Contribution à l'étude de la voie de signalisation GSK3/Shaggy chez les plantes Fonction biologique des GSK3/Shaggy like kinases

Gaëlle Claisse

Description

Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Science de la Vie et de la Terre MEMOIRE EPHE Présenté par Gaëlle CLAISSE Pour l'obtention du diplôme de EPHE Période octobre 2002 - juin 2005 Contribution à l'étude de la voie de signalisation GSK3/Shaggy chez les plantes Fonction biologique des GSK3/Shaggy like kinases AtSK31 et AtSK32 : étude par mutagenèse dirigée, chez A. thaliana Soutenu le 07 novembre 2005 devant le jury suivant : Président du jury : Mme Sophie THENET Rapporteur : Mme Flore RENAUD-PAÏTRA Examinateurs : Mme Michèle CREN Mr Martin KREIS Mme Christiane LAURIÈRE Laboratoire de Génétique Moléculaire et Physiologique Laboratoire de Biologie Cellulaire, CNRS FRE 2445 45, Avenue des Etats-Unis 78035 Versailles cedex Laboratoire de Biologie du Développement des Plantes Université Paris-Sud, Institut de Biotechnologie des Plantes (IBP), UMR CNRS 8618, Bat. 630 91405 Orsay cedex ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Science de la Vie et de la Terre Directeur EPHE : Mr Bernard Mignotte (PR) Mme Flore Renaud-Païtra (MC) Directeur de recherche : Mr Martin Kreis (PR) Mme Bénédicte Charrier (CR) EPHE Banque de Monographies SVT 1

• vitro par pcr


• vitro de l'activité de phosphorylation des protéines atsk32s………


• gènes atsk31


• production de protéines recombinantes


• test d'activité kinase


• voie de signalisation brs…………………………………………


• edta edta


• kinase


• acide orthophosphorique

Sujets

• Haims
• United States
• Institut de biotechnologie des plantes
• Laurière
• Charrier
• Claisse

Informations

• Publié par: chaeh
• Publié le: 01 novembre 2005
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Extrait

MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE   ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Science de la Vie et de la Terre   MEMOIRE EPHE   Présenté par Gaëlle CLAISSE   Pour l’obtention du diplôme de EPHE Période octobre 2002 - juin 2005     Contribution à l’étude de la voie de signalisation GSK3/Shaggy chez les plantes   Fonction biologique des GSK3/Shaggy like kinases AtSK31 et AtSK32 : étude par mutagenèse dirigée, chezA. thaliana     Soutenu le 07 novembre 2005 devant le jury suivant :   Président du jury : Mme Sophie THENET Rapporteur : Mme Flore RENAUD-PAÏTRA Examinateurs : Mme Michèle CREN Mr Martin KREIS Mme Christiane LAURIÈRE                                                                                                                               Direct ur EPHE : Laboratoire de Génétique Moléculaire et Physiologique Mr Be e rnard Mignotte (PR) Laboratoire de Biologie Cellulaire, CNRS FRE 2445 45, Avenue des Etats-Unis ( M M m C e )  Flore Renaud-Païtra 78035 Versailles cedex  [e-mail]      Directeur de recherche :   Mr Martin Kreis (PR) [e-mail] Mme Bénédicte Charrier (CR) Laboratoire de Biologie du Développement des Plantes Université Paris-Sud, Institut de Biotechnologie des Plantes (IBP), UMR CNRS 8618, Bat. 630 91405 Orsay cedex

ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Science de la Vie et de la Terre  

Fonction biologique des GSK3/Shaggy like kinases AtSK31 et AtSK32 : étude par mutagenèse dirigée, chezA. thaliana   Gaëlle CLAISSE RESUME   Chez les mammifères, la Glycogène Synthase Kinase 3β(GSK3β) intervient dans de nombreux processus cellulaires, tels que : le métabolisme du glycogène, l’embryogenèse, le neurodéveloppement, l’apoptose. Chez la planteA. thaliana, 10 protéines kinases homologues à la GSK3β par la famille, codées multigènique des Shaggy like kinases (AtSKs seul des), ont été identifiées. Pour le moment, le rôle d’un membres de cette famille a été élucidé. Ainsi, la kinase AtSK21 intervient comme régulateur de la voie de signalisation des brassinostéroides. Afin d’élucider le rôle des autres membres de la familleAtSKsapproche par mutagenèse dirigée a été, une engagée sur les kinases AtSK31 et AtSK32 pour produire des mutants positifs et négatifs dominants. Différents résidus de ces deux kinases, conservés chez la GSK3β, ont fait l’objet d’une substitution et des plantes transgéniques correspondantes ont été obtenues après transformation. Un phénotype floral et foliaire altéré a été observé sur les plantes surexprimant le transgèneAtSK32R178A par. Une analyse Microscopie Electronique à Balayage (MEB) montre que la réduction de la taille des cellules du pétale et du pédoncule accompagne la réduction de la taille de ces organes. Ce défaut d’élongation cellulaire a ensuite été confirmé par mesure en PCR quantitative des transcrits des gènes Xyloglucan endoTransglycosylase et endoHydrolase (XTHs).Ainsi, il a été montré que le gèneXTH22est sévèrement dérégulé dans les inflorescences des plantes 35S::AtSK32R178A. En parallèle, une étude de l’impact de la mutation R178A sur l’activité phosphorylante de la kinase a été menée, après production de protéines recombinantes couplées à la GST. Les résultats montrent que l’activité de la kinase AtSK32R178A est fortement réduite pour la Myelin Basic Protein (MBP) et la caséine C4032 par rapport à celle de la kinase native AtSK32, mais semble identique pour le peptide eIF2B. Le résidu R178 d’AtSK32 est l’équivalent du résidu R96 de la GSK3β. Ce dernier est responsable de la fixation des substrats péralablement phosphorylés et le siège de l’inactivation de la kinase. En conclusion, chezA. thaliana, surexpression d’ laAtSK32R178Aentraîne un défaut d’élongation cellulaire au niveau de l’inflorescence, une dérégulation du gèneXTH22 et une modification de l’activité kinasein vitro.   Mots clés : GSK3β,AtSKs, brassinostéroides,XTHs, mutagenèse dirigée, MEB, PCR quantitative, test d’activité kinase. Sommaire Abréviations   INTRODUCTION…………………………………………………………………………...……p 1   I. Structure des protéines Ser/Thr kinases…………………………………………………...….p 1 I. 1. Définition et classement………………………………………………………………....p 1 I. 2. Les sous-groupes de la famille Ser/Thr Kinases………………………………......….....p 2   II. Les GSKs de mammifère et les AtSKsd’A. thaliana…………………………………...…...p 3 II.1. Les multiples rôles de la GSK3B…………………………………………………...…..p 3 II.1. 1 La voie de signalisation PI3K/ PKB…………………………………........…....p 4 II.1. 2 La voie de signalisation Wnt (Wg/Int1) et la voie orthologue Wingless (Wg)...p 5 II.2. La structure de la GSK3B…………………………………………………..…………...p 7 II. 2. 1. Activation de la GSK3B et préférence de substrats………………….…p 8 II. 2. 2. Régulation des GSK3…………………………………….……………p 10 II. 2. 3. Les cibles de la GSK3b…………………………………………..……p 12                                           II. 2. La famille multigénique desAtSKsou GSK3/Shaggy like Kinase……………..……..p 13

II. 2. 1 Structure desAtSKs………………………………………………...………….p 13 II. 2. 2 Expression desAtSKs………………………………………..……………...…p 14 II. 2. 3 Les différents   rôles desAtSKs………………………………...……………….p 15   III. Les brassinostéroides (BRs)………………………………………………………………....p 19 III.    1. Les modes d’action des BRs...…………………………………………………..…….p 19 III. 2. La voie de synthèse du brassinolide (BL)…………………………………..…………p 20 III. 3. La voie de signalisation BRs…………………………………………..……...………p 20 III. 3. 1. Les différents acteurs de la voie BRs…………………………..……………..p 20 III. 3. 2. Les mécanismes d’action de la voie BRs…………………………..…………p 21 III.    4. Les mutants BRs……………………………………………………………....………p 22 III. 5. Les mécanismes de contrôle de la voie BRs…………………………………..………p 22 III. 6. Le mutantphor1chez la pomme de terre………………………………………..……p 23   IV. Les marqueurs de l’élongation cellulaire………………………………………………..….p 24 IV. 1. La famille desXTHs(Xyloglucan Endo Transglycosylase and EndoHydrolase)…....p 24 IV. 2. La famille des expansines……………………………………………………..……...p 26   V. Problématique………………………………………………………………………………....p 28   VI. Objectifs………………………………………………………………………………………p 28 MATÉRIELS ET MÉTHODES   MATÉRIELS………………………………………………………………………………….....p 30 La planteA. thaliana……………………………………………………………………………...p 30 La culture des plantes…………………………………………………………………………......p 30 Les souches bactériennes………………………………………………………………………....p 31 Les plasmides………………………………………………………………………………….….p 31 Les ADNcAtSKsdu groupe III…………………………………………………………………..p 31   MÉTHODES……………………………………………………………………………………..p 31 I. Extraction des Acides Nucléiques…………………………………………………………....p 31 I. 1. Extraction d’ADN plasmidique par lyse alcaline……………………………………...p 31 I. 2. Extraction d’ADN génomique végétal………………………………………..….…....p 32 I. 3. Extraction d’ARN végétal…………………………………………………….….…....p 33   II. Quantification d’acides nucléiques…………………………………………………………p 34 II. 1. Principe de l’électrophorèse……………………………………………….…………p 34 II. 2. Estimation de la quantité d’acide nucléique sur gel d’agarose…………….………....p 34 II. 3. Mesure des acides nucléiques par spectrophotométrie………………………….……p 35   III. Purification d’un fragment d’ADN à partir d’un gel d’agarose…………………….…...p 35   IV. Amplification d’ADN………………………………………………………………….……p 36 IV. 1. Amplificationin vitropar PCR à partir   de fragments d’ADN………………………p 36 IV. 2. Amplificationin vitro   à partir de colonies bactériennes…………………...p 37par PCR IV. 3. Amplificationin vivopar transformation……………………………………………p 37 IV. 3. 1. Préparation de cellules compétentes………………………………………..p 37 IV. 3. 2. Transformation par choc thermique de cellules compétentes……..………..p 38 IV. 3. 3. Transformation par choc électrique de cellules compétentes………………p 39   V. Mutagenèse dirigée………………………………………………………………………….p 40   VI. Séquençage………………………………………………………………………………….p 40  VI. 1. Principe du séquençage……………………………………………………………p 40  VI. 2. Détection des fragments…………………………………………………………...p 41   VII. Etapes de clonage d’un fragment d’ADN………………………………………..…..….p 42   VIII. Transformation et culture des plantes……………………………………………...….p 43  VIII. 1. Transformation par immersion………………………………………………….p 43  VIII. 2. Stérilisation des 44