Etude du système Ubiquitine / Protéasome : identification des protéines ubiquitylées et analyse des mécanismes de dégradation par le protéasome

Thierry Dupressoir - Président

Description

Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par Gwendaline LLEDO pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Etude du système Ubiquitine / Protéasome : identification des protéines ubiquitylées et analyse des mécanismes de dégradation par le protéasome le 19 Novembre 2007 Devant le jury suivant: Dr. Thierry DUPRESSOIR - Président Pr. Yves BENYAMIN - Rapporteur Dr. Olivier COUX - Examinateur Dr. Isabelle JARIEL-ENCONTRE - Examinatrice Laboratoire EPHE: Directeur: Pr. Yves BENYAMIN Motilité cellulaire - UMR 5539 Université Montpellier II Place Eugène Bataillon 34095 MONTPELLIER Cedex 05 Laboratoire d'accueil: Directeur: Pr. Paul MANGEAT CNRS-CRBM UMR 5237 Tuteur: Dr. Olivier COUX 1919, route de Mende 34095 MONTPELLIER Cedex 05 ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre EPHE Banque de Monographies SVT 1

• interface ubiquitylation


• procédure générale de la méthode


• identification de substrats du système ubiquitine


• méthode permettant la purification


• purification


• préparation de l'extrait protéique


• ubiquitylation des protéines


• protéasome

Informations

• Publié par: profil-nechor-2012
• Publié le: 01 novembre 2007
• Nombre de lectures: 135
• Langue: Français

Extrait

MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET
DE LA RECHERCHE

ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
Sciences de la Vie et de la Terre

MEMOIRE
présenté par

Gwendaline LLEDO

pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes

Etude du système Ubiquitine / Protéasome : identification des protéines
ubiquitylées et analyse des mécanismes de dégradation par le protéasome

le 19 Novembre 2007

Devant le jury suivant:
Dr. Thierry DUPRESSOIR - Président
Pr. Yves BENYAMIN - Rapporteur
Dr. Olivier COUX - Examinateur
Dr. Isabelle JARIEL-ENCONTRE - Examinatrice


Laboratoire EPHE: Directeur: Pr. Yves BENYAMIN
Motilité cellulaire - UMR 5539
Université Montpellier II
Place Eugène Bataillon
34095 MONTPELLIER Cedex 05


Laboratoire d'accueil: Directeur: Pr. Paul MANGEAT
CNRS-CRBM UMR 5237 Tuteur: Dr. Olivier COUX
1919, route de Mende
34095 MONTPELLIER Cedex 05

ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
Sciences de la Vie et de la Terre

EPHE Banque de Monographies SVT 1Gwendaline LLEDO

Etude du système Ubiquitine / Protéasome : identification des protéines
ubiquitylées et analyse des mécanismes de dégradation par le protéasome


RESUME

La dégradation régulée des protéines intracellulaires joue un rôle essentiel dans la plupart des
processus biologiques, notamment dans le contrôle de la prolifération et de la différenciation cellulaires,
dans la réponse appropriée aux stimuli extracellulaires, ainsi que dans l'élaboration de la réponse
immunitaire anti-cancéreuse et anti-virale. Chez les eucaryotes, la protéolyse intracellulaire est assurée en
grande partie par un système multi-enzymatique, appelé le système Ubiquitine / Protéasome. Ce système
implique des centaines de composants, qui permettent la reconnaissance et le marquage des protéines à
dégrader, puis leur dégradation par le protéasome 26S.
L'objectif de l'équipe est d'essayer de mieux comprendre les mécanismes des différentes étapes de la
dégradation des protéines par ce système multi-enzymatique. Au cours de mon stage, je me suis intéressée,
dans un premier temps, au développement d’une méthode permettant la purification et l’analyse quantitative
des protéines ubiquitylées, et dans un deuxième temps, à l’identification par fractionnement biochimique
d'extraits cellulaires, de facteurs stimulant la dégradation par le protéasome 26S de la protéine p53 poly-
ubiquitylée. Mon travail a consisté à mettre au point les procédures nécessaires à ces deux approches
expérimentales, et à entreprendre la recherche de cofacteurs du protéasome 26S par fractionnement de lysat
de réticulocytes. Ce travail a abouti à la purification d’une fraction protéique capable de stimuler le
protéasome 26S, dont la caractérisation est actuellement en cours au laboratoire.

Mots clés: ubiquitylation, dégradation, protéasome.

SOMMAIRE




LISTE DES ABREVIATIONS......................................................................................................................1

INTRODUCTION..........................................................................................................................................3

I / Généralités sur le système Ubiquitine / Protéasome 5
I.1 / Historique de la découverte du système UbPr 5
I.2 / Généralités sur les grandes fonctions du système Ubiquitine / Protéasome 7
EPHE Banque de Monographies SVT 2I.3 / Présentation générale du système UbPr 8

II / L’ubiquitylation des protéines 10
II.1 / L'ubiquitine et les différents types d'ubiquitylation 10
II.1.1 / 10
II.1.2 / Les différents types d'ubiquitylation 11
II.2 / La cascade enzymatique ou ubiquitylation 12
II.3 / Spécificité du système ubiquitine / protéasome : les E3s 14
II.4 / Le devenir des substrats ubiquitylés 14
II.4.1 / Les protéines à UBD 15
II.4.2 / Réversibilité de la réaction d’ubiquitylation : la déubiquitylation 15

III / Structure et fonctions des protéasomes 16
III.1 / Le protéasome 20S 17
III.2 / Les régulateurs de l’activité du protéasome 20S 19
III.2.1 / Le complexe régulateur 19S ou PA700 19
III.2.2 / L’activateur 11S ou PA28 20
III.3 / Le protéasome 26S 21
III.3.1 / Reconnaissance du substrat ubiquitylé par le complexe 19S 22
III.3.2 / Mécanismes de la dégradation 23
a) Dépliement du substrat 23
b) Accès du substrat aux sites actifs du corps catalytique 24
c) Translocation du substrat à l’intérieur du corps catalytique 25
d) Dégradation processive 25
III.3.3 / Recyclage de l’ubiquitine et déubiquitylation 25

IV / Intérêts de la recherche sur la voie protéolytique dépendante du système UbPr:
pathologies et perspectives thérapeutiques 26

SITUATION ET OBJECTIFS DU PROJET……………………………………………………………..29

Projet 1 : Ubiquitylome: purification et identification de substrats du système Ubiquitine /Protéasome
I.1 / Contexte scientifique et approche expérimentale 29
I.2 / Plan de travail 30

Projet 2: Interface Ubiquitylation / Dégradation: étude de la dégradation de la protéine p53
ubiquitylée par le protéasome 26S purifié
II.1 / Contexte scientifique et approche expérimentale 31
II.2 / Plan de travail 31

EPHE Banque de Monographies SVT 3MATERIELS ET METHODES……………………………………………………………………………33

I / Etude biochimique des protéines 33
I.1 / Production de protéines recombinantes à partir d’un système procaryote (E.coli) 33
I.1.1 / Transformation bactérienne 33
I.1.2 / Expression analytique des protéines d’intérêts 34
I.2 / Préparation d’extraits protéiques 34
I.3 / Purification des protéines exprimées 34
I.3.1 / Principe général des chromatographies sur colonne 35
I.3.2 / Purification par affinité de protéines de fusion