UNIVERSITE LOUIS PASTEUR STRASBOURG THÈSE présentée LA FACULTE DES SCIENCES DE LA VIE pour obtenir le titre de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR Domaine Biologie Moléculaire Végétale par Jérémie HAGENMULLER Étude des interactions fonctionnelles des protéines mitochondriales impliquées dans la maturation des cytochromes de type c chez Arabidopsis thaliana Soutenue le Novembre devant la commission d'examen P Giegé CNRS Strasbourg Examinateur F Vignols CNRS Perpignan Examinatrice C de Vitry CNRS Paris Rapporteur externe E Martinoia UZ Zurich Rapporteur externe M Keller CNRS Strasbourg Rapporteur interne J M Grienenberger CNRS Strasbourg Directeur de thèse Institut de Biologie Moléculaire des Plantes IBMP UPR CNRS

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UNIVERSITE LOUIS PASTEUR STRASBOURG 2008 THÈSE présentée à LA FACULTE DES SCIENCES DE LA VIE pour obtenir le titre de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR Domaine : Biologie Moléculaire Végétale par Jérémie HAGENMULLER Étude des interactions fonctionnelles des protéines mitochondriales impliquées dans la maturation des cytochromes de type c chez Arabidopsis thaliana Soutenue le 28 Novembre 2008, devant la commission d'examen P. Giegé (CNRS, Strasbourg) Examinateur F. Vignols (CNRS, Perpignan) Examinatrice C. de Vitry (CNRS, Paris) Rapporteur externe E. Martinoia (UZ, Zurich) Rapporteur externe M. Keller (CNRS, Strasbourg) Rapporteur interne J.M. Grienenberger (CNRS, Strasbourg) Directeur de thèse Institut de Biologie Moléculaire des Plantes (IBMP) UPR-CNRS 2357

  • adn bp

  • binding domain

  • paire de base

  • longueur d'onde d'absoption maximum

  • adénosine diphosphate

  • cassette acétyl-coa

  • acétyl coenzyme

  • kilo paire de bases bistris


Publié le : mercredi 30 mai 2012
Lecture(s) : 68
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UNIVERSITE LOUIS PASTEUR
STRASBOURG

2008


THÈSE


présentée à


LA FACULTE DES SCIENCES DE LA VIE



pour obtenir le titre de


DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR

Domaine : Biologie Moléculaire Végétale

par

Jérémie HAGENMULLER



Étude des interactions fonctionnelles des protéines mitochondriales
impliquées dans la maturation des cytochromes de type c chez
Arabidopsis thaliana


Soutenue le 28 Novembre 2008, devant la commission d'examen



P. Giegé (CNRS, Strasbourg) Examinateur
F. Vignols (CNRS, Perpignan) Examinatrice
C. de Vitry (CNRS, Paris) Rapporteur externe
E. Martinoia (UZ, Zurich) Rapporteur externe
M. Keller (CNRS, Strasbourg) Rapporteur interne
J.M. Grienenberger (CNRS, Strasbourg) Directeur de thèse


Institut de Biologie Moléculaire des Plantes (IBMP)
UPR-CNRS 2357
REMERCIEMENTS

Je tiens tout d’abord à remercier le Dr de Vitry, le Dr Vignols, le Professeur Martinoia et le
Dr Keller pour avoir accepté de juger mon travail.

Ma gratitude va bien évidemment à tous les membres de l’équipe du labo 306 pour m’avoir
accompagné pendant ces années de thèse et qui ont énormément contribué à faire de ces
quelques années une vraie « success story ».
Un très grand merci à Philipe qui a souvent trouvé les mots justes pour me redonner le moral
dans les périodes de grand stress et également à Géraldine qui a su, à sa manière, me motiver
quand les expériences n’allaient pas assez vite. Je remercie bien sûr Jean-Michel pour ses
conseils et ses encouragements.

Je salue les collègues du département mito qui ont rendu agréable ces années de paillasse et
de rédaction. Je remercie tout particulièrement Heike qui m’a redonné goût à l’escalade et
m’a initié aux joies du roller. Merci aussi à Claire pour ses visites pendant la rédaction de ma
thèse afin de vérifier si je vivais encore dans mes remparts d’articles à lire et de corrections à
faire. Merci à Romain pour sa compagnie pendant le Biovision 2008 au pays des pharaons.

Je remercie bien sûr mes parents pour m’avoir soutenu pendant ces (longues… longues)
années d’étude.

Un remerciement très spécial, enfin, à la charmante demoiselle qui partage mon quotidien et
qui, malgré ses sarcasmes sur ma condition de doctorant, a toujours su me soutenir tout au
long de cette thèse.

3
ABRÉVIATIONS

2,4 D : acide 2,4-dichloro-phenoxyacétique
3-AT : 3-aminotriazole
ABC : ATP binding cassette
acétyl-CoA : acétyl coenzyme A
AD : Activation domain, domaine d'activation
ADN : acide désoxyribonucléique
ADNc : ADN complémentaire
ADN-T : ADN de transfert
APS : persulfate d'ammonium
ARN : acide ribonucléique
ATP, ADP, AMP : adénosine triphosphate, adénosine diphosphate, adénosine monophosphate
BD : Binding domain, domaine de liaison à l'ADN
bp, kb : paire de bases, kilo paire de bases
BisTris : Bis(2-hydroxyéthyl)imino-tris(hydroxyméthyl)méthane
BSA : sérum-albumine bovine
ccdB : "control of cell death"
CCM : "cytochrome c maturation"
CHAPS : 3-[(3-cholamidopropyl)diméthylammonio]-1-propanesulfonate
CNBr : bromure de cyanogène
Cub : Partie C-terminale de l’ubiquitine
kDa : kiloDalton
DNase : désoxyribonucléase
dNTP : désoxyribonucléoside-5'-triphospahte
DO - x: Milieu « drop out », milieu ou le(s) acide(s) aminé(s) « x » n’ont pas été ajoutés
DO : densité optique à x nm X

DTT : dithiothréitol
EDTA : acide éthylène diamine tétraacétique
EST : "expressed sequence tag"
FADH : flavin Adenine Dinucleotide 2

FMN : flavine mononucléotide
g : unité de gravitation
GFP : "green fluorescent protein"
HA : étiquette hémagglutinine
HEPES : N-(2-hydroxyéthyl)piperazine-N'-( 2-éthanesulfonate) de sodium; 4-(2-
hydroxyéthyl)piperazine-1-( 2-éthanesulfonate) de sodium
Hsp : "Heat-shock protein"
IPTG : isopentényl-β-D-thiogalactopyranoside
λmax: longueur d'onde d'absoption maximum
LB : Luria broth
LB : "left border" (bordure gauche d'un ADN-T)
MES : acide 2-(N-morpholino) éthanesulfonique
Met : méthionine
MOPS : acide 3-N-morpholino-propanesulfonique
mt : mitochondrial
NP40 : Nonidet P-40
o-NPG : 2-Nitrophenyl β-D-galacto pyranoside
4
Nub : partie N-terminale de l’ubiquitine
(p/v) : poids/volume
PCR : réaction de polymérisation en chaîne
PEG : polyéthilène glycol
PLV : Facteur de transcription composé de VP16 et LexA
PM : poids moléculaire
PMSF : phényl méthyl sulfonyl fluoride
PVDF : difluorure de polyvinylidène
qsp : quantité suffisante pour
RB : "right border" (bordure droite d'un ADN-T)
RNase : ribonucléase
Rpm : révolutions par minutes
RT-PCR : Transcription inverse puis PCR
SDS : dodécylsulfate de sodium
SDS-PAGE : SDS-polyacrilamide gel electrophoresis
SSC : Standard sodium citrate
ssDNA : ADN porteur, « salmon sperm DNA»
TCA : acide trichloroacétique
TEMED : N, N, N',N'-tétraméthyléthylène diamine
Triton X100 : polyéthylène glycol tert-orthophényl éther; t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol;
4-(1,1,3,3-tétraméthylbutyl)phényl-polyéthylène glycol
Tween-20 : polyéthylène glycol sorbitane monolaurate
Tris : N-tris(hydroxyméthyl)aminométhane
U : unité enzymatique
UV : ultraviolet
(v/v) : volume/volume
WT : Wild type (sauvage)
YPD : Milieu pour levure
X-gal : 5-bromo 4-chloro 3-indole 1-D-galactopyranoside

5 Table des matières

Table des matières

Introduction ______________________________________________________________ 11
1. La mitochondrie_______________________ 11
1.1. Définitions et généralités ___________________________________________________11
1.1.1. Fonctions ___________________________________________________________________ 11
1.1.2. Origine_____________________________________________________________________ 12
1.1.3. Génome ____________________________________________________________________ 12
1.1.4. Import de molécules __________________________________________________________ 13
1.2. La respiration cellulaire____________________________________________________14
1.2.1. La glycolyse_________________________________________________________________ 15
1.2.2. Le cycle de Krebs ____________________________________________________________ 15
1.2.3. Le transfert d’électrons et la phosphorylation oxydative_______________________________ 16
2. Les cytochromes _______________________________________________________ 18
2.1.1. Définition___________________________________________________________________ 18
2.1.2. Les cytochromes de type c bactériens _____________________________________________ 20
2.1.3. Les cytochromes de type c chez les plantes_________________________________________ 22
3. Les systèmes de maturation des cytochromes de type c_________________________ 23
3.1. Le système IV : CCB ______________________________________________________25
3.2. Le système III : CCHL ____________________________________________________26
3.3. Le système II : CCS _______________________________________________________27
3.4. Le système I chez les bactéries ______________________________________________28
3.4.1. Le transporteur ABC : CcmA, CcmB et CcmC______________________________________ 28
3.4.2. Le système de livraison d’hème : CcmC et CcmD ___________________________________ 29
3.4.3. Le chaperon d’hème : CcmE ___________________________________________________ 30
3.4.4. La voie de réduction : CcmG, CcmH______________________________________________ 30
3.4.5. L’hème lyase : CcmF _________________________________________________________ 31
3.5. Le système I dans les mitochondries de plantes : Les gènes ccm ___________________31
3.5.1. Les gènes ccm codés par le génome mitochondrial de plantes __________________________ 31
3.5.2. Les gènes ccm codés par le génome nucléaire de plantes ______________________________ 32
3.5.3. Certains gènes ccm bactériens n’ont pas d’orthologues chez les plantes___________________ 33

6 Table des matières
3.6. Le système I dans les mitochondries de plantes : Fonctions des protéines ccm _____34
3.6.1. CCMA, CcmB et CcmC, composants potentiels d’un transporteur ABC __________________ 34
3.6.2. CCME, composant principal de la voie de livraison de l’hème__________________________ 36
3.6.3. Les protéines CcmF, une fonction potentielle d’hème lyase ____________________________ 37
3.6.4. Rôles de CCMH dans les mitochondries de plantes __________________________________ 37
4. Les transporteurs ABC __________________________________________________ 39
4.1. Fonctions ________________________________________________________________39
4.2. Structures _______________________________________________________________40
4.2.1. Les domaines de liaison à l’ATP (NBD) ___________________________________________ 40
4.2.2. Les domaines transmembranaires (TMD) __________________________________________ 41
4.2.3. La coopération entre les TMD et NBD ____________________________________________ 41
4.3. Import et export __________________________________________________________42
4.4. Mécanisme de transport ___________________________________________________42
4.5. Les transporteurs ABC de plantes ___________________________________________43
4.5.1. Inventaire des transporteurs ABC de plantes________________________________________ 43
4.5.2. Les transporteurs ABC chloroplastiques et mitochondriaux ____________________________ 44
Présentation du travail de thèse ______________________________________________ 46
Matériels et méthodes______________________ 48
1. Matériels et outils informatiques__________ 48
1.1. Matériel végétal __________________________________________________________48
1.2. Souches de bactéries et de levures ___________________________________________48
1.3. Vecteurs de clonage _______________________________________________________49
1.4. Banque d’ADNc __________________________________________________________51
1.5. Oligonucléotides __________________________________________________________51
1.6. Outils informatiques ______________________________________________________51
2. Méthodes _____________________________________________________________ 52
2.1. Méthodes de biologie moléculaire____________________________________________52
2.1.1. Transcription inverse: obtention d’ADNc total ______________________________________ 52
2.1.2. Réaction de Polymérisation en Chaîne (PCR) _______________________________________ 53
2.1.3. Électrophorèse sur gel d’agarose _________________________________________________ 53
2.1.4. Purification des fragments d’ADN issus de gels d’agarose _____________________________ 54
2.1.5. Digestion de l’ADN par des enzymes de restriction __________________________________ 54
7 Table des matières
2.1.6. Ligation de deux fragments d’ADN ______________________________________________ 54
2.1.7. Clonage « Gateway »__________________________________________________________ 55
2.1.8. Transformation d’ADN plasmidique dans E.coli ____________________________________ 56
2.1.9. Préparation d’ADN plasmidique de bactéries _______________________________________ 57
2.1.10. « Plasmid rescue » dans la levure _______________________________________________ 57
2.1.11. Séquençage d’ADN __________________________________________________________ 58
2.1.12. Analyse d’ADN par hybridation de type Southern Blot ______________________________ 59
2.1.13. Préparation d’ARN __________________________________________________________ 61
2.2. Méthodes de biochimie ____________________________________________________63
2.2.1. Fractionnement sous-cellulaire d’Arabidopsis thaliana________________________________ 63
2.2.2. Purification de mitochondries de tubercules de pomme de terre ou de têtes de chou-fleur _____ 64
2.2.3. Purification de mitoplastes _____________________________________________________ 65
2.2.4. Fractionnement des mitoplastes d’Arabidopsis thaliana _______________________________ 65
2.2.5. Quantification des protéines ____________________________________________________ 65
2.2.6. Concentration des protéines_____________________________________________________ 66
2.2.7. Électrophorèse sur gel de polyacrylamide __________________________________________ 66
2.2.8. Détection des protéines ________________________________________________________ 68
2.2.9. Purification des anticorps ______________________________________________________ 68
2.2.10. Transfert des protéines sur membrane ____________________________________________ 69
2.2.11. Immunodétection ____________________________________________________________ 70
2.3. Méthodes génétiques d’étude des interactions protéiques ________________________70
2.3.1. Interaction de type double hybride Gal4 dans la levure________________________________ 70
2.3.2. Interaction de type double hybride « Split-ubiquitin » dans la levure _____________________ 71
2.3.3. Préparation de levures compétentes à la transformation par choc thermique _______________ 71
2.3.4. Transformation des levures par choc thermique _____________________________________ 71
2.3.5. Obtention des constructions pour le double hybride split-ubiquitin ______________________ 72
2.3.6. Lyse des cellules de levures_____________________________________________________ 73
2.3.7. Test d’interaction double hybride ________________________________________________ 73
2.3.8. Mesure de la force de l’interaction par la quantification de l’activité du gène rapporteur LacZ _ 74
2.3.9. Criblage d’une banque d’ADNc par le système double hybride « split-ubiquitin » __________ 74
2.4. Méthodes d’études génétiques chez Arabidopsis ________________________________76
2.4.1. Extraction d’ADN de plantes____________________________________________________ 76
2.4.2. Transformation d’Arabidopsis par la méthode du « floral dip » _________________________ 76
2.4.3. Stérilisation des graines ________________________________________________________ 77
2.4.4. Observation de graines décolorées _______________________________________________ 77



8 Table des matières
Résultats _________________________________________________________________ 79
1. Le transporteur ABC du système I_________ 79
1.1. Étude de la composition du transporteur ABC par double hybride « split-ubiquitin » 79
1.1.1. Conception des constructions ___________________________________________________ 79
1.1.2. Contrôles du test split-ubiquitin__________________________________________________ 80
1.1.3. Test d’interaction AtCCMA, AtCcmB et AtCcmC ___________________________________ 80
1.2. Étude de la composition du transporteur ABC par double hybride classique ________81
1.2.1. Conception des constructions ___________________________________________________ 81
1.2.2. Construction des plasmides de destination _________________________________________ 83
1.2.3. Contrôles du test d’interaction en double hybride classique ____________________________ 84
1.2.4. Test d’interaction entre AtCCMA et AtCcmB ______________________________________ 85
1.2.5. Test d’interaction entre AtCCMA et AtCcmC ______________________________________ 86
1.2.6. Conclusions _________________________________________________________________ 86
1.3. Étude du complexe protéique comprenant AtCCMA par électrophorèse de type bleu
natif 87
1.3.1. Détection d’AtCCMA _________________________________________________________ 87
1.3.2. Détection d’AtCcmB __________________________________________________________ 87
1.3.3. Caractérisation du complexe protéique de 480 kDa __________________________________ 88
1.4. Étude in vivo de AtCCMA__________________________________________________89
1.4.1. Identifications des mutants Atccma_______________________________________________ 89
1.4.2. Analyse des locus d’insertion ___________________________________________________ 90
1.4.3. Analyse de la ségrégation ______________________________________________________ 91
1.4.4. Analyse du nombre d’insertion par Southern blot ____________________________________ 93
1.4.5. Observation des siliques des plantes hétérozygotes___________________________________ 94
1.4.6. Complémentation des mutants Atccma ____________________________________________ 95
1.5. Conclusions ______________________________________________________________96
2. Les interactions entre protéines AtCcmC et AtCCME impliquées dans la voie de
livraison de l’hème_________________________________________________________ 97
2.1. Conception des constructions _______________________________________________97
2.2. Contrôles du test d’interaction ______________________________________________98
2.3. Résultats ________________________________________________________________99
2.4. Conclusions _____________________________________________________________100


9

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