DETECCIÓN DE VARIABILIDAD GENÉTICA POR MICROSATÉLITES EN EL ALANO ESPAÑOL (MICROSATELLITE VARIATION IN SPANISH ALANO DOGS)

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Resumen
En una muestra de 35 alanos españoles se investigó la utilidad de los microsatélites para detectar variabilidad genética y para el control de paternidad. Los 4 microsatélites utilizados, descritos ya en la bibliografía, resultaron polimórficos, con un número medio de 5 alelos/ locus y una heterocigosis media (H), de 0,70 ± 0,06, similar a la de otras razas caninas. Se ha detectado una desviación del equilibrio Hardy-Weinberg para dos microsatélites debida a un déficit de heterocigotos. En un microsatélite se han detectado alelos inexistentes en otras razas españolas, por lo que podrían ser específicos de raza. La probabilidad acumulada de exclusión de paternidad es superior al 90 p.100, por lo que podrían ser eficaces para estas pruebas en alanos.
Abstract
We have studied a sample of 35 spanish alano dogs in order to estimate the level of genetic variability that can be detected by using microsatellites and the efficiency of these genetic markers as tools for parentage testing in this canine population. We have used 4 microsatellites previously described in the literature. All of them were polymorphic, with an average number of 5 alleles/ locus and an average gene diversity (H) of 0,70 ± 0,06, similar to the figures reported in others breeds. Two of the microsatellites showed disa-greement with Hardy-Weinberg proportions, due to a deficit of heterozygotes. We have found in one of the microsatellites alleles that could be breed specific, as they have not been detected in other spanish breeds. The combined exclusion probability detected is higher than 90 percent, suggesting the possibility of using efficiently microsatellites in parentage testing in the spanish alano population.
Publié le : vendredi 1 janvier 1999
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Source : Archivos de Zootecnia 0004-0592 1999 Volumen 48 Número 181 pp: 63-70
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DETECCIÓN DE VARIABILIDAD GENÉTICA POR
MICROSATÉLITES EN EL ALANO ESPAÑOL
MICROSATELLITE VARIATION IN SPANISH ALANO DOGS
Morera, L., D.F. de Andrés, M. Barbancho, J.J. Garrido y C.J. Barba
Grupo de Investigación Marcadores genéticos moleculares en animales domésticos . Facultad de Veteri
naria. Departamento de Genética. Avda. Medina Azahara, 9. 14005 Córdoba. España.
E mail: gm1mosal@lucano.uco.es
PALABRAS CLAVE ADICIONALES ADDITIONAL KEYWORDS
PCR. Perros. Marcadores genéticos. Pruebas de PCR. Dogs. Genetic markers. Parentage testing.
paternidad.
RESUMEN
En una muestra de 35 alanos españoles se microsatellites and the efficiency of these genetic
investigó la utilidad de los microsatélites para markers as tools for parentage testing in this
detectar variabilidad genética y para el control de canine population. We have used 4 microsatellites
paternidad. Los 4 microsatélites utilizados, des previously described in the literature. All of them
critos ya en la bibliografía, resultaron polimórficos, were polymorphic, with an average number of 5
con un número medio de 5 alelos/ locus y una alleles/locus and an average gene diversity (H) of
heterocigosis media (H), de 0,70 ± 0,06, similar 0,70 ± 0,06, similar to the figures reported in
a la de otras razas caninas. Se ha detectado una others breeds. Two of the microsatellites showed
desviación del equilibrio Hardy Weinberg para disa greement with Hardy Weinberg proportions,
dos microsatélites debida a un déficit de hetero due to a deficit of heterozygotes. We have found
cigotos. En un microsatélite se han detectado in one of the microsatellites alleles that could be
alelos inexistentes en otras razas españolas, por breed specific, as they have not been detected in
lo que podrían ser específicos de raza. La proba other spanish breeds. The combined exclusion
bilidad acumulada de exclusión de paternidad es probability detected is higher than 90 percent,
superior al 90 p.100, por lo que podrían ser suggesting the possibility of using efficiently
eficaces para estas pruebas en alanos. microsatellites in parentage testing in the spanish
alano population.
SUMMARY
INTRODUCCIÓN
We have studied a sample of 35 spanish
alano dogs in order to estimate the level of Los microsatélites son regiones del
genetic variability that can be detected by using genoma eucariótico en las que una
Arch. Zootec. 48. 63 70. 1999.MORERA ET AL.
secuencia corta (2 6 pb) se repite cier poner de marcadores genéticos que
to número de veces. A partir de la permitan la identificación individual
demostración de la existencia de va y la realización de controles de pater
riabilidad genética en estas regiones y nidad. Los microsatélites, tanto por
la posibilidad de su detección median sus características mencionadas, como
te amplificación por PCR (Weber y porque se ha demostrado su capacidad
May, 1989), los microsatélites se han de detectar polimorfismo genético aún
convertido en la principal fuente de en especies en las que los marcadores
marcadores genéticos, ya que son abun clásicos no son capaces de hacerlo
dantes, están distribuidos regularmen (Petit et al., 1997), son los marcadores
te en el genoma, se heredan de forma más adecuados para ello.
codominante y poseen un elevado gra Recientemente se han iniciado tra
do de variabilidad en las poblaciones. bajos sobre análisis de variabilidad
Debido a ello, están adquiriendo una genética, por medio de microsatélites,
importancia creciente en los últimos en poblaciones caninas de varias razas
años en estudios sobre análisis de va españolas: podenco andaluz, perro de
riabilidad genética y relaciones entre agua, galgos y manetos, habiéndose
especies y razas, así como para contro detectado variabilidad en las cuatro
les de paternidad o identificación de razas, con un número de alelos entre 4
muestras (Buchanan et al., 1994; 10/locus, una heterocigosidad entre
Marklund et al., 1994; Sergio et al., 0,51 0,85 y una probabilidad de ex
1994; Vega Pla et al., 1996; Petit et clusión de paternidad que varía, para
al., 1997; Moazami Goudarzi et al., los diferentes microsatélites, entre
1997; Williams et al., 1997). 0,29 0,70 (Morera et al., 1997).
Con respecto al genoma canino, en En este trabajo se trata de estimar
los últimos años se han publicado re el grado de variabilidad genética que
sultados sobre identificación de mi es posible detectar en la población de
crosatélites (Primmer y Mathews, perros alanos españoles utilizando mi
1993; Ostrander et al., 1993; Holmes crosatélites, así como su eficacia para
et al., 1993 y 1995), así como sobre supruebas de control de paternidad en
utilización para el desarrollo del mapa esta población.
de ligamiento del genoma canino
(Mellers et al., 1997), estudios de di
ferenciación genética entre especies o MATERIAL Y MÉTODOS
razas (Fredholm y Winter, 1995;
El alano español es un perro dePihkanen et al., 1996) y controles de
mediano tamaño y aspecto fornido,paternidad (Zajc et al., 1994; Usha et
rústico y primitivo, de origen molo al., 1995; Fredholm y Winter, 1996).
soide, encuadrado entre los perros deExiste actualmente un creciente
presa. La alzada a la cruz es de 56 60interés en las Asociaciones de criado
cm y el peso medio de 30 35 kg. Elres y en organismos oficiales en mejo
pelo es corto y abundante y la capa esrar la gestión de los libros genealógicos
de las razas caninas españolas (Anóni generalmente atigrada o barcina, des
mo, 1997). Para ello es necesario dis- de la gama más clara a la más oscura.
Archivos de zootecnia vol. 48, núm. 181, p. 64.VARIABILIDAD GENÉTICA EN EL ALANO ESPAÑOL
Tabla I. Características de los microsatélites. (Characteristics of the microsatellites).
1 2Microsatélite Sec. repetitiva Alelos PIC Ta Mg Referencia
AHT 101 (GT) 7 0,72 56° 1 mM Holmes et al., 1993
23
VIAS D10 (CATA) 6 0,71 52° 1,5 mM Primmer y Matthews, 1993
14
CXX.30 (GT) (CA) ? 0,77 60° Ostrander et al., 1993
4 13
CXX.140 (GT) ? 0,76 60° 1,5 mMet al.,
15
1número de alelos descritos por los autores referenciados. ?: datos no disponibles.
2Valores PIC obtenidos por los autores en muestras compuestas por animales de varias razas.
Ta: temperatura de annealing; Mg: concentración de magnesio utilizada en la amplificación.
Reactivos: 200 mM de dNTPs, 0,5 mM de cada primer y 0,5 unidades de Taq polimerasa, en un volumen
final de 25 ml. La amplificación se realizó a partir de una dilución 1/100 de un lisado de linfocitos,
obtenidos de las muestras de sangre y mantenidos a 20°C hasta su utilización.
Amplificación: 8 min a 95°, seguidos de 30 ciclos de 1 min / 94°, 1 min / Ta, 1 min / 72°, finalizando con
10 min a 72°.
Electroforesis: 5 ml del producto PCR más 5 ml de formamida, calentados 5 min a 95° y cargados en geles
de acrilamida 6 p.100, 7M Urea.
Revelado: Tinción de plata, según Budowle (1991) y Vega Pla (1996).
Asimismo son muy comunes las capas Hypaque. En la tabla I se indican los
leonadas o bayas, desde las tonalida microsatélites utilizados, elegidos en
des claras a las encendidas. La pobla tre los descritos por su grado de varia
ción está compuesta por unos 200 in bilidad, así como los detalles de la
dividuos (Sanz y Marín, 1982). técnica seguida para su detección.
El trabajo se ha realizado con un La heterocigosidad esperada (He)
grupo de 35 animales, localizados en para cada locus y la promedio para los
diferentes lugares (Huelva, Sevilla y cuatro loci se han calculado según Nei
León) del área de distribución de la (1987). La prueba de equilibrio Hardy
población. Cinco de ellos eran medio Weinberg se ha realizado utilizando
hermanos y el resto, según los datos tests exactos mediante el método de
conocidos, no emparentados. De cada cadena de Markov (Guo y Thompson,
animal se obtuvieron de 5 7 ml de 1992). Todos estos cálculos se han
sangre total, en tubos Vacutainer realizado con el programa TFPGA
(EDTA K). Las muestras se mantu (Miller, 1997). Este programa tam
vieron refrigeradas hasta su traslado al bién proporciona los datos relativos a
laboratorio, dentro de las 24 horas las frecuencias alélicas y a la hetero
siguientes a la extracción. De cada cigosis observada, por recuento direc
muestra se obtuvieron linfocitos, para to, a partir del archivo base de datos.
la amplificación por PCR, mediante Los errores típicos correspondientes a
centrifugación (10 min, 10.000 rpm)
en gradiente de densidad de Ficoll cigosis se han calculado, igualmente,
Archivos de zootecnia vol. 48, núm. 181, p. 65.MORERA ET AL.
según Nei (1987). El déficit o exceso Ho)/He, (Ho= heterocigosis observa
de heterocigotos para cada locus (fi) y da) y f= åfn(k 1)/ån(k 1), (n: nú
i i i i i
el déficit promedio para los cuatro loci mero de animales, k: número de alelos,
(f) se han calculado mediante f = (He respectivamente, del locus i) (Kidd et
i
Tabla II. Resultados obtenidos para los microsatélites utilizados en el estudio de la muestra
de perros alanos. (Results obtained in the study of the sample from spanish alano dogs).
frecuencia frecuencia
Locus Alelos ± error típico Locus Alelos ± error típico
AHT101 1 0,021 ± 0,017 CXX.30 1 0,148 ± 0,042
(n = 34) 2 0,229 ± 0,050 (n = 35) 2 0,222 ± 0,049
3 0,625 ± 0,058 3 0,093 ± 0,035
4 0,125 ± 0,039 4 0,056 ± 0,027
5
6 0,241 ± 0,051
7 0,185 ± 0,046
Rango de tamaños (pb): 136 130 Rango de tamaños (pb): 173 151
He ± e.t.: 0,559 ± 0,053 He ± e.t.: 0,833 ± 0,017
f = 0,527 f = 0,005i i
Test H W (p ± e.t.): 0,004 ± 0,003 Test H W (p ± e.t.): 0,75 ± 0,025
PIC = 0,50 PIC = 0,80
P.E. = 0,297 P.E. = 0,645
frecuencia frecuencia
Locus Alelos ± error típico Locus Alelos ± error típico
VIAS D10 1 0,065 ± 0,029 CXX.140 1 0,357 ± 0,059
(n = 35) 2 0,210 ± 0,049 (n = 34) 2 0,446 ± 0,060
3 0,290 ± 0,054 3 0,179 ± 0,046
4 0,306 ± 0,055
5 0,113 ± 0,038
6 0,016 ± 0,015
Rango de tamaños (pb): 133 109 Rango de tamaños (pb): 143 139
He ± e.t.: 0,775 ± 0,021 He ± e.t.: 0,637 ± 0,025
f = 0,032 = 0,308f
i i
Test H W (p ± e.t.): 0,51 ± 0,022 Test H W (p ± e.t.): 0,03 ± 0,003
PIC = 0,72 PIC = 0,55
P.E.: 0,538 P.E.: 0,337
n = número de animales estudiados. Ho: heterocigosis observada, He: estimación insegada de la
heterocigosis. e.t.: error típico; P.E.: probabilidad de exclusión de paternidad; PIC: contenido informativo
del polimorfismo.
Archivos de zootecnia vol. 48, núm. 181, p. 66.VARIABILIDAD GENÉTICA EN EL ALANO ESPAÑOL
al., 1980). La probabilidad de exclu detectados para uno de los microsaté
sión de paternidad para cada locus lites estudiados: VIAS D10.
(PE), así como la probabilidad combi
nada de exclusión para los cuatro loci ESTADÍSTICOS DESCRIPTIVOS
(PEG), se han calculado según Los cuatro loci son polimórficos en
Jamieson y Taylor (1997). Los valores la población de alanos. La variabili
PIC se han calculado según Botstein et dad genética detectada, estimada por
al. (1980). el número de alelos y la heterocigosis
para cada locus, es bastante alta. El
número de alelos varía entre 3 ( locus
RESULTADOS Y DISCUSIÓN CXX.140) y 7 ( locus CXX.30), con un
número medio de 5 alelos/locus. El
En la tabla II se recogen los resul rango de tamaños de los alelos, obteni
tados obtenidos para cada uno de los do por comparación con un marcador
cuatro microsatélites estudiados, en de tamaños (pBR322 DNA, digerido
cuanto a los estadísticos descriptivos con MspI), se muestra en la tabla II.
básicos, equilibrio Hardy Weinberg y La heterocigosis para cada locus osci
probabilidad de exclusión de paterni la entre 0,55 ± 0,053 ( locus AHT101)
dad. La figura 1 muestra los alelos y 0,83 ± 0,017 ( locus CXX.30), siendo
Figura 1. Alelos detectados para el microsatélite VIAS D10 por electroforesis en geles de
poliacrilamida 6 p.100 7 M Urea de 5 ml del producto de la amplificación por PCR y tinción
de plata. (Alleles detected at the locus VIAS D10. PAGE 6 percent 7M Urea and silver stainning).
Archivos de zootecnia vol. 48, núm. 181, p. 67.MORERA ET AL.
la heterocigosis media de 0,70 ± 0,06. distribución de la población sería ne
Los valores PIC oscilan entre 0,50 cesario para confirmar o descartar la
(AHT101) y 0,80 (CXX.30), con un existencia de un déficit global de hete
valor promedio de 0,64. rocigotos en esta población y analizar
La variabilidad detectada por estos sus posibles causas.
microsatélites en el alano español,
comparada con la encontrada por los COMPARACIÓN CON OTRAS RAZAS ES-
autores correspondientes en una mues PAÑOLAS
tra de animales de diversas razas (ta La comparación de los resultados
bla I), es similar para los loci VIAS descritos en alanos con los obtenidos
D10 y CXX.30 e inferior para AHT101previamente en otras cuatro razas es
y CXX.140. Respecto a la variabilidadpañolas: galgo español, manetos,
hallada por otros autores en otras ra perro de agua español y podenco anda
zas caninas, con microsatélites dife luz (Morera et al., 1997), indica que el
rentes, nuestros valores son similares perfil genético detectado por estos mi
a los descritos por Pihkanen et al. crosatélites en la población de alanos
(1996) en German Shepherd (5 alelos/ es distinto al de las otras cuatro razas,
locus y una heterocigosis media de lo que se pone manifiesto en la exis
0,60), y algo superiores a los encontra tencia de diferencias estadísticamente
dos por Fredholm y Wintero (1995) ensignificativas en la distribución de fre
Flat coated Retriever (4,5 alelos/ locus cuencias de los alelos comunes, así
y una heterocigosis media de 0,52) y como en la existencia en uno de los
Dachshlund (5,6 alelos/locus y una loci, CXX.30, de alelos que aparecen,
heterocigosis media de 0,55). en el grupo de animales estudiado,
como específicos de raza (alelos 1 y 3)
EQUILIBRIO H ARDY WEINBERG o como prácticamente exclusivos de
Dos de los loci estudiados ( VIAS esta raza (alelo 2, que sólo se ha detec
D10 y CXX.30) se encuentran en equi tado, además de en los alanos, en los
librio Hardy Weinberg (p>0,05), manetos y con una frecuencia inferior
mientras que otros dos se apartan de al 2 p.100).
esta situación, debido en ambos casos Por otra parte, la población de ala
a un déficit estadísticamente signifi nos aparece como más homogénea
genéticamente que las otras razas es cativo de heterocigotos: AHT101
(p<0,01) y CXX.140 (p<0,05). El défi pañolas. Esto se manifiesta en que
cit promedio para el conjunto de los tanto el número de alelos detectados
cuatro loci es estadísticamente no sig como los valores de heterocigosis son,
nificativo (f= 0,132; p>0,05). Dife en general, menores. Esta situación
rentes factores pueden conducir a un puede ser debida, al menos en parte, a
déficit de heterocigotos, entre ellos la un efecto de deriva genética, causado
consanguinidad y la subestructuración por la drástica reducción de tamaño
poblacional (efecto Whalund). Un es sufrida por esta población en el pasado
tudio más amplio, incorporando nue siglo, hasta el extremo de llegar a ser
considerada como extinta (Sanz yvos loci y aumentando el número de
muestras de cada una de las áreas de Marín, 1982). Pérdidas de polimor
Archivos de zootecnia vol. 48, núm. 181, p. 68.VARIABILIDAD GENÉTICA EN EL ALANO ESPAÑOL
fismo genético en otras poblaciones mutación (Jamieson y Taylor, 1997).
caninas españolas, debidas a este efec En conclusión, dado que los micro
to de deriva genética, han sido descri satélites que hemos utilizado en este
tas en Perdiguero de Burgos, Ca de trabajo fueron elegidos sin un conoci
Bestiar y Podenco Canario (Jordana et miento previo de su valor como detec
al., 1991). tores de polimorfismo en la población
de alanos, y que los cuatro han resulta
PROBABILIDADES DE EXCLUSIÓN DE PA- do polimórficos, poniendo de mani
TERNIDAD fiesto un alto grado de variabilidad,
Se ha estimado la posibilidad de nuestros resultados muestran la posi
realizar eficazmente pruebas de pater bilidad de realizar eficazmente en ella,
nidad en la población de alanos, calcu utilizando microsatélites, estudios de
lando la probabilidad a priori de ex diferenciación genética respecto de
clusión de paternidad para cada otras razas, así como identificación de
microsatélite (tabla II) . La probabili individuos y controles de paternidad.
dad de exclusión acumulada para los
cuatro loci, (0,92), indica que esto es
AGRADECIMIENTOSfactible. La realización de este tipo de
pruebas requeriría, sin embargo, au
A todos los criadores, y especial mentar el número de microsatélites
mente a la Unión de Criadores delutilizados, tanto para alcanzar valores
significativamente mayores de la pro Alano Español, que han colaborado
babilidad de exclusión acumulada, para la obtención de las muestras de
superiores al 99 p.100, como para evi sangre. Igualmente agradecemos su
tar exclusiones incorrectas debidas a colaboración a BIOVET UCO.
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Archivos de zootecnia vol. 48, núm. 181, p. 70.

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