Quimioluminiscencia: una interesante alternativa para la detección analítica en sistemas de flujo. (Unfamiliar though exciting analytical detection in flowing streams: chemiluminescence)

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g/mL for acetamide and propianamide.

Publié le : lundi 1 janvier 2001
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Source : Ars Pharmaceutica 0004-2927 2001 Volumen 42 Número 1-2
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QUIMIOLUMINISCENCIA: UNA INTERESANTE ALTERNATIVA PARA LA DETECCIÓN ANALÍTICA EN SISTEMAS DE FLUJO 81
Quimioluminiscencia: una interesante alternativa
para la detección analítica en sistemas de flujo
Unfamiliar though exciting analytical detection in flowing streams:
chemiluminescence
1 2 3 1 1GARCÍA-CAMPAÑA, AM. , BAEYENS WRG ; ZHANG X ; ALÉS F , GÁMIZ L .
1 University of Granada, Faculty of Sciences, Dept. of Analytical Chemistry,
Avda. Fuentenueva s/n, E-18071 Granada, Spain
2 Ghent University, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Dept. of Pharmaceutical Analysis,
Harelbekestraat 72, B-9000 Ghent, Belgium
3Tsinghua University, Dept. of Chemistry, Analysis Center, Tsinghua Yuan, Beijing 100084, P. R. China
RESUMEN
El estudio del tipo de interacción involucrada en la formación de dispersiones sólidas de tolbutamida con distintas
proporciones de acetamida y propianamida, ha requerido del diseño y validación de un método analítico por cromatografía
líquida de alta eficacia (CLAE) que permita cuantificar la proporción de los transportadores en mezclas físicas y en
dispersión sólida. El método resultó ser lineal, preciso y exacto en el intervalo de concentración de 100-1,56 μμμμμg/mL
para tolbutamida y 50-0,781 μμμμμg/mL para acetamida y propianamida.
PALABRAS CLAVE: tolbutamida, propianamida, acetamida, cromatografía líquida, CLAE.
ABSTRACT
The interest to design and validate a high performance liquid chromatography method for quantification of tolbutamide,
acetamide and propianamide in solid dispersions, was to find a relation among the amount of carriers and the active
substance in solid dispersions, in order to further investigate the drug-carrier interaction pattern responsible of solid
dispersion formation. The method was lineal, precise and accurate in the concentration range between 100.0 - 1.56 μg/
μmL for tolbutamide and 50.0 - 0.78 g/mL for acetamide and propianamide.
KEY WORDS: tolbutamide, propianamide, acetamide, HPLC.
INTRODUCCIÓN INTRODUCTION
Chemiluminescence(CL)-based analysis isEl uso analítico de la quimioluminiscencia (QL)
growing fast offering simple, low cost and sen-está experimentando un creciente interés, ya que
sitive means of measuring a variety of compounds.representa una alternativa simple, barata y sen-
Since over 30 years, the phenomenon ofsible para cuantificar una gran variedad de com-
luminescence -originally a curiosity in the phy-puestos.
sical laboratory- has provided a well-establishedDesde hace unos treinta años, el fenómeno de
and widely applied spectrometric branch of analy-la luminiscencia -originalmente una curiosidad
tical chemistry. Owing to elegant new instru-del laboratorio físico-, se ha convertido en una
mentation and especially to new techniques, somerama de la espectrometría aplicada, dentro de la
of which entirely new and some borrowed fromquímica analítica. Debido a la nueva instrumen-
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tación y, especialmente a la incorporación de other disciplines, CL and bioluminescence can
técnicas modernas, algunas nuevas y otras toma- be routinely applied to qualitative and quantita-
das de otras disciplinas, la QL y la bioluminis- tive analytical problems.
cencia (BL) se aplican de forma rutinaria en el Although the luminescence phenomena are
análisis tanto cuali- como cuantitativo. known since over 300 years before Christ, the
Aunque el fenómeno de la QL se conoce desde development of CL analytical applications is
300 años a.C., el desarrollo de aplicaciones ana- relatively recent. Due to its high sensitivity and
líticas es relativamente reciente. Debido a su alta selectivity, CL-based detection has become qui-
sensibilidad y selectividad, los métodos basados te a useful analytical technique. The first appli-
en detecciones QL suponen una herramienta cation of CL as analytical tool was carried out
analítica de gran utilidad. La primera aplicación by Erdey in 1957, who studied the use of several
de la QL como técnica analítica la llevó a cabo substances as luminol, lophine and lucigenine as
Erdey en 1957, que estudió el uso de varias volumetric indicators. Investigations on the po-
sustancias, como luminol, lofina y lucigenina, tentials of CL for analytical routine applications
como indicadores volumétricos. Las investiga- date from the seventies for gas phase and from
ciones sobre el potencial analítico de la QL para the eighties for liquid phase reactions. Since then,
análisis de rutina datan de los años 70, en el CL methods have been more widely used, main-
caso de reacciones en fase gaseosa, y de la dé- ly in biochemical and environmental analysis,
cada de los 80 para reacciones en fase líquida. the number of articles and communications ex-
Desde entonces, los métodos quimioluminiscen- ponentially increasing since the first Biolumi-
tes han sido más ampliamente utilizados, funda- nescence and Chemiluminescence International
mentalmente en análisis bioquímico y ambien- Symposium held in Brussels back in 1978. In
tal, y el número de publicaciones y comunicaciones fact, the development of CL methods can be
sobre el tema ha ido incrementando de forma differentiated in two stages: a first period (1928-
exponencial desde la celebración del primer Sim- 1940) characterized by the search of new chem-
posium Internacional sobre Bioluminiscencia y iluminescing compounds or systems by means
Quimioluminiscencia, celebrado en Bruselas en of chemical modifications of well-known struc-
1978. De hecho, en el desarrollo de métodos QL tures and, since the 2ndWorld War until to-day,
pueden diferenciarse dos periodos: una primera a growing progress in the instrumentation toge-
etapa (1928-1940) caracterizada por la búsqueda ther with the development of theoretical concepts
de nuevos compuestos o sistemas quimiolumi- on the often complex CL principles.
niscentes, por medio de modificaciones quími- The powerful analytical applications of CL as
cas de estructuras bien conocidas, y, desde la 2ª a detecting tool in flow injection, column liquid
Guerra Mundial hasta el presente, un avance en chromatographic and in capillary electrophoretic
la instrumentación, junto con el desarrollo de separating systems, together with the potentials
conceptos teóricos de los, a veces, complejos in immunoassays make this technique a most
principios de la QL. interesting field of research for scientists in a
Las grandes aplicaciones analíticas de la QL wide variety of disciplines, including separatio-
como método de detección en inyección en flu- nal sciences in chemistry, biology, pharmaceuti-
jo, cromatografía líquida (CL) y electroforesis cal, biomedical and food analysis, the various
capilar (EC), junto con el gran potencial del in- quality control areas, etc.
munoensayo, hacen de esta técnica un campo de A recent trend in analytical chemistry invol-
investigación muy interesante en una amplia ves the application of CL as detection system in
variedad de disciplinas, que incluyen técnicas de combination with capillary electrophoresis as prior
separación en análisis químico, biológico, far- separation methodology, providing excellent analy-
macéutico, biomédico y alimentario, control de tical sensitivity and selectivity and allowing the
calidad, etc. resolution and quantification of various analytes
1Las tendencias más actuales en química ana- in relatively complex mixtures [ ].
lítica implican la aplicación de la QL como sis- Until the nineties, chemiluminometric detec-
tema de detección, combinada con EC como tion was not applied after capillary electrophore-
método previo de separación, proporcionando una tic separation, but fast developments from some
selectividad y sensibilidad analítica excelentes y important research groups and companies have
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permitiendo la resolución y cuantificación de varios been noticed in these last years; hence further
1analitos en mezclas relativamente complejas [ ]. developments are expected.
Hasta la década de los noventa, la detección The number of reactions producing CL cited
por QL no había sido acoplada a la EC, pero en in the literature is increasing annually, with analy-
estos últimos años, se han publicado importantes tical applications in chemical, biomedical, food,
desarrollos por parte de algunas compañías y environmental and toxicological disciplines. In
grupos de investigación, por lo que se esperan combination with HPLC separations, several CL
futuras contribuciones sobre el tema. reactions have been used, amongst others, pe-
El número de reacciones quimioluminiscen- roxyoxalate, firefly luciferase, lucigenin and lu-
tes citadas en bibliografía, con aplicaciones en minol, the peroxyoxalate reaction being the most
química, biomedicina, alimentación, medioam- commonly used CL-based system for post-co-
biente y toxicología, se ve incrementado anual- lumn detection in conventional and in microco-
mente. lumn LC set-ups. Continuous flow CL-based
Combinado con separaciones por cromatografía detection of several analytes has been widely
líquida de alta resolución (CLAR) , se han em- applied by several groups for the determination
pleado varias reacciones quimioluminiscentes, of diverse biological compounds and drugs.
entre otras con peroxioxalato, luciferasa, lucige- Today, analytical interest in the application of
nina y luminol, siendo la más común la reacción CL is growing considerably due to the cited advan-
con peroxioxalato en detección post-columna tages as low detection limits, wide dynamic ran-
acoplada a cromatografía líquida, tanto conven- ges, high sensitivity and the versatility of chemilu-
cional como empleando microcolumnas. Asimis- minometric methods. Recently, increasing interest
mo, se han empleado sistemas de flujo continuo was focussed on CL products for life sciences re-
con detección basada en QL, para la determina- search; in clinical diagnostics, for example, CL is
ción de varios fármacos y analitos de interés nowadays suggested as a sensitive substitute for
biológico. isotopic labelling, replacing radioisotopes. CL is
Hoy en día, el interés analítico de la QL está applied as well in the quality control of meat pro-
aumentando considerablemente debido a las ven- ducts and residues and future projects are focussed
tajas ya comentadas, como bajos límites de de- on environmental ozone measurements.
tección, rangos dinámicos amplios, alta sensibi- The sensitivity offered by CL-based reactions
lidad y la gran versatilidad de los métodos QL. is often needed, for example in the assay of illi-
Recientemente, las investigaciones se están cen- cit compounds within various matrices. Moreover,
trando especialmente en el desarrollo de produc- the interest in analytical CL for the last decade
tos quimioluminiscentes para aplicaciones de can be illustrated by the number of published
diagnóstico clínico; así, la QL es hoy en día un papers in prestigeous analytical journals (e.g.,
posible sustituto del marcado isotópico, rempla- Analytical Chemistry, The Analyst, Analytica
zando así el uso de radioisótopos. La QL se aplica Chimica Acta, Fresenius’ Zeitschrift für Analy-
también en el control de calidad de productos tische Chemie, Journal of Microcolumn Separa-
cárnicos y residuos, existiendo igualmente apli- tions, Journal of Pharmaceutical and Biomedical
caciones en la medida del ozono ambiental. Analysis, to name a few) and by the existence of
Considerablemente ventajosa resulta la sensi- a dedicated specific journal, the Journal of Bio-
bilidad que ofrecen las reacciones basadas en logical and Chemical Luminescence.
QL en diversos ámbitos del análisis aplicado, It is clear that the need for improving detec-
por ejemplo en la determinación de compuestos tion technology is nowadays related to the gene-
prohibidos en diversas matrices. Así, el interés ral trend in analytical chemistry to miniaturize
de la QL en química analítica en la última déca- and thus reduce waste volumes of organic sol-
da queda demostrado por el número de artículos vents in separational set-ups, and by using more
publicados en revistas de gran prestigio (Analy- aqueous systems, studying smaller samples at
tical Chemistry, The Analyst, Analytica Chimica increasingly lower concentrations. As the CL
Acta, Fresenius’ Zeitschrift für Analytische Che- technique may provide improvement in these
mie, Journal of Microcolumn Separations, Jour- situations, the instrumentation for CL measure-
nal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, ments and the coupling with a selective physical
entre otras) y por la aparición de una revista or chemical interface to achieve selective mea-
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específica: Journal of Biological and Chemical surements is likewise aimed at. In this way, di-
Luminescence. sadvantages of direct CL-based techniques (e.g.,
Siguiendo la tendencia general en química lack of selectivity, sensitivity to various physi-
analítica, la mejora en los métodos de detección co-chemical factors) are avoided. Specific deve-
está dirigida actualmente a la miniaturización y, lopments in chromatography, capillary electro-
por lo tanto, a reducir el gasto de disolventes phoresis, immunoassay and the use of enzyme
orgánicos en métodos de separación, empleando reactions are being progressively reported. Mi-
más sistemas acuosos y volúmenes de muestra crochip-sized systems are attractive from this point
menores con concentraciones inferiores. Como of view, as the problem of modest to unsatisfac-
las técnicas quimioluminiscentes pueden propor- tory detection limits characteristic for these sys-
cionar mejoras en estas situaciones, la instru- tems may be overcome.
mentación para medidas quimioluminiscentes y Moreover, the problem of waste disposal is
el desarrollo de acoplamientos con interfaces gradually forcing analytical separating systems into
selectivas físicas o químicas que permitan medi- miniaturization, e.g., narrow-bore and capillary
das selectivas están también dirigidos a conse- liquid chromatography versus high performance
guir este fin, de modo que puedan eliminarse las liquid chromatography (HPLC), miniaturized high
desventajas de las técnicas basadas en medidas performance thin layer chromatography (HPTLC),
directas de QL (como falta de selectividad o and, for recent years, capillary electrophoresis.
dependencia de factores físico-químicos). Así, se As the CL phenomenon may be applied to
están publicando progresivamente avances espe- solve the problem of detection limitations in
cíficos en cromatografía, EC, inmunoensayo y particular in narrow-bore liquid chromatographic
en el uso de reactores enzimáticos. Desde este and capillary electrophoretic set-ups, not using
punto de vista, los sistemas miniaturizados (“mi- hazardous labels, the former technique is bound
crochip”) son muy atractivos, ya que puede re- to be thoroughly explored for the coming deca-
solver el problema de los límites de detección de. As an example, it may be mentioned that in
poco satisfactorios característicos de estos siste- recent years a CL-based detection system using
mas. EMMA (electrophoretically mediated microas-
Asimismo, el problema del gasto de disol- say) of enzymes was described, allowing the
vente está potenciando gradualmente el uso de detection of enzymes at the zeptomole level in
sistemas analíticos de separación miniaturizados, both open tubular capillaries and channels in
tales como la cromatografía líquida capilar y de microfabricated devices, oxidase and catalase being
columnas de pequeño diámetro (“narrow-bore”) detected at levels of 9000 molecules employing
frente a la CLAR, cromatografía en capa fina de inexpensive instrumentation.
alta resolución miniaturizada, y recientemente EC. Without any doubt, when compared to other,
Debido a que la QL puede resolver las limitacio- conventional and powerful detection modes (fluo-
nes en la detección en estos casos, resulta previ- rescence, electrochemical), CL detection is a
sible el desarrollo de este acoplamiento en la developing technique and advances are focused
próxima década. Como ejemplo, puede mencio- on the development of new detectors that are
narse un sistema descrito recientemente, basado instrumentally simpler than existing ones and that
en detección quimioluminiscente de enzimas y offer the ability to detect various types of analytes
que emplea la técnica denominada “microensayo at trace levels.
a través de electroforesis” (EMMA, electrophore-
tically mediated microassay), que permite la de-
tección de enzimas a niveles de zeptomoles, tanto FUNDAMENTALS OF
en capilares abiertos como en canales realizados CHEMILUMINESCENCE
en microchips, detectándose la oxidasa y catalasa
a niveles de 9000 moléculas y empleando una Chemiluminescence is defined as the emis-
instrumentación relativamente económica. sion of electromagnetic radiation (usually in the
Sin ninguna duda, cuando se compara con otros visible or near infrared region) produced by a
métodos de detección convencionales y potentes chemical reaction.
(fluorescentes o electroquímicos), la detección When this emission originates from living
QL es una técnica en pleno desarrollo y sus avances organisms or from chemical systems derived from
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se dirigen hacia el desarrollo de nuevos detecto- it, it is named bioluminescence (BL). Both phe-
res más simples que los ya existentes y que ofrez- nomena are luminescence processes that have been
can la posibilidad de determinar varias clases de traditionally distinguished from related emissio-
analitos a niveles traza. ns by a prefix that identifies the energy source
responsible for the initiation of emission of elec-
tromagnetic radiation. Contemporary luminescence
processes have been added to the list of lumines-FUNDAMENTOS DE LA QL
cence phenomena, as can be seen in Table 1.
Because the emission intensity is a functionLa QL se define como la emisión de radia-
of the concentration of the chemical species in-ción electromagnética (normalmente en la región
volved in the CL reaction, measurement of emis-del visible o del infrarrojo cercano) producida
sion intensities can be used for analytical purpo-por una reacción química. Cuando esta emisión
ses. An advantage of CL techniques is that it isproviene de organismos vivos o sistemas deriva-
possible to employ rather simplified basic ins-dos de ellos, se denomina bioluminiscencia. Ambos
trumentation, as the optical system requires nofenómenos son procesos luminiscentes que se han
external light source. CL is often described as aidentificado tradicionalmente mediante un prefijo
dark-field technique: the absence of strong bac-que identifica la fuente de energía responsable del
kground light levels, such as found in spectro-inicio de la emisión de radiación electromagnéti-
photometry and fluorimetry, reduces noise sig-ca. Actualmente, los procesos de luminiscencia se
nals and leads to improved detection limits.han incluido en la lista de fenómenos luminiscen-
Instrumentation for CL measurements ranges fromtes, como se indica en la Tabla 1.
simple to very complex, that is, allowing the useComo la intensidad de emisión es función de
of a fluorometer by turning off the excitationla concentración de las especies químicas impli-
source, or applying the facilities offered by morecadas en la reacción QL, las medidas de la inten-
sophisticated systems.sidad de emisión pueden emplearse con fines
However, some limitations are to be conside-analíticos. Una ventaja de las técnicas QL es que
red in CL analysis, such as the dependence ofpermiten emplear una instrumentación básica
the CL emission on several environmental fac-bastante sencilla, ya que el sistema óptico no
tors that hence must be controlled, the lack ofrequiere fuente externa de excitación. La QL se
selectivity because a CL reagent is not limited todescribe a menudo como una técnica de “ campo
just one unique analyte, and finally, like otheroscuro”: la ausencia de niveles altos de luz de
mass flow detection approaches, since CL emis-fondo, que sí ocurren en espectrofotometría y
sion is not constant but varies with time (lightfluorimetría, reduce el ruido y permite mejorar
flash composed of a signal increase after reagentlos límites de detección. La instrumentación para
mixing, passing through a maximum, then decli-medidas de QL varía desde sistemas muy sim-
ning to the baseline), and this emission versusples hasta instrumentación más compleja, pudién-
time profile can widely vary in different CLdose usar un fluorímetro simplemente con la fuente
systems, care must be taken so as to detect thede excitación apagada.
signal in flowing streams at strictly defined pe-No obstante deben considerarse algunas limi-
riods.taciones en el análisis por QL, como la depen-
dencia de la emisión quimioluminiscente de va-
2.1. Mechanisms of chemiluminescence reactionsrios factores ambientales que deben ser
controlados, la falta de selectividad, ya que un
In general, a chemiluminescent reaction canreactivo quimioluminiscente no se limita a un
be generated by two basic mechanisms (Figureúnico analito, y finalmente, como ocurre en otros
1). In a direct reaction, two reagents, usually asistemas de detección en flujo, la emisión qui-
substrate and an oxidant in the presence of somemioluminiscente no es constante sino que varía
cofactors, react to form a product or intermedia-con el tiempo (el flash de luz está compuesto de
te, sometime in presence of a catalyst. Thenuna señal que se produce tras la mezcla de los
some fraction of the product or intermediate willreactivos, alcanza un máximo y después cae hasta
be formed in an electronically excited state, whichla línea de base), y este perfil de emisión frente
can subsequently relax to the ground state withal tiempo puede variar ampliamente en diferen-
Ars Pharmaceutica, 42:1; 81-107, 2001GARCÍA-CAMPAÑA AM, BAEYENS WR, ZHANG X, ALÉS F, GÁMIZ L.86
TABLA I. Clasificación de los fenómenos luminiscentes.
TABLA I. Classification of luminescence phenomena.
Producidos por irradiación
,E ; + % ’ %
F +
Fluorescencia: Emisión de vida corta a partir de un estado singlete electrónicamente
excitado
; +
9 0 ; & β
49 , ;
& α
/E 2 ; & γ # G
Producidos por calentamiento
49 0
;
*9
;
#

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