Université Louis Pasteur de Strasbourg

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
Université Louis Pasteur de Strasbourg Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé THÈSE Présentée pour le grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR Discipline : aspects moléculaires et cellulaires de la biologie Spécialité : pharmacologie cellulaire et moléculaire par Sabrina DANILIN Les protéines de stabilisation des ARN messagers de la protéine apparentée à l'hormone parathyroïdienne (PTHrP) : identification et impact sur la croissance du carcinome à cellules rénales Soutenue publiquement le 19 décembre 2008 devant les membres du jury Docteur Thierry MASSFELDER CR INSERM, Strasbourg Directeur de thèse Professeur Alain DOUCET DR CNRS, Paris Rapporteur externe Professeur Jean-Jacques PATARD PUPH, Rennes Rapporteur externe Professeur Jean-Pierre BERGERAT PUPH, Strasbourg Rapporteur interne

  • acide désoxyribonucléique complémentaire

  • nuclear factor ?b

  • protéine apparentée

  • growth factor

  • factor

  • protéines de stabilisation des arn messagers

  • glucocorticoïde responsive

  • phosphate-buffered saline

  • jury de thèse


Publié le : lundi 1 décembre 2008
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Source : scd-theses.u-strasbg.fr
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Université Louis Pasteur de Strasbourg
Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé

THÈSE
Présentée pour le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR
Discipline : aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
Spécialité : pharmacologie cellulaire et moléculaire
par
Sabrina DANILIN


Les protéines de stabilisation des ARN messagers de
llllaaaa pppprrrroooottttééééiiiinnnneeee aaaappppppppaaaarrrreeeennnnttttééééeeee àààà llll’’’’hhhhoooorrrrmmmmoooonnnneeee ppppaaaarrrraaaatttthhhhyyyyrrrrooooïïïïddddiiiieeeennnnnnnneeee
(PTHrP) : identification et impact sur la croissance du
carcinome à cellules rénales




Soutenue publiquement le 19 décembre 2008
devant les membres du jury

Docteur Thierry MASSFELDER CR INSERM, Strasbourg Directeur de thèse
Professeur Alain DOUCET DR CNRS, Paris Rapporteur externe
Professeur Jean-Jacques PATARD PUPH, Rennes Rapporteur externe
Professeur Jean-Pierre BERGERAT PUPH, Strasbourg Rapporteur interne Abréviations
A : Adénine
ADNc : Acide Désoxyribonucléique complémentaire
AhR : Aryl hydrocarbon Receptor
ARNm : Acide Ribonucléique messager
ARNT : Arylhydrocarbon Receptor Nuclear Translocator
AUF-1 : A+U-rich-element RNA-binding factor 1
ATCC : American Type Culture Collection
ATP : Adénine TriPhosphate
BHD : Birt-Hogg-Dube
bNLS : bipatite Nuclear Localisation Signal
C : Cytidine
CAIX : Anhydrase Carboxylase IX
CCC : Carcinome rénal à Cellules Conventionnelles
CCR : Carcinome à Cellules Rénales
CMLV : Cellules Musculaires Lisses Vasculaires
CRE : cAMP Responsive Element
CTAD : C-terminal Transactivation Domain
CTP : Cytidine TriPhosphate
DEPC : Diéthyl PyroCarbonate
DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DNase : Désoxyribonucléase
dNTP : Désoxy Nucléotides TriPhosphate
DO : Densité Optique
DTT : dithiothreitol
EDTA : Acide éthylènediamine-tétracétique
EGF : Epidermial Growth Factor
EMEA : European Medecine Evaluation Agency
EPO : Erythropoïetine
E.S.M : Ecart Standard à la Moyenne
FBS : Fœtal Bovin Serum
FDA : Food and Drug Administration
FH : Furamate Hydratase
GAPDH : Glyceraldéhyde Phosphate Deshydrogénase
1
G : Guanine
GRE : Glucocorticoïde Responsive Element
GTP : Guanine TriPhosphate
HIF : Hypoxia Induced Factor
hnRNP L : heterogeneous nuclear Ribonucleoprotein L
HRE : Hypoxia Responsive Element
IGF : Insuline-like Growth Factor
IL-2 : Interleukine-2
INF-α : Interferon α
KDa : Kilo Dalton
MDR : Multi Drug Resistance
MEC : Matrice Extra Cellulaire
MVD : Densité MicroVasculaire
mTOR : mammalian Target Of Rapamycin
NF-κB : Nuclear Factor κB
NTAD : N- terminal TransActivation Domain
pb : paires de bases
PBS: Phosphate-Buffered Saline
PCR : Réaction de Polymérisation en Chaine
PDGF : Platelet-Derived Growth Factor
PHD : HIF-specific Prolyl Hydroxylase Domain
PMSF: Fluorure de PhénylMéthyl Sulfonyl
PTH : Parathyroid Hormone
PTHrP : Protéine apparentée à l’hormone parathyroïdienne
pTNM : pathologic Tumor Node Metastase
rNTP : riboNucléotides TriPhosphate
RCPG : Récepteurs Couplés aux Protéines G
RPTH1 : Récepteur PTH/PTHrP 1
RRM : RNA Recognition Motif
RT : Transcription Reverse
SABG : Senescence-Associated β-galactosidase
SAHF : Senescence-Associated Heterochromatic Foci
SDS : Sodium DodecylSulfate
SRE : Serum Responsive Element
SSC : Standard Sodium Nitrate
2
TBS : Tris-Buffered Saline
TGF: Tumor Growth Factor
TSC : Tuberous Sclerosis Complex
TTP : Tristetraproline
U : Uracyle
UTP : Uracyle TriPhosphate
UTR : Région non Traduite
UV : Ultra Violets
VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor
VHL : Von Hippel-Lindau


3
Remerciements


Je tiens à remercier le Dr Thierry Massfelder, pour m’avoir accompagnée tout au long de mes
travaux en tant que Directeur de thèse. Je le remercie également pour ses précieux conseils, sa
disponibilité et sa bonne humeur.

Merci au Docteur Jean-Jacques Helwig pour m’avoir accueillie au sein de son laboratoire et
pour avoir toujours porté un grand intérêt à mes travaux.

Je tiens également à remercier les Professeurs Alain Doucet, Jean-Jacques Patard et Jean-
Pierre Bergerat pour avoir accepté de faire partie des membres de mon jury de thèse.

Un merci particulier à tous les autres membres du laboratoire, présents et passés, que j’ai
côtoyés avec joie et dont l’esprit d’entraide et la bonne humeur quotidienne m’ont permis de
mener à terme ce projet dans les meilleures conditions.

Merci enfin à tous les membres de ma famille, ainsi qu’à mes amis pour m’avoir soutenue et
encouragée dans les moments difficiles. Une mention particulière pour Carole, Marie-
Charlotte et Nathalie qui ont toujours été là pour m’aider.


4
Sommaire
Abréviations ___________________________________________________________ 1
Remerciements _________________________________________________________ 4
SSSSoooommmmmmmmaaaaiiiirrrreeee ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 5555
Chapitre 1 : Introduction bibliographique _________________________________________ 9
1- Le carcinome à cellules rénales ____________________________________________ 10
1.1 Epidémiologie du cancer du rein _________________________________________ 10
1.1.1 Epidémilogie descriptive ___________________________________________ 10
1.1.2 Classification ___________________________________________________ 11
1.1.3 Facteurs de risques _______________________________________________ 11
1.2 Génétique et classification _____________________________________________ 13
1.2.1 La classification d’Heidelberg _______________________________________ 13
1.2.2 Gènes suppresseurs de tumeurs et oncogènes ______________________________ 14
1.2.3 Altérations épigénétiques ___________________________________________ 16
1.3 Les marqueurs pronostiques ____________________________________________ 17
1.3.1 Cliniques ______________________________________________________ 17
1.3.2 Histologiques ___________________________________________________ 18
1.3.3 Biomoléculaires _________________________________________________ 19
1.4 Thérapies _________________________________________________________ 20
1.4.1 CCR localisés : la chirurgie __________________________________________ 20
1.4.2 CCR métastatiques _______________________________________________ 21
2- CCC et VHL : une étroite corrélation _______________________________________ 25
2.1 La maladie de von Hippel-Lindau ________________________________________ 25
2.2 Le VHL __________________________________________________________ 26
2.2.1 Un gène suppresseur de tumeur_______________________________________ 26
2.2.2 Structure du gène ________________________________________________ 27
2.2.3 pVHL ________________________________________________________ 27
2.2.4 Le complexe de polyubiquitination ____________________________________ 28
2.3 Le système VHL/HIF ________________________________________________ 29
2.3.1 Les facteurs HIF ________________________________________________ 29
2.3.2 Mécanisme moléculaire ____________________________________________ 31
5
2.3.3 Cibles du système ________________________________________________ 31
2.4 Autres rôles du VHL _________________________________________________ 32
2.4.1 Interactions avec la matrice extracellulaire et le cytosquelette __________________ 33
2.4.2 Autres fonctions _________________________________________________ 34
2.4.3 pVHL et sénescence ______________________________________________ 35
3333---- LLLLaaaa pppprrrroooottttééééiiiinnnneeee aaaappppppppaaaarrrreeeennnnttttééééeeee àààà llll’’’’hhhhoooorrrrmmmmoooonnnneeee ppppaaaarrrraaaatttthhhhyyyyrrrrooooïïïïddddiiiieeeennnnnnnneeee (P(P(P(PTTTTHHHHrrrrPPPP)))) ________________________________________________________________________________________ 33336666
3.1 Son gène__________________________________________________________ 36
3.1.1 Structure ______________________________________________________ 36
3.1.2 Produits ______________________________________________________ 37
3.1.3 Régulation _____________________________________________________ 37
3.2 La protéine ________________________________________________________ 38
3.2.1 Une polyprotéine aux rôles divers _____________________________________ 39
3.2.2 Une cytokine ___________________________________________________ 41
3.3 PTHrP et cancers ___________________________________________________ 43
3.3.1 PTHrP et survie cellulaire __________________________________________ 44
3.3.2 PTHrP et invasion _______________________________________________ 45
3.3.3 Expression de la PTHrP dans les cancers ________________________________ 45
3.4 PTHrP et CCC _____________________________________________________ 46
3.4.1 Un facteur de survie ______________________________________________ 46
3.4.2 Un facteur antiangiogénique ________________________________________ 47
3.4.3 Une cible du VHL _______________________________________________ 47
4- La stabilité des ARN messagers ___________________________________________ 49
4.1 Un mécanisme majeur de régulation post-transcriptionnelle ______________________ 49
4.2 Mécanisme de cette régulation __________________________________________ 50
4.2.1 Les éléments en cis _______________________________________________ 50
4.2.2 Les facteurs agissant en trans _______________________________________ 51
4.2.3 Interaction des éléments cis et trans ___________________________________ 52
4.3 Gènes régulés par les ARE et mécanismes de régulation _________________________ 53
4.4 Pertinence clinique : stabilité des ARNm et cancer. ____________________________ 54
5- Objectifs___________________________________________________________ 56
Chapitre 2 : Matériel et Méthodes _____________________________________________ 57
1 - Matériel __________________________________________________________ 58
6
1.1 Lignées cellulaires ___________________________________________________ 58
1.2 Tissus ___________________________________________________________ 58
2- Etude de l’expression des ARNm__________________________________________ 59
2.1 Extraction des ARNm ________________________________________________ 59
2.2 Transcription reverse _________________________________________________ 59
2.3 Quantification des ARNm _____________________________________________ 60
2.3.1 Etude de l’expression relative des cibles : PCR semi quantitative en temps réels _____ 60
2.3.2 Etude du profil d’expression des isoformes de la PTHrP : PCR quantitative en temps réels
________________________________________________________________ 60
3- Recherche des protéines de liaison à l’ARNm de la PTHrP _________________________ 61
3.1 Génération des sondes ARN ____________________________________________ 61
3.2 Transcription in vitro ________________________________________________ 62
3.3 UV cross-linking ARN-protéines ________________________________________ 63
3.4 Purification des complexes _____________________________________________ 63
3.5 SDS-PAGE et révélation ______________________________________________ 64
4- Etude de l’expression protéique ___________________________________________ 65
4.1 Extraction des protéines _______________________________________________ 65
4.1.1 Protéines totales _________________________________________________ 65
4.1.2 Protéines nucléaires-cytoplasmiques ___________________________________ 65
4.2 Western blot _______________________________________________________ 66
4.3 Elisa ____________________________________________________________ 67
5- Etude de l’inhibition de HuR sur la croissance cellulaire __________________________ 67
5.1 In vitro __________________________________________________________ 67
5.1.1 Transfection des cellules par siARN ___________________________________ 67
5.1.2 La densité cellulaire ______________________________________________ 68
5.1.3 La prolifération cellulaire __________________________________________ 68
5.1.4 La mort cellulaire induite __________________________________________ 68
5.2 In vivo___________________________________________________________ 69
5.2.1 Le modèle de souris nude xénogréffée. __________________________________ 69
5.2.2 Mesure de la prolifération cellulaire ___________________________________ 69
5.3.3 Mesure de la mort cellulaire induite ____________________________________ 70
5.2.4 Mesure de la vascularisation ________________________________________ 70
7
6- Statistiques ________________________________________________________ 70
CCCChhhhaaaappppiiiittttrrrreeee 3333 : : : : EEEEttttuuuuddddeeee ddddeeee llll’’’’eeeexxxxpppprrrreeeessssssssiiiioooonnnn eeeetttt ddddeeee llllaaaa ssssttttaaaabbbbiiiilllliiiissssaaaattttiiiioooonnnn ddddeeeessss AAAARRRRNNNNmmmm ddddeeee llllaaaa PPPPTTTTHHHHrrrrPPPP ____________________________________________________ 77771111
1- Publication _______________________________________________________ 72
1- Résumé _________________________________________________________ 98
2222---- DDDDiiiissssccccuuuussssssssiiiioooonnnn ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 99999999
Chapitre 4 : Etude de l’implication de la protéine stabilisatrice des ARNm HuR sur la survie du CCC
humain ______________________________________________________________ 102
1111---- RRRRééééssssuuuummmméééé ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 111100003333
2- Introduction _______________________________________________________ 104
3- Résultats _________________________________________________________ 105
Expression et localisation sub-cellulaire de HuR dans les lignées cellulaires et tissus de CCC
humain. ____________________________________________________________ 105
Effet de l’inhibition de HuR sur la prolifération cellulaire _________________________ 106
Effet de l’inhibition de HuR sur la mort cellulaire induite. ________________________ 106
Effet de l’inhibition intratumorale de HuR dans le CCC humain in vivo _______________ 107
Effet de l’inhibition de HuR sur l’expression des cibles en aval in vitro et in vivo _________ 107
4- Discussion ________________________________________________________ 108
Chapitre 5 : Conclusion générale et perspectives ___________________________________ 120
CCCChhhhaaaappppiiiittttrrrreeee 6666 :R:R:R:Rééééfffféééérrrreeeennnncccceeeessss bbbbiiiibbbblllliiiiooooggggrrrraaaapppphhhhiiiiqqqquuuueeeessss ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 111122224444
Chapitre 7 : Annexes _____________________________________________________ 142
Résumé en français ____________________________________________________ 143
RRééssuumméé eenn aannggllaaiiss __________________________________________________________________________________________________________ 114444 RRééssuumméé eenn aannggllaaiiss __________________________________________________________________________________________________________ 114444
Publications _________________________________________________________ 145
Posters et communications _______________________________________________ 146



8

Chapitre 1 : Introduction
bibliographique
9

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