ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTÉ

Chantal Abergel

Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
UNIVERSITÉ DE STRASBOURG ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTÉ THÈSE Présentée pour l'obtention du grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE STRASBOURG Discipline : Science du vivant Domaine : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie Par Kaouthar Dhouib Mise au point de dispositifs microfluidiques pour la cristallisation et l'analyse cristallographique des biomolécules Soutenue le 14 octobre 2009 devant la commission d'examen Mme Chantal Abergel Rapporteur externe M. Jean?Pierre Samama Rapporteur externe M. Andrew Griffiths Rapporteur interne M. Richard Giegé Directeur de thèse M. Claude Sauter Directeur de thèse

• exemples d'applications microfluidiques dans les sciences


• cristallisation en milieu diffusif par la méthode de contre-diffusion


• perfection cristalline


• cristallisation


• cristallisation en milieux diffusifs


• méthode de cristallisation


• formations de l'école doctorale des sciences de la vie et de la santé


• agarose gel facilitates

Sujets

• Abergel
• Griffiths
• Université de Strasbourg
• Sauter
• Cristallisation

Informations

• Publié par: profil-zyak-2012
• Publié le: 01 octobre 2009
• Nombre de lectures: 63
• Poids de l'ouvrage: 62 Mo

Extrait

UNIVERSITÉDE STRASBOURG
ÉCOLE DOCTORALEDESSCIENCES DELAVIEETDELASANTÉ
THÈSE
Présentée pour l’obtentiondugradede
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉDESTRASBOURG
Discipline: Scienceduvivant
Domaine : Aspects moléculairesetcellulairesdelabiologie
Par
Kaouthar Dhouib
Miseaupointdedispositifsmicrofluidiques
pourlacristallisationetl’analyse
cristallographiquedesbiomolécules
Soutenue le 14 octobre2009devantlacommissiond’examen
Mme Chantal Abergel Rapporteurexterne
M. Jean­Pierre Samama Rapporteurexterne
M. Andrew Griffiths Rapporteurinterne
M. Richard Giegé Directeurdethèse
M. Claude Sauterdethèse2Tabledesmatières
Remerciements 7
1 Introduction:CristallisationetMicrofluidique 9
1.1 Introduction générale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.2 Vue d’ensemble de la cristallisationdesmacromoléculesbiologiques . . . . . . . 11
1.2.1 L’intérêt des études cristallographiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.2.2 Cristallisation et cristallogenèse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.2.3 La cristallisation: étapelimitanted’uneétudecristallographique . . . . . 15
1.2.4 Diagramme dephase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.2.5 Étapes de la cristallisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.2.6 Les méthodes de cristallisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
1.2.7 Caractérisationde la qualitécristalline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
1.3 Cristallisation enmilieux diffusifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
1.3.1 Cristallisation en milieuxdiffusifsetperfectioncristalline . . . . . . . . . 29
La convection comme modedetransport . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
La diffusion comme modedetransport . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
Cristallisation en microgravité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 en gel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
1.3.2 Cristallisation en milieudiffusifparlaméthodedecontre-diffusion . . . 32
1.3.3 Les systèmes miniaturisésoude microcristallisation . . . . . . . . . . . . 33
1.4 Lamicrofluidique: un outil pourlacristallographiedesbiomolécules . . . . . . 33
1.4.1 La microfluidique : champscientifiqueettechnologique émergent . . . . 35
1.4.2 Les phénomènes physiquesrésultantdelaminiaturisation . . . . . . . . 36
1.4.3 Exemples d’applicationsmicrofluidiquesdanslessciencesduvivant . . 38
3Tabledesmatières
1.4.4 Microfluidiqueet cristallisationdesmacromoléculesbiologiques . . . . . 43
De la robotique à la microfluidique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
La diffusion à l’interfacecommeméthodedecristallisation . . . . . . . . 44
Le «batch» comme méthodedecristallisation . . . . . . . . . . . . . . . . 46
Article1 «From macrofluidics to microfluidics for the crystallization of
biological macromolecules» . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
1.5 Contributions demon travaildethèse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2 Pucesmicrofluidiques:Idées,réalisations,validation 55
2.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
2.1.1 Pourquoi la microfluidique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
2.1.2 Notre concept de pucemultifonctionnelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
2.1.3 Principe de fonctionnementdes puces . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
2.2 Lapremière génération de dispositifenPDMSlithographie . . . . . . . . . . . . 57
2.2.1 Géométrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
2.2.2 Prototypage rapide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
2.2.3 Remplissage des dispositifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
2.2.4 Protocole du remplissage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
2.2.5 Choix du motif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
2.2.6 Cristallisation et observationdes cristaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
2.2.7 Analyse cristallographique in situ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
2.2.8 Bilan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
2.3 Sélection des matériaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
2.3.1 Absorption théorique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
2.3.2 Analyses aux rayons X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
2.4 Conception de nouvelles sériesde prototypesenmatériauxpeuabsorbants . . . 69
2.4.1 Matériaux et modes defabrication . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
2.4.2 Contrôle de l’état de surface . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
2.4.3 Remplissage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
2.4.4 Cristallisation et analyseauxrayonsX . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
2.4.5 Article2«Microfluidicchipsforthecrystallizationofbiomacromolecules
by counter-diffusion andon-chipcrystalX-rayanalysis» . . . . . . . . . . 72
4Tabledesmatières
2.4.6 Bilan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
2.5 Optimisation de la géométrie etde l’ergonomiedesdispositifsmicrofluidiques . 84
2.5.1 Nouveau cahierdes charges . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
2.5.2 Difficultés pratiques etsolutions techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
2.5.3 Réalisation desnouvellespuces . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
3 Applicationdelacroissancecristallineengel 95
3.1 Étude structuralede l’Aspartyl-tRNAsynthétase1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
3.2 Préparation de cristaux en présenced’analoguesdesubstrat . . . . . . . . . . . . 96
3.3 Article 3 «Agarose gel facilitatesenzymecrystalsoakingwithaligand» . . . . . 98
3.4 Zoom dans le siteactif de l’AspRS-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
4 Matérielbiologiqueetaspectsméthodologiques 107
4.1 De la cristallisation des macromoléculesàleurstructuretridimensionnelle . . . . 107
4.1.1 Les macromolécules biologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
4.1.2 Détermination des concentrations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
4.1.3on de l’homogénéité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
4.1.4 Cristallisation de macromoléculesmodèles . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
4.1.5 Analyse cristallographique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
4.2 Microfluidique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
4.2.1 Matériaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
4.2.2 Méthodes de fabrication . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
5 Conclusion,perspectivesetaspectséconomiques 121
Annexe I : Valorisationdescompétences,unnouveauchapitredethèse 139
Annexe II :Formationsdel’ÉcoleDoctoraledessciencesde lavieetdelasanté 151
Annexe III :Productionscientifique 161
5Tabledesmatières
6Remerciements
J’adresse de vifs remerciements à Mme Chantal Abergel du Laboratoire Information
Génomique et Stucture (Marseille), M. Jean-Pierre Samama du Synchrotron Soleil (Paris) et M.
Andrew Griffiths de l’Institut de Science et d’Ingénierie Supramoléculaires (Strasbourg) pour
l’honneurqu’ils me font de juger ce travaildethèse.
Lorsque j’adresse le bilan de ces trois années passées dans le laboratoire, ce n’est pas sans un
pincementaucoeurquejevaislequitter.Lesgensquej’aicotoyéstouslesjoursnesontplusde
simples collaborateurs mais une nouvelle famille. Écrire ces remerciements n’est pas l’exercice
leplusfacile.
Je tiens tout d’abord à remercier mes deux directeurs de thèse : Claude Sauter, pour m’avoir
offert un projet co-financé par le CNRS et la Région Alsace, formée à la cristallographie, au
logiciel libre, encouragée dans tout ce que j’ai entrepris comme activité même en dehors de la
thèse, ce qui m’a permis de m’épanouir scientifiquement et humainement et Richard Giegé de
m’avoir accueilli dans son équipe, pour sa culture et sa curiosité scientifique contagieuse. Ils y
sontpourbeaucoup, ilsm’ont permis de
bienmeprépareràl’ensembledelathèse.
UngrandMerciàBernardLorberdem’avoirtoutapprissurlacristallisation,poursadisponibilité, sa gentillesse et ses conseils pratiques. Le travail avec Bernard a été un vrai plaisir, très
enrichissant, me permettant d’acquérir de nombreuses compétences techniques, scientifiques,
rédactionnelles, réflexionnelles. Mercipourtontemps,tapatience,tesidées,pourtout...
Mes remerciements se dirigent également vers l’ensemble de l’équipe de Daniel Kern, passé
et présente, qui leur aide technique é