Université Louis Pasteur de Strasbourg École Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé
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Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
Université Louis Pasteur de Strasbourg École Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé THÈSE présentée pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR discipline : sciences du vivant - aspects moléculaires et cellulaires de la biologie spécialité : neurosciences par Julien Bouissac Rôle de la voie Notch dans la spécification des cellules souches neurales et dans la différenciation des précurseurs neuraux. Utilisation du système modèle des neurosphères Soutenue publiquement le 06 septembre 2005 devant les membres du jury Docteur Éliane MOHIER DR CNRS, Strasbourg, Directeur de thèse Professeur Jean-Marc REICHHART Professeur ULP, Strasbourg, Rapporteur interne Professeur Pat SIMPSON Professeur University of Cambridge, UK, Rapporteur externe Docteur Harold CREMER DR CNRS, Marseille, Rapporteur externe Docteur Magalie LECOURTOIS CR CNRS, Rouen, Examinateur

  • voie notch

  • notch

  • ligands du récepteur notch

  • notch ligand

  • stem cells

  • ‘aggravation' du phénotype tumoral

  • neurosphères mutantes pour le gène dll1

  • lignées tumorales du système nerveux

  • devenir des cellules souches neurales


Sujets

Informations

Publié par
Publié le 01 septembre 2005
Nombre de lectures 78
Langue Français
Poids de l'ouvrage 8 Mo

Extrait

Université Louis Pasteur de Strasbourg
École Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé



THÈSE

présentée pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR
discipline : sciences du vivant - aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
spécialité : neurosciences
par
Julien Bouissac

Rôle de la voie Notch dans la spécification des cellules souches
neurales et dans la différenciation des précurseurs neuraux.
Utilisation du système modèle des neurosphères




Soutenue publiquement le 06 septembre 2005
devant les membres du jury



Docteur Éliane MOHIER DR CNRS, Strasbourg, Directeur de thèse
Professeur Jean-Marc REICHHART Professeur ULP, Strasbourg, Rapporteur interne
Professeur Pat SIMPSON Professeur University of Cambridge, UK, Rapporteur externe
Docteur Harold CREMER DR CNRS, Marseille, Rapporteur externe
Docteur Magalie LECOURTOIS CR CNRS, Rouen, Examinateur


RÉSUMÉ



Notre équipe s’intéresse au rôle de la voie de signalisation Notch dans le devenir des cellules souches
neurales et leur différenciation en neurones et en cellules gliales. Pour aborder cette étude, nous
avons eu recours au système modèle des neurosphères déjà utilisé au laboratoire lorsque j’ai rejoint
l’équipe d’E. Mohier. Les neurosphères sont des clones de cellules poussant en suspension qui
dérivent de cellules souches neurales. Sur un support solide, les neurosphères se différencient en
neurones, oligodendrocytes et astrocytes selon des proportions définies. Ce système de culture
permet de distinguer expérimentalement une phase de prolifération, au cours de laquelle a lieu la
spécification des différents types cellulaires (choix de l’identité cellulaire) et une phase de
différenciation, au cours de laquelle les progéniteurs déjà engagés dans une voie de développement
achèveront de se différencier. Cette technique permet par conséquent, de définir si un facteur
(génétique ou pharmacologique) agit sur la spécification ou sur la différenciation cellulaire.

Des neurosphères mutantes pour le gène Dll1 codant l’un des ligands du récepteur Notch montrent
une forte augmentation de la proportion de neurones aux dépens des cellules gliales par rapport aux
neurosphère de type sauvage. Le sauvetage du phénotype mutant par un apport exogène et
transitoire d’une forme soluble du ligand Jagged1 (autre ligand de Notch) a permis de montrer que la
voie Notch agissait sur le devenir des cellules souches neurales en deux étapes. Dans une première
étape, Notch agit sur l’alternative neurone / cellule gliale en réprimant la voie neuronale et en
favorisant la voie gliale. Dans une seconde étape, Notch agit sur les progéniteurs en réprimant la
différenciation des neurones et oligodendrocytes et en stimulant celle des astrocytes (publication 1).
Parallèlement à ce travail, nous avons testé des petites molécules pour leur capacité à influencer le
devenir des cellules souches neurales. L’une de ces molécules, le tCFA15 augmente les neurones
aux dépens des cellules gliales selon des modalités proches de celles résultant de l’inactivation de la
voie Notch. L’analyse moléculaire a montré que le tCFA15 provoquait une diminution de l’expression
de Notch1 et de Hes5. L’étude du mécanisme d’action du tCFA15 a montré qu’il agissait sur la voie
STAT3, suggérant un lien entre les voies Notch et STAT3. Des expériences combinant gain et de
perte de fonction pour chacune des deux voies, ont permis d’établir une hiérarchie fonctionnelle entre
les gènes Notch1 et STAT3 et de déterminer que dans les neurosphères, l’expression de Notch1 était
contrôlée par STAT3, comme l’a confirmé la biologie moléculaire (publication 2).

En parallèle de ces travaux, nous avons également testé l’effet neurotrophique d’autres petites
molécules non peptidiques dans le système des neurosphères (publication 3 et 4).

Un troisième volet de mon travail a consisté à tester les effets du tCFA15 sur des lignées tumorales du
système nerveux central. Nous fondant sur les effets physiologiques contraires de la voie Notch sur
les neurones et oligodendrocytes, qu’elle inhibe, et sur les astrocytes, qu’elle stimule, nous avons
recherché si cet effet pouvait être transposé à des lignées tumorales correspondantes
(neuroblastomes, oligodendrogliomes et astrocytomes). Des résultats encore préliminaires suggèrent
que c’est bien le cas, puisque le tCFA15 semble induire la différenciation des neuroblastomes et des
oligodendrogliomes tandis qu’il inhibe celle des astrocytomes. Ces effets s’accompagnent
respectivement d’une ‘amélioration’ et d’une ‘aggravation’ du phénotype tumoral in vitro et in vivo, ce
qui illustre bien la complexité de la voie Notch dans les processus de la cancérogenèse.






ABSTRACT



In our laboratory we are interested in the role of the Notch pathway on cell fate decision of neural stem
cells and on their differentiation into neurons and glia. These studies have been carried out in the
model system of neurospheres, already used in Dr. Eliane Mohier’s laboratory when I joined her team.
Neurospheres derive clonally for neural stem cells and proliferate in suspension in the adapted cell
culture medium. Once plated on a solid support where they attach, neurospheres differentiate into
neurons, oligodendrocytes and astrocytes in defined proportions. Because they allow distinguishing
experimentally between the proliferation phase (during which cell fate decisions occur) and the
differentiation phase (during which differentiation of committed progenitors occurs), neurospheres
allow determining whether a factor (either genetic or pharmacologic) is acting on cell fate or
differentiation.
Neurospheres prepared from Dll1 (coding for a Notch ligand) mutant embryos segregate more
neurons at the expense of both oligodendrocytes and astrocytes, compared to the wild-type ones. This
mutant phenotype could be rescued when Dll1 mutant neurospheres where cultured in the presence
of a soluble form of Jagged1 (another Notch ligand). Our results indicate that the Notch pathway is
acting in two steps: (i) in a first step it inhibits the neuronal fate while promoting glial fate, (ii) in a
second step Notch promotes the differentiation of astrocytes while inhibiting the differentiation of both
neurons and oligodendrocytes (publication 1).
In parallel to this work we have tested the effects of small non peptidic molecules on the cell fate
decision of neural stem cells. One of these molecules, referred to as tCFA15, increases the number of
neurons at the expense of glial cells, in a manner reminiscent of that resulting from the inactivation of
Notch through the Dll1 mutation. Molecular analysis has shown that tCFA15 consistently decreases
the expression of Notch1 gene, and subsequently of Hes5, a downstream target gene of Notch
activation. In addition, we have shown that tCFA15 causes a diminution of the tyr705 phosphorylation
of STAT3, thereby suggesting a link between both Notch and STAT3 signalings. We established a
functionnal hierarchy between Notch and STAT3 by experiments combining gain and loss of functions
for these two pathways and we found that in the system of neurospheres STAT3 is an upstream
regulator of Notch1. These results have been confirmed by molecular analysis. (publication 2)

In parallel to this work we have also tested the neurotrophic effect of other non peptidic small
molecules in the system of neurospheres (publication 3 and 4)

A third part of my work consisted in studying the effects of tCFA15 on tumor cell lines of the central
nervous system. We attempted to establish a parallel between the opposite physiological effects of
Notch on the differentiation of neurons, oligodendrocytes and astrocytes and a putative effect of Notch
on various tumor cell lines from the central nervous system. Using tCFA15 as a pharmacological tool
to modulate Notch function, preliminary data showed that tCFA15 seems to induce the differentiation
of neuroblastoma and oligodendroglioma on the one hand, while it inhibits the differentiation of
astrocytoma, on the other hand. These effects are complementary to an “improve” and an
“aggravation” respectively of the tumor phenotype in vitro and in vivo, which shows the complexity of
the Notch pathway in the process of cancer.














à mes parents

à Joffrey


à ma petite femme, Marie


sans eux, rien n’aurait été possible…
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