
32Figure 30: Séparation des oligonucléotides marqués de l'ATP γ – [ P] libre sur
une colonne séphadex G50. ______________________________________ 118
Figure 31 : Les anesthésiques propofol et kétamine modulent l’expression d’egr-1
induite par la cocaïne. ___________________________________________ 126
Figure 32 : Analyse densitométrique de l’expression du gène précoce egr-1 réalisée
à partir des films autoradiographiques obtenus après hybridation in situ._127
Figure 33 : Modulation de l’expression d’egr-1 par le CNP._________________ 130
2 Figure 34 : Analyse densitométrique de l’expression du gène egr-1 réalisée à partir
des films autoradiographiques obtenus après hybridation in situ. _______ 131
Figure 35 egr-1utoradiographiques.____________________________________ 132
Figure 36 : Modulation par le CNP du taux de dopamine extracellulaire. _____ 134 7 : Expression de la GC-B dans le cerveau de rat.__________________ 137
Figure 38 : Localisation de la GC-B dans deux types cellulaires. ____________ 138
Figure 39 : Modulation de l’expression d’egr-1 par le CNP injecté dans les
structures dopaminergiques. _____________________________________ 139
Figure 40 : Analyse densitométrique de l’expression du gène egr-1 réalisée à partir
des films autoradiographiques.____________________________________ 140
Figure 41 : Expression des messagers egr-1 après administration intra-CPu de
CNP et injection i.p. de cocaïne, de GBR 12909 ou de D-amphétamine. __ 141
Figure 42 : Analyse par "Western Blot" de l’expression de la PKG dans des
synaptosomes de striata de rats. ___________________________________ 142
Figure 43 : Localisation sub-cellulaire de la PKG dans le striatum de rat. _____ 144
Figure 44 : Le 8-Bromo-GMPc module l'expression des messagers egr-1 induite
par la cocaïne. _________________________________________________ 145
Figure 45 : Analyse densitométrique de l’expression du gène egr-1, réalisée à partir
des films autoradiographiques obtenus après hybridation in situ. _______ 146
Figure 46 : Analyse par "Western Blot" de l’expression de la PKG transfectée dans
des striata de rats. ______________________________________________ 147
Figure 47 : Sur-expression de la PKG dans le CPu de rat. __________________ 149 8 : Localisation de la PKG sur-exprimée dans le cerveau de rat. ______ 150
Figure 49xprimée da 151
Figure 50on de la PKG dans le CPu de rat. ____________________ 152
Figure 51 : Protocole d’injection des rats en vue de l’étude par hybridation in situ.
______________________________________________________________ 153
Figure 52: L'activation de la PKG module l'expression des messagers egr-1 induite
par la cocaïne. _________________________________________________ 154
Figure 53 : Analyse densitométrique de l’expression d’egr-1 réalisée à partir des
films autoradiographiques obtenus après hydridation in situ.___________ 155
Figure 54 : La sur-expression de la PKG réduit l’activité locomotrice induite par la
cocaïne._______________________________________________________ 156
Figure 55: Expression des messagers egr-1 , NAB1 et NAB2 après des traitements
aigu ou répété de cocaïne.________________________________________ 159
Figure 56 : Cinétique de l’expression du gène egr-1 suite à une administration
unique ou répétée de cocaïne. ____________________________________ 160
Figure 57 : Expression des protéines Egr-1, Egr-2 et Egr-3 après un traitement
aigu ou répété de cocaïne. 161
Figure 58 : Cinétique d’expression de la protéine Egr-1 après une administration
aiguë ou répétée de cocaïne.______________________________________ 162
Figure 59 : Activité de liaison du facteur de transcription Egr-1 après une
administration unique ou répétée de cocaïne.________________________ 164
Figure 60 : Cinétique d’expression de la protéine Egr-3 suite à une administration
unique ou répétée de cocaïne _____________________________________ 166
Figure 61 : Cinétique de l’expression du gène NAB2 suite à une administration
aiguë ou répétée de cocaïne.______________________________________ 168
3 Figure 62 : Régulation de la phosphorylation des récepteurs glutamatergiques
dans le neurone épineux de taille moyenne GABAergique du striatum.___ 176
Figure 63 : Régulation de l’activité des neurones épineux GABAergiques du
striatum par la phosphoprotéine DARPP-32. ________________________ 183
Figure 64 : Schéma résumant les étapes impliquées dans la formation de la
mémoire à long terme dans l’hippocampe. __________________________ 194
Figure 65 : Régulation de l’activité des neurones dopaminergiques par le peptide
CART.________________________________________________________ 196




























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