UMR S Développement et Physiopathologie

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
UMR_S 682 Développement et Physiopathologie de l'Intestin et du Pancréas Michèle Kedinger Directeur Discipline : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur Strasbourg I Recherche du rôle de la chaîne ?5 de laminine dans l'intestin normal et pathologique par Léa RITIÉ-PERTUSA Soutenue publiquement le 6 mai 2008 Membres du Jury Directeur de thèse : Rapporteur interne : Rapporteur externe : Rapporteur externe : Examinateur : Dr. Patricia SIMON-ASSMANN Dr. Serge POTIER Dr. Florence RUGGIERO Dr. Sylvie DUFOUR Dr. Philippe CARDOT DR2 CNRS Professeur DR2 CNRS DR2 CNRS Professeur INSERM U682 Strasbourg UMR 7156 ULP Strasbourg IBCP-UMR 5086 Lyon UMR 144 Institut Curie Paris INSERM U505 Paris

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Publié le : jeudi 1 mai 2008
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Source : scd-theses.u-strasbg.fr
Nombre de pages : 241
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UMR_S 682 Développement et Physiopathologie de l’Intestin et du Pancréas
Michèle Kedinger Directeur
http://u682-inserm.u-strasbg.fr
Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l’Université Louis Pasteur Strasbourg I
Discipline : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie
par Léa RITIÉ-PERTUSA
Recherche du rôle de la chaîneα5 de laminine dans l’intestin normal et pathologique
Membres du Jury
Directeur de thèse : Dr. Patricia SIMON-ASSMANN Rapporteur interne : Dr. Serge POTIER Rapporteur externe : Dr. Florence RUGGIERO Rapporteur externe : Dr. Sylvie DUFOUR Examinateur : Dr. Philippe CARDOT
Soutenue publiquement le 6 mai 2008
DR2 CNRS Professeur DR2 CNRS DR2 CNRS Professeur
INSERM U682 Strasbourg UMR 7156 ULP Strasbourg IBCP-UMR 5086 Lyon UMR 144 Institut Curie Paris INSERM U505 Paris
A mes parents, A mon Amour Nicolas,  A mon petit cœur Jeanne,
Remerciements Je remercie en premier lieu les membres du jury, Mr Serge Potier, Mme Sylvie Dufour, Mme Florence Ruggiero et Mr Philippe Cardot, de m’avoir fait l’honneur d’accepter de juger mon travail de thèse. Je remercie ensuite Michèle Kedinger, directrice de cette belle Unité INSERM 682, de m’avoir permis de réaliser ma thèse au sein de son laboratoire, de m’avoir soutenue tout au long de ce projet et d’avoir toujours pris le temps de me donner avis et conseils avisés. Merci à Patricia pour m’avoir encadrée pendant ma thèse, d’avoir toujours été là pour moi malgré les épreuves difficiles. Merci pour tous les conseils apportés, pour l’aide précieuse que tu m’as apportée en me transmettant ton savoir scientifique et en m’épaulant pour la veille bibliographique ! Merci aussi de m’avoir permis de participer à plusieurs congrès internationaux. Je te suis reconnaissante de m’avoir fait confiance et d’avoir accepté mon investissement dans d’autres projets comme l’enseignement ou l’organisation de BIOTechno. Et je ne rencontrerai pas de sitôt quelqu’un d’aussi, et même plus, chipoteur et perfectionniste que moi ! Merci à Anne-Laure, d’avoir guidé mes premiers pas dans la recherche. Merci à Olivier, le Grand, « papa » pour les intimes (vous devinez le reste de la famille), tout d’abord pour m’avoir initiée et conseillée en BM. J’ai apprécié de partager ma calculatrice, agrafeuse, troueuse avec toi. Je garderais toujours un bon souvenir de l’époque des parties de bad, des tartes flambées à l’Ange, des bières en terrasse... Et aussi de tes blagues rigolotes et autres taquineries, et de ton grand cœur au quotidien. Mais surtout je te suis infiniment reconnaissante de m’avoir toujours avertie quand j’avais (ou même pas) ma braguette ouverte ! Un petit passage en Bioch (c’était bon les petites pauses du côté de chez vous) pour dire à Jean-François que j’ai apprécié nos nombreuses discussions, presque philosophiques, sur le monde de la recherche et son avenir et sur mon avenir perso. Merci aussi à Patrick, mon très cher maître de biochimie, qui a toujours été enthousiaste pour répondre à mes nombreuses et ô combien compliquées questions, pour les dépannages en tout genre (timer, souris, voiture, chewing gum, carte de cantine, crème pour les mains…) Merci pour toute l’énergie que vous m’avez donnée en me proposant toujours du chocolat et du café ! Maintenant un petit passage au poulailler. Ah ! Que ça fait du bien un petit thé et des petites gourmandises réconfortants, un peu de ragotage et des ballades imaginaires. Claire, Elisabeth, Marie, Annick, Isabelle, Léo, vous êtes vraiment les plus merveilleuses des poulettes ! Je ne vous remercierais jamais assez de m’avoir supportée au quotidien (non, mais alors qu’est-ce que vous en pensez, c’est mieux des tables rondes ou carrées ???) et pour votre aide précieuse pour l’organisation de mon mariage et aussi pour votre merveilleuse chanson qui restera à jamais gravée dans mon cœur (et Yannick au pipeau !). On n’a pas eu le temps de se faire beaucoup de CacoFolies cette année. C’est que partie remise. Spéciale dédicace à Tati Annick, pour avoir créer avec moi la chorale de la paillasse, pour m’avoir prêté main forte pour les dures heures à l’animalerie, pour avoir vérifié entre 2 pcr s’il y a pas un vol moins cher pour mes vacances, pour les dissections, les dissociations, et l’aide pour les manips cette dernière année.
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Merci A Léo d’être quand même toujours venue à mon secours pour mes pannes et questions informatiques. Et d’avoir été là pour me communiquer les scoops ! Tu le feras toujours par mail, hein ? A Isabelle, pour les conseils en orthographe et surtout les bons gateaux !! A Christiane d’avoir toujours été de bon conseil pour l’histo et la culture cell et aussi pour les manips de microscopie électronique. A Pascal d’être souvent venu me faire un petit coucou. A Michèle Lavogez, Fanny et Pierre pour l’animalerie. A Isa de m’avoir toujours montré avec enthousiasme ses achats aux soldes et de m’avoir fait partagé sa passion pour les voyages et la recherche. De te voir, c’est toujours motivant. A Fairouz, pour sa gentillesse ; je te souhaite bon vent. Aux autres « chefs » Jean-Noël, Gérard, Marie-Pierre qui m’ont donné le goût du savoir. A mes « stagiaires », David, Anne-Sophie et Joël d’avoir participé à mon projet. Mélanie, ma préférée ! Merci pour ta bonne humeur, et pour les délicieuses séances de massages et de réflexologie, pour tous les petits délires. Tu m’as toujours trop fait rire. Tu m’as bien manqué ces derniers temps et tu resteras toujours à l’intérieur de mon cœur ! Alex, mon préféré ! Merci pour ton amitié dès mon arrivée au labo, pour les pauses terrasses en été ou canapé en hiver, pour les petits verres (quand j’avais encore le temps de sortir !), et toutes nos discussions sur le monde et la vie. C’est plus pareil depuis que vous êtes plus là. Une pensée pour les anciens. Natacha, qui m’a donné envie de venir dans ce labo, Cécé, ton humour était trop court! Et rappelles- toi : l’important, c’est de toujours finir artistiquement ! Les GG qui nous ont quittés. Je m’attends toujours à vous apercevoir en passant devant le bureau et à partager 2 mots avec Georg, petit Olivier, Christophe, Anthony, Viviane et même Josselin ! Mercé, merci d’avoir gentiment supporté pendant au moins un an mes Holà ! Que tal ? Qui, en fait, ne te faisaientt même pas plaisir. Nath, pour les bons moments partagés et notamment cette magnifique organisation de BIOTechno. Marjorie et Carole pour avoir partagé avec moi les plus beaux projets de développement qui existent. Un clin d’œil à l’ex bureau 316. Fabien, merci pour les bonbons Haribo (mais qu’est-ce que j’ai pu manger dans ce labo !) IVO, super réalisateur sarcastique, ah ! C’était sympa de résoudre tes énigmes en manipulant ! Tu as fini par me faire accrocher à ton humour noir. Ca va même me manquer, j’te jure ! Surtout ton côté acrimonieux. On ira manger au tire-bouchon des fois hein ? Caro, merci de m’avoir toujours fait partager ton thé ! J’en ai une grosse dette! Merci pour tes coups de main pour les manips de dernière minute. Je te souhaite le meilleur pour ta thèse. ème Un petit coucou aux locataires du 3 , Dominique, Erwan, Céline, Nadine, Mathilde, Eric. : Merci pour les discussions volées quand j’arrivais trop tard au café ! parfois psychadéliques, hein Dominique ! A Erwan aussi pour tes conseils œnologiques et autres, c’est toujours passionnant d’écouter tes explications. Eh ! Je passe ma thèse avant toi finalement ! Une petite attention pour les nouveaux venus avec qui je n’ai pas eu beaucoup le temps de parler et c’est dommage.
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Je remercie tous ceux avec qui mes rapports furent aussi divers qu’enrichissants et tous ceux qui ont compensé le manque de soleil à l’intérieur du labo de par leur bonne humeur. Je sors du labo pour dire un petit mot à mes collègues enseignants, notamment Marc, Marie-Aline, Vincent, Emilie, Sophie, Angélique, bien sûr Joern, et tous les autres…On a passé de bons moments en TP pendant ces 4 années. Faudrait continuer les petites soirées moniteurs. Je remercie aussi très fort mes 2 chères amies de fac et de toujours, Virginie et Rim, qui ont fait que toutes ses années d’études restent un merveilleux souvenir. Du fond du cœur merci à Papa et Maman pour tout ce que vous m’avez donné et me donnez toujours. Je vous aime. Et le meilleur pour la fin ! Merci à toi mon Amour adoré d’être à mes côtés, de me donner tant de joies et d’amour. Merci pour tout ce qu’on partage. Tu as aussi contribué à mon projet de thèse car même si ça t’endormait vite quand j’en parlais, tu m’as apporté un soutien moral, le recul et l’épanouissement qui sont nécessaires pour un bon travail. Je t’en remercie et je t’aime. La vie avec toi et notre petit petit ange est merveilleuse. Ce travail de thèse a été financé par le Ministère de la Recherche et de L’Enseignement Supérieur, par l’Université Louis Pasteur de Strasbourg et par l’Association pour la Recherche sur le Cancer.
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Qui ne connaît pas la folie ne peut être sage. Un sourire coûte moins cher que l’électricité mais il donne autant de lumière. [Abbé Pierre] (Deux citations qui me correspondent)
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Sommaire Rôle de la chaîneα5 de laminine dans l’intestin normal et pathologique Liste des abréviations INTRODUCTION I.L’intestin A. Anatomie et structure histologique B. Fonctionnement physiologique de l’intestin 1. Fonction digestive a) Digestion intraluminale b) Digestion à la surface des entérocytes et absorption c) Elimination des résidus et fonction digestive du côlon 2. Défense de l’organisme 3. Fonction endocrinienne 4. Homéostasie intestinale par renouvellement cellulaire 5. Contrôle de la motricité intestinale C. Développement de l’intestin 1. Selon l’axe crânio-caudal 2. Selon l’axe crypto-villositaire 3. Mise en place du système nerveux 4. Régulation moléculaire de la morphogenèse intestinale a) Régulation extrinsèqueb) Régulation intrinsèque c) Importance des interactions épithélio-mésenchymateusesII. Les laminines, éléments clés des lames basales A. Généralités sur la lame basale B. Les lames basales intestinales C. Les laminines 1.Structure a) Domaine G b) Domaines I et II c) Domaines III et V d) Domaines IV e) Domaines VI 2. Expression tissulaire et implications physiologiques et pathologiques 3. Les laminines dans l’intestin a) Laminine-111 et -121 b) Laminine-211 et -221 c) Laminine-311 et -332 d) Laminine-411 et -421 e) Laminine-511, -521 et -522 III. La chaîneα5 de laminine A. Le gène Lama5 B. Profil d’expression de la chaîneα5 de laminine
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C. Modèles murins d’étudein vivo 1. Invalidation génique de la chaîneα5 2. Lama5 « trap » 3. Souris transgénique exprimant une chaîneαchimérique 4. Souris exprimant un allèle hypomorphe de la chaîneα5 5. Invalidation conditionnelle de la chaîneα5 dans le poumon 6. Souris transgénique sur-exprimant la chaîneα5 D. Etudesin vivodes fonctions biologiques de la chaîneα5 1. Syndactylie 2. Exencéphalie 3. Dysmorphogenèse placentaire 4. Défauts de la morphogenèse rénale 5. Défauts du développement pulmonaire 6. Défauts de morphogenèse des glandes salivaires 7. Défauts du développement dentaire 8. Défauts de morphogenèse des follicules pileux 9. Défaut de migration des cellules de la crête neurale 10. Implication dans le système nerveux central 11. Phénotype intestinal des souris Lama5-/-E. Implications de la chaîneα5 de laminine dans des pathologies IV. Les récepteurs de la chaîneα5 de laminine A. Les intégrines B. Le dystroglycane C. Les syndécanes D. Le Luthéran E. Domaines de liaison de la chaîneα5 avec ses récepteurs 1. Sites d’interaction sur le domaine G de la région COOH-terminale 2. Sites d’interaction au niveau NH2-terminal 3. Sites d’interaction du domaine IVa OBJECTIFS DU PROJET DE DOCTORAT RESULTATS
38 38 38 39 40 40 40 41 41 42 42 44 46 48 48 50 51 51 52 55 55 56 58 60 61 62 62 62 64 65 69 :Recherche des gènes cibles et des voies de signalisation régulés par la chaîneα5 de 70 72 72 76 77 77 78 81 82 85 85
Partie 1 laminine et détermination de son rôle biologique dans l’intestin I.Base du travail II. Résumé des résultats III. Eléments de Matériels et Méthodes A. Techniques relatives à l’hybridation différentielle sur puce à ADNc 1. Mise au point d’un protocole d’extraction d’ARN total d’intestin embryonnaire 2. Personnalisation des puces à ADNc 3. Constitution des puces à ADNc 4. Expérience de « microarray » ou hybridation différentielle sur puce à ADN B. Modèles de culture cellulaire et applications 1. Mise en place de modèles cellulaires
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a) Modèles embryonnaires85 b) Modèles de cellules matures85 2. Applications 88 a) Description du système TOPFLASH88 b) Transfection cellulaire et lecture de la luminescence88 C. Technique d’immunoprécipitation de chaîne de laminine 89 IV. Publication 1 : Identification of lamininα5 gene signature in developing intestine 90 V. Résultats complémentaires 127 A. Analyse transcriptomique : « clustering » des gènes sortis lors de la première étape de sélection 129 B. Relation laminine-511 – voie Wnt 129 1. Etude de la régulation de la voie Wnt par la laminine-511in vitrodans les cellules intestinales 129 2. Analyse de l’expression de Wnt10b et Fzd2 dans les bourgeons dentaires de souris Lama5-/- 131 C. Relation Laminine-511 – voie Akt 133 1. Analyse de l’expression et de l’activation d’Aktin vivo dans les deux compartiments tissulaires de l’intestin embryonnaire 133 2. Analyse de l’expression et de l’activation d’Aktin vitroles cellules dans intestinale matures 133 a) Akt est spécifiquement activé par la laminine-511133 b) Analyse de l’expression de PTEN dans les cellules intestinales cultivées sur laminine-511 135 c) Recherche du récepteur membranaire impliqué dans l’activation d’Akt par la laminine-511 135 d) Recherche des substrats activés en aval de l’activation d’Akt par la laminine-511 137 D. Détermination du rôle cellulaire de la chaîneα5 138 1. Confirmation du rôle de la laminine-511 dans la survie des cellules épithéliales intestinales par d’autres techniques 138 2. Détermination du rôle cellulaire de la chaîneα5 de laminine dans les cellules mésenchymateuses de l’intestin embryonnaire 139 E. Identification d’une nouvelle isoforme de laminine dans l’intestin 140 VI. Discussion des résultats 142 Partie 2 : L’inactivation génique d’un récepteur de la chaîneα5 de laminine, le Luthéran, engendre des anomalies rénales et intestinales chez la souris 148 I. Base du travail 149 II. Résumé des résultats 149 III. Publication 2 : Genetic inactivation of the lamininα5 chain receptor Lu/BCAM leads to kidney and intestinal abnormalities in the mouse. 150 IV. Résultats complémentaires 166 A. Détail de l’analyse des paramètres généraux corporels, physiologiques et biochimiques 167 B. Analyse de la fonction musculaire 170
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V. Discussion des résultats 172 Partie 3 : Caractérisation d’anomalies d’expression de la chaîneα5 de laminine dans la maladie de Hirschsprung 175 I. Base du travail 177 II. Résumé des résultats 177 III. Publication 3 : The expression pattern of laminin isoforms in Hirschsprung disease reveals a distal peripheral nerve differentiation 179 IV. Discussion des résultats 191 Partie 4 : Analyse de l’expression de la chaîneα1945 de laminine dans les carcinomes coliques I. Introduction sur les cancers colorectaux et base du travail 196 II. Résultats 201 A. Expression de la chaîneα5 dans l’adénocarcinomein situ 201 B. Expression de la chaîneα5 dans l’adénocarcinome envahissant la sous muqueuse 201 C. Expression de la chaîneα2015 dans les adénocarcinomes envahissant la musculeuse D. Expression de la chaîneα2025 dans les adénocarcinomes envahissant la séreuse E. Expression de la chaîneα5 dans l’adénocarcinome envahissant le péritoine 202 III. Discussion des résultats 208 Partie 5 : Identification des facteurs de transcription essentiels à la différenciation épithéliale de l’intestin 210 I. Résumé des résultats 211 II. Publication 4 : Metabolome, transcriptome, and bioinformatic cis-element analyses point to HNF-4 as a central regulator of gene expression during enterocyte differentiation 212 DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES 228 I. Rôle de la chaîneα2295 de laminine dans l’intestin normal A. Rôle dans la morphogenèse intestinale 229 B. Rôle dans la différenciation des cellules intestinales 229 1. Rôle dans la différentiation tardive des entérocytes 229 2. Rôle dans la différenciation des cellules musculaires lisses 231 C. Rôle dans la prolifération des cellules intestinales 231 D. Rôle dans la survie des cellules intestinales 232 E. Rôle dans la migration des cellules épithéliales 233 II. Rôle de la chaîneα2335 de laminine dans l’intestin pathologique A. Dérégulation de la chaîneα5 dans la maladie de Hirschsprung 233 B. Dérégulation de la chaîneαles cancers colorectaux 5 dans 234 III. Perspectives 235
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REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 237 ANNEXES 251 Annexe 1 : Liste des gènes sur-exprimés dans au moins 2 échantillons d’intestins Lama5-/-sur 4 analysés (première étape de sélection) 252 Annexe 2 : Liste des gènes sous-exprimés dans au moins 2 échantillons d’intestins Lama5-/-sur 4 analysés (première étape de sélection) 256 Annexe 3 : Liste des publications et communications 261 Annexe 4 : Nouveau Chapitre de la Thèse : Valorisation des compétences 264
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