Ministere de la jeunesse de l'éducation nationale et de la recherche

Agnès Doreau

Description

Niveau: Supérieur

• mémoire

Ministere de la jeunesse, de l'éducation nationale et de la recherche ecole Pratique de hautes etudes Sciences de la Vie et de la Terre MéMoire Présenté par Agnès DOREAU Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes rôle des Protéines twist-1 et twist-2 dans l'altération des MécanisMes de sauvegarde cellulaire 29 septembre 2006 Soutenu devant le jury suivant : Président Jean-Luc Vayssière Tuteur pédagogique Jean-Marie Exbrayat Tuteur scientifique Stéphane Ansieau Examinateur Patrick Melhen Examinateur Emmanuelle Gormally Directeur : Pr. Jean-Marie EXBRAYAT Laboratoire de Biologie Générale Université Catholique de Lyon 25 rue du Plat – 69002 Lyon Directeur : Pr. Alain PUISIEUX Centre Léon Bérard – Unité Inserm 590 Inactivation fonctionnelle de p53 28 rue Laënnec – 69373 Lyon Cedex 08 Une cellule normale est soumise à une succession de cycles de division. Chacune des EPHE Banque de Monographies SVT 1

• pcr quantitative en temps réel


• transitions des phases g1


• rt pcr


• protéines twist


• cellule normale


• succession de cycles de division


• altération de l'intégrité du génome


• prolifération cellulaire


• adn arn


• rt-pcr semi-quantitative

Sujets

• Mémoire
• Berard
• Puisieux
• Exbrayat
• Vayssière
• Institut national de la santé et de la recherche médicale

Informations

• Publié par: profil-nechor-2012
• Publié le: 01 septembre 2006
• Nombre de lectures: 109
• Langue: Français

Extrait

M inistere   de   la   jeunesse , de   l ’ éducation   nationale   et   de   la   recherche     e cole P eutaqir   de h autes e tudes Siees de la Vie et de la Terre   M éMoire   Préseté par   Agès DOREAU Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes

     

   

r ôle   des   Protéines t wist -1 et t wist -2 dans l altération   des   MécanisMes   de   sauvegarde   cellulaire ’

29 septembre 2006 Souteu devat le jury suivat :     Présidet Jea-Lu Vayssière Tuteur pédagogique Jean-Marie Exbrayat Tuteur scientifique Stéphane Ansieau Examinateur Patrick Melhen Examinateur Emmanuelle Gormally

      Directeur : Pr. Jean-Marie EXBRAYAT           hoatonlyr.fjembxaray@tnuvic- Laboratoire    de Biologie Générale Université Catholique de Lyon 25 rue du Plat 69002 Lyon   Directeur : Pr. Alain PUISIEUX        iupueislcncfrc.lyx@.fon Centre Léon Bérard – Unité Inserm 590 Iativatio fotioelle de p53 28 rue Laënnec – 69373 Lyon Cedex 08 Une cellule normale est soumise à une succession de cycles de division. Chacune des

phases du cycle cellulaire est hautement régulée au niveau des points de contrôle et en particulier lors des transitions des phases G1/S (Gap 1/Synthèse) et G2/M (Gap2/Mitose, Pommier Y et al., 2003). Le bon fonctionnement de ces régulations est essentiel pour garantir une prolifération cellulaire normale et s’assurer de l’intégrité du patrimoine génétique. Un disfonctionnement peut avoir deux conséquences : favoriser l’apparition de mutations ou une mauvaise ségrégation (cellules polyploïdes). Les mutations peuvent concourir à l’altération des fonctions ou de la régulation d’un certain nombre de gènes. Dans une cellule normale, l’activation des oncogènes ou l’altération de l’intégrité du génome peut avoir pour conséquence d’induire un arrêt définitif du cycle cellulaire (sénescence) ou une mort cellulaire programmée (apoptose, Ben-Porath I and Weinberg R, 2005). La réponse engendrée suite à une activation oncogénique dépend de la nature de la voie de signalisation induite. Ainsi l’oncogène Myc est davantage associé à l’apoptose et l’oncogène Ras à la sénescence. Si cette hypothèse est vérifiée depuis longtempsitro vi, l’importance de l’altération des mécanismes de sauvegarde i vivo est la tumorigénèse démontrée que depuis peu comme un élément déterminant dans (Bartkova Jet al, 2005 ; Braig M et al., 2005 ; Chen Z et al., 2005 ; Collado M et al., 2005 ; Michologlou C et al., 2005). Notre équipe s’intéresse aux protéines Twist et leur rôle dans les mécanismes de sauvegarde cellulaire. Plus particulièrement, mon travail a consisté à analyser le rôle des protéines Twist-1 et Twist-2 dans la neutralisation de la sénescence cellulaire induite par une forme activée de l’oncogèneaR.s

t ables   des M resatie   T ESABL   DSE M SEREITA 3 _________________________________________ T BLEA   DES I TIOnSLLUSTRA _____________________ ______________________________________ L IEST   SDE A SBRBAIvéNoIT   7 ____________________ P ETIAR I  I TRnnOITcUDO i- i  rpp p__________ 8 ___________________ ii- cy   ____________________________________ 8 2.1 Cycle cellulaire_______________ 8 _____________________________________________________ 2.2 Régul cy le cellulaire_______________________________________________________ ation du c10 2.2.1 Synthèse et destruction cyclique de protéines ____________________________10 2.2.2 Cyclines, kinases dépendantesyc_______________  des clines et leurs inhibiteurs   11 2.2.3 Complexes CyclineD/Cdk4,6_11 _________________________________________ 2.2.4 Protéines Rb et E2F   12 ________________________________________________ 2.2.5 La protéinp2 1f ______________________________________________ e 1 1/WaCip   12 2.2.6 La protéine p27 iK1p ____12 _____________________________________________ 2.2.7 Les protéines p16 Ia4KN 51p , NKI4b , 8p1 I4cNK p 9 IKNd4 ________________________ et 1   13 y le cellulaire et c___________________________________________________________ 13 2.2 C c ancer iii Mm  mè___________________________________ 14 -

3.1 Proto-oncogènes et oncogènes_______________________________________________________ 14 ènes suppresseurs de tumeurs_____________________________________________________ 3.2 G15 3.2.1 Mise en évidence et définition________________________________________ 15 3.2.2 Classification des gènes suppresseurs de tumeurs_________ ________________16 3.2.3 La protéie p53__________________________ _________________________16 3.2.4 La protéine Rb____________________________________________________   17 iv- l      pf _______________ 18 4.1 Sén p ativ__________________________________________________ escence cellulaire ou ré lic e19 4.2 Princip s vo_____________________________________________ ale ies de la sénescence induite19 4.3 Voies de signalisation de la sénescence cellulaire_______________________________________ 20 v- a  mm        21 _________________________________________________________________ 5.1 Locus INK4a/Arf21 5.2 Régulations directes_______________________________________________________________ 22 l ___________________________________________ vi- èTWIST22 6.1 Homologies entre Twist-1 et Twist-2________________________________ 22 ___ ______________ 6.2 Rôle de Twist-1 dans le développement embryonnaire__________________________________ 23 6.3 Twist et pathologie : Syndrome de Saethre-Chotzen____________________________________ 23 6.4 Twi , apoptose e_______________________________________________________ 24 st-1 t cancers 6.6 Twist-1, transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et mé_______________________ 5 tastase2 ___________________________________________________________ 6.7 Twist et chimiorésistance26 sauveg de cellulaire :__ 6.7 Twist-1 et altération des mécanismes de ar un rôle dans la sénescence ?27 _____________ P ARETI II – M ATEIREL   TE M TéEDoHS ______ ManiPulation des lignees cellulaires i- rp  f my m (MeF) ii c  -__________________________ 2.1 Entretien des cellules ___________________________________________ 2.2 Culots cellulaires (culots secs)___________________________________ 2.3 Transfections cellulaires et infections _____________________________ 2.3.1 Transfection des PlatE et PlatA___________________ 2.3.2 Transfection des MEF immortalisées par E1A_ ________ 2.3.3 Ifetio des ellules réeptries__________________ iii-Mesure de l’activité luciférase_ ______ ________ clonages __________________________________ i- Pp   mp Xli-b ii- ep   Xli- _________ iii- c  dna  rna  p t_ 3.1 Clonage des cDNA des protéines Twist ____________________________ 3.2 Clonage ShRNA Twist-1 dans le ve p etro Super puro_________ cteur R _______________________ ANALYSE D’EXPRESSION i- ampf   p   _____   Pcr 1.1 PCR et RT-PCR _______________________________________________ 1.2 RT-PCR semi-quantitative______________________________________ 1.2.1 Synthèse des ADN complémentaires(cDNA)__________  

1.2.2 PCR quantitative en temps réel____________________ 1.2.3 Quantification________________________________ II- Mise en évidence de l’arrêt du cycle en phase G1 par cytométrie en flux iii-Analyse des ARN et extraction des ARN totaux__ iv- ay  p__________________ _____ 4.1 Extractions protéiques_________________________________________ 4.2 Dosage des p___________________________________________ rotéines 4.3 Western Blott g______________________________________________ in 4.3.1 Préparation des échantillons et électrophorèse en gel de polyacrylamide 4.3.2 Transfert des protéines sur une membrane de nitrocellulose 4.3.3 Saturation et incubation des antp______________ icors ____________________________________ 4.3.4 Révélation _ eXPeriMentation aniMale - tuMorigenicite i- t  fm  : fm      m m-      ii- t  m_____  z   n _____________________ P RAITE III - R éSULTATS I- Collaboration entre les protéines Twist et l’oncogèneRsadans l’immortalisation et  fm   pmtioriv    1.1 Tests d’immortalisation ________________________________________ ________________________________________ 1.2 Tests de transformation ii- dff  miv voientre les deux lignées iii- t-1      p à       m     IV- Mécanismes d’inhibition de la sénescence prématurée par les protéines Twist 4.1 voie p__________________________________ Inhibition de la 16 – Rb e la voie p 3_______________________________________ 4.2 Inhibition d 5 Analy des tumeurs___________________________________________ 4.3 se IV- Twist inhibe différentiellement l’induction du gèneFAR p à ff è V- L’inhibition de p16 et p21 est directement dépendante des protéines Twist P AEITR IV  D IISSUncOS   ET P IVESEPTcESR __________ i- M       anisme d’altération des voies de sauvegarde cellulaire par Twist : une action à plusieurs niveaux   II- Différence de tumorigénicité des protéines Twist : l’apport d’un nouveau modèle d’étude    III- Extension du modèle établi __________________ iv- cmp  mm  mè  t-1oiv vi: un nouveau défi, de nouveaux outils