présentée par Romary Perrin pour obtenir le titre de

Romary Perrin

Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
THÈSE DE DOCTORAT présentée par Romary Perrin pour obtenir le titre de DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR DANS LE DOMAINE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE VÉGÉTALE Rôle de la polyadénylation dans la dégradation et la maturation des ARN des mitochondries de plantes supérieures Soutenue le 19 octobre 2005 devant le jury composé de : M. Mario Keller Président Mme Eliane Hajnsdorf Rapporteur M. Ian Small Rapporteur Mme Laurence Drouard Directeur de thèse M. Dominique Gagliardi Membre invité U N I V E R S I T É L O U I S P A S T E U R S t r a s b o u r g I n s t i t u t d e B i o l o g i e M o l é c u l a i re d e s P l a n t e s • U P R 2 3 5 7 C N R S , 1 2 r u e d u g é n é r a l Z i m m e r • h t t p : / / i b m p . u - s t r a s b g . f r /

• arn des mitochondries de plantes supérieures


• polyadénylation


• organite semi-autonome de la cellule eucaryotique


• sites de polyadénylation par rt-pcr


• mitochondriaux chez arabidopsis thaliana


• gradation des arn mitochondriaux

Sujets

• Louis Pasteur University
• Perrin
• Keller
• Zimmer
• Polyadénylation

Informations

• Publié par: profil-zyak-2012
• Publié le: 01 octobre 2005
• Nombre de lectures: 109
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 3 Mo

Extrait

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présentée parRomary Perrinpour obtenir le titre de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR

DANS LE DOMAINE

BIOLOGIE MOLÉCULAIRE VÉGÉTALE

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Rôle de la polyadénylation dans la dégradation et la maturation

des ARN des mitochondries de plantes supérieures

Soutenue le 19 octobre 2005 devant le jury composé de :

M. Mario Keller

Mme Eliane Hajnsdorf

M. Ian Small

Mme Laurence Drouard

M. Dominique Gagliardi

Président

Rapporteur

Rapporteur

Directeur de thèse

Membre invité

I n s t i t u t d e B i o l o g i e M o l é c u l a i r e d e s P l a n t e s U P R 2 3 5 7 C N R S , 1 2 r u e d u g é n é r a l Z i m m e r • •h t t p : / / i b m p . u - s t r a s b g . f r /

Discipline :Biologie moléculaire et cellulaire Laboratoire :Institut de Biologie Moléculaire des Plantes 2357 CNRS, 12 rue du général Zimmer UPR

RÔLE DE LA POLYADENYLATION DANS LA DÉGRADATION ET LA MATURATION DES ARN DES MITOCHONDRIES DE PLANTES SUPÉRIEURES

 La mitochondrie, organite semi-autonome de la cellule eucaryotique, comporte son propre système génétique. Chez les plantes, la régulation du génome mitochondrial a principalement lieu au niveau post-transcriptionnel. Pour devenir fonctionnels, les transcrits précurseurs mito- chondriaux sont intensivement modifiés par maturation des extrémités 5’ et 3’, épissage, et édi- tion. En revanche, ils ne sont pas polyadénylés de façon constitutive. Or, il a été montré qu’un transcrit mitochondrial pouvait être polyadénylé et que sa polyadénylation était corrélée à sa dé- stabilisationin vitro etin vivo. Notre objectif était de mieux caractériser la polyadénylation des transcrits de la mitochondrie de plante et d’étudier son implication dans un mécanisme de dé- gradation des ARN mitochondriaux. Ce travail de thèse s’est déroulé selon trois axes : la carto- graphie des sites de polyadénylation des transcrits du gèneatp9de la mitochondrie deSolanum tuberosum, l’identification de RNases impliquées dans la maturation et la dégradation des ARN mitochondriaux chezArabidopsis thaliana, et l’étude de la maturation et la dégradation des ARN ribosomiques 18S à l’aide de plantes transgéniques modifiées dans l’expression de ces exonucléa- ses.

 En cartographiant les sites de polyadénylation par RT-PCR, nous avons montré que pour les transcrits du gèneatp9deS. tuberosum, la majorité de ces sites sont situés aux extrémités 3’ matu- res. Par une stratégie de génétique inverse, nous avons montré que deux exonucléases adressées à la mitochondrie et homologues de la PNPase et de la RNase II d’E. colisont impliquées dans la maturation et la dégradation des ARN messagers mitochondriaux. Enfin, la caractérisation des intermédiaires de maturation et de dégradation des ARN ribosomiques 18S dans les plantes pour lesquelles l’expression de la PNPase était supprimée nous a permis de montrer que la polyadé- nylation joue un rôle dans leur maturation et leur dégradation.

 Par ce travail, nous avons montré que la polyadénylation est impliquée non seulement dans la maturation et la dégradation des ARN messagers mitochondriaux, mais aussi d’un ARN ribo- somique. Dans tous les cas, la polyadénylation permet le recrutement et l’attaque des extrémités 3’ des ARN par la PNPase. Cette dernière caractéristique est commune aux systèmes procaryoti- ques et d’origine procaryotique possédant une PNPase. Récemment, il a été montré que l’exo- some est recruté par un complexe responsable de la polyadénylation de certains ARN nucléaires de levure pour les dégrader. Il semble que le rôle originel de la polyadénylation dans le recrute- ment de complexes exonucléolytiques soit conservé dans des systèmes génétiques divers.

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T h è s e d e D o c t o r a t / R é s u m é

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présentée parRomary Perrinpour obtenir le titre de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR

DANS LE DOMAINE

BIOLOGIE MOLÉCULAIRE VÉGÉTALE

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Rôle de la polyadénylation dans la dégradation et la maturation

des ARN des mitochondries de plantes supérieures

Soutenue le 19 octobre 2005 devant le jury composé de :

M. Mario Keller

Mme Eliane Hajnsdorf

M. Ian Small

Mme Laurence Drouard

M. Dominique Gagliardi

Président

Rapporteur

Rapporteur

Directeur de thèse

Membre invité

I n s t i t u t d e B i o l o g i e M o l é c u l a i r e d e s P l a n t e s U P R 2 3 5 7 C N R S , 1 2 r u e d u g é n é r a l Z i m m e r • •h t t p : / / i b m p . u - s t r a s b g . f r /

Rôle de la polyadénylation dans la dégradation et la maturation des ARN des mitochondries de plantes supérieures

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T h è s e d e D o c t o r a t / S o m m a i r e

Rôle de la polyadénylation dans la dégradation et la maturation des ARN des mitochondries de plantes supérieures

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Rôle de la polyadénylation dans la dégradation et la maturation des ARN des mitochondries de plantes supérieures

S O M M A I R E

I n s t i t u t d e B i o l o g i e M o l é c u l a i r e d e s P l a n t e s

T h è s e d e D o c t o r a t / S o m m a i r e

I.4.1.1.Unités transcriptionnelles

I.4.1.3.Les ARN polymérases de mitochondries de plante

I.4.2.3.2.Maturation des ARNr

I.4.2.4.Addition aux extrémités 3’ de nucléotides qui ne sont pas codés par le génome

I.4.2.Mécanismes post-transcriptionnels

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I/INTRODUCTION GENERALE

I.2.Fonctions de la mitochondrie dans le métabolisme cellulaire

I.3.2.Structure physique et gènes codés

I.4.Expression du génome mitochondrial de plante

I.4.2.2.L’édition des ARN de la mitochondrie de plante

I.4.2.3.1.Maturation des ARNt

I.5.1.1.1.La RNasE

I.3.Évolution et caractéristiques actuelles du génome mitochondrial de plante

Rôle de la polyadénylation dans la dégradation et la maturation des ARN des mitochondries de plantes supérieures

I.4.1.4.Cofacteurs de l’ARN polymérase mitochondriale

I.5.Dégradation des ARN et polyadénylation

I.5.1.1.Mécanismes de dégradation des ARN chez E. coli

I.1.Origine et diversité des génomes mitochondriaux

I.4.2.1.Epissage de l’ARN dans la mitochondrie de plante

I.4.2.3.3.Maturation des ARNm

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I.5.1.Machinerie de dégradation et polyadénylation chez E. coli

T h è s e d e D o c t o r a t / S o m m a i r e

I.4.2.5.Polyadénylation et stabilité des transcrits mitochondriaux

I.4.2.3.Maturation en 5’ et 3’ des ARN mitochondriaux de plante

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I.4.1.2.Les promoteurs des mitochondries de plante

I.4.1.Transcription des gènes mitochondriaux de plante

I.3.1.Taille et capacité codante

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I.5.1.1.2.Le dégradosome d’E. coli

I.5.1.2.1.Fonction de la polyadénylation chez E. coli

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I.5.2.3.2.Rôle de la polyadénylation dans le mécanisme de dégradation des ARN chloroplastiques

I.5.2.3.1.Caractéristiques de la polyadénylation chloroplastique

I.5.1.1.3.Rôle structural de la RNase E dans le dégradosome

I.5.1.1.5.La PNPase et la RNase II

I.5.2.4.1.La RNase E/G

I.5.2.6.Exonucléases chloroplastiques

I.5.2.4.Endoribonucléases chloroplastiques

I.5.1.2.Polyadénylation des ARN chez E. coli

I.5.2.5.Enzyme(s) responsable(s) de la polyadénylation dans le chloroplaste

I.5.2.3.Polyadénylation des ARN chloroplastiques

I.5.2.Stabilité et polyadénylation des ARN dans le chloroplaste

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I.5.3.Machinerie de dégradation des ARN dans la mitochondrie de levure

I.5.1.1.4.Rôle de l’hélicase RhlB

I.5.2.2.Modes de dégradation des ARN chloroplastiques

I.5.2.6.2.La Ribonucléase II/R

I.5.2.6.1.Polynucléotide phosphorylase (PNPase)

I.5.2.4.2.CSP41a

I.5.1.1.6.D’autres partenaires protéiques du dégradosome

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I.6.Travaux de thèse

I.5.5.Rôle de la polyadénylation dans les mitochondries de trypanosomes

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I.5.1.2.2.Modulation de la polyadénylation chez E. coli

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I.5.4.Rôles de la polyadénylation des ARN dans la mitochondrie humaine

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I.5.1.3.Mécanismes de dégradation et polyadénylation des ARN chez E. coli : résumé

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I.5.2.1.Régulation de la stabilité des ARN chloroplastiques par la lumière

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II.2.1.10.Hybridation

II.2.1.9.Southern Blot

II.2.1.5.Clonage direct d’un produit PCR

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II.2.1.2.Amplification d’ADN par PCR («Polymerase Chain Reaction»)

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II.1.4.Outils informatiques

II.2.1.8.Marquage radioactif d’oligonucléotides

II.1.MATERIEL

II.1.1.Matériel végétal

II.2.2.Techniques relatives à l’ARN

II.2.2.5.Synthèse d’ADNc

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II.2.1.11.Méthode de quantification des acides nucléiques

II.2.2.3.Traitement à la RNase H

II.1.2.Oligonucléotides

II.2.1.6.Préparation d’ADN plasmidique

II.2.1.1.Electrophorèse non-dénaturante

II.1.3.Plasmide

II.2.2.4.Traitement à la DNase

II.2.1.3.Criblage de colonies par PCR

II.2.2.1.Extraction d’ARN mitochondriaux

II.2.2.2.Extraction d’ARN totaux

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II.2.METHODES

II.2.2.6.cRT-PCR

II.2.1.Techniques relatives à l’ADN

Rôle de la polyadénylation dans la dégradation et la maturation des ARN des mitochondries de plantes supérieures

II/MATERIEL ET METHODES

II.2.1.4.Purification de produits de PCR

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II.2.1.7.Séquençage d’ADN

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II.2.2.7.cRT-PCR sur transcrits primaires

III.1.2.2.Caractérisation de la polyadénylation de transcrits mitochondriaux

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Rôle de la polyadénylation dans la dégradation et la maturation des ARN des mitochondries de plantes supérieures

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II.2.2.8.Synthèse d’ARN par transcription in vitro

II.2.2.9.Marquage de transcrits en 5’

II.2.2.13.Hybridation

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II.2.4.Techniques relatives aux plantes et à la purification de protéines surexprimées dans les plantes76

III.1.2.1.Stratégie d’étude

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III.1.2.2.1.Polyadénylation des ARN messagers mitochondriaux

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II.2.3.2.Activité mitochondriale de dégradation d’ARN messager

II.2.2.12.Northern Blot

II.2.2.10.Fractionnement par électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions déna- turantes71

II.2.3.1.Purification de mitochondries

II.2.2.11.Fractionnement par électrophorèse en gel d’agarose en conditions dénaturantes72

II.2.4.2.Purification de protéines par la méthode TAP (Tandem Affinity Purification)

III.1.Les ARN messagers polyadénylés de mitochondries de plante supé- rieure sont dégradés par une activité exoribonucléasique 3’-5’ qui progresse sans être gênée par des structures secondaires stables. 82

II.2.3.Techniques relatives aux mitochondries et aux protéines

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II.2.3.3.Chromatographie en couche mince

III.1.2.Identification d’ARN polyadénylés de la mitochondrie de S. tuberosum

II.2.4.5.Semis de graines d’Arabidopsis thaliana

II.2.4.1.Production de plantes transgéniques

II.2.4.4.Localisation sub-cellulaire de protéines

II.2.4.3.Test d’activité de la protéine RNase II-Tag

III.1.1Introduction

III/Résultats