Corrige BAC STL Biotechnologies 2016

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1. Obtention d’une bactérie recombinante
1.1. Construction du plasmide recombinant
Q1. Le gène pBR322 a toutes les caractéristiques pour l’intégration du gène à exprimer : origine de
réplication, des sites de restriction et un gène discriminant les souches l’ayant intégré.
Q2.
ORI Gène amp EcoR I Hind III Gène proinsuline
Plasmide normalement sous forme circulaire
Q3. Le site de restriction BamH I se situe au niveau du gène de résistance à la tétracycline. Si le gène
recombinant est intégré au niveau de ce site, la résistance à la tétracycline ne sera pas acquise ; ce
qui permettra de distinguer les bactéries ayant intégré le gène de la proinsuline de celles ne l’ayant
pas et qui seront, elles, résistantes à la tétracycline.
1.2. Transformation bactérienne et sélection de clones de bactéries recombinantes.
Q4.
Les bactéries de type A ont été transformées par le plasmide entier. Elles possèdent les deux gènes
de résistance à l’ampicilline et à la tétracycline.
Les bactéries de type B ont intégré le plasmide recombinant ; elles sont donc résistantes uniquement
à l’ampicilline puisque le site BamH I a été coupé du fait de l’intégration du gène de la proinsuline
Publié le : lundi 20 juin 2016
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Baccalauréat Technologique Série: Sciences et Technologies de Laboratoire
Session 2016
Épreuve :Biotechnologies
Durée de l’épreuve: 2 heures
Coefficient : 4
PROPOSITION DE CORRIGÉ
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1
1.OďteŶtioŶ d’uŶe ďaĐtérie reĐoŵďiŶaŶte1.1.Construction du plasmide recombinant Q1.Le gğŶe pBRϯϮϮ a toutes les ĐaƌaĐtĠƌistiƋues pouƌ l’iŶtĠgƌatioŶ du gğŶe à edžpƌiŵeƌ: origine de réplication, des sites de restriction et un gènedisĐƌiŵiŶaŶt les souĐhes l’aLJaŶt iŶtĠgƌĠ.Q2. ORI Gène amp EcoR I Hind III Gène proinsuline Plasmide normalement sous forme circulaire Q3.Le site de restriction BamH I se situe au niveau du gène de résistance à la tétracycline. Si le gène recombinant est intégré au niveau de ce site, la résistance à la tétracycline ne sera pas acquise ; ce qui permettra de distinguer les bactéries ayant intégré le gène de la proinsuliŶe de Đelles Ŷe l’aLJaŶt pas et qui seront, elles, résistantes à la tétracycline. 1.2.Transformation bactérienne et sélection de clones de bactéries recombinantes.
Q4.
Les bactéries de type A ont été transformées par le plasmide entier. Elles possèdent les deux gènes de ƌĠsistaŶĐe à l’aŵpiĐilliŶeet à la tétracycline.
Les bactéries de type B ont intégré le plasmide recombinant ; elles sont donc résistantes uniquement à l’aŵpiĐilliŶe puisƋue le site BaŵH I a ĠtĠ ĐoupĠ du fait de l’iŶtĠgƌatioŶ du gğŶe de la pƌoinsuline.
Les bactéries de type C ont intégré seulement le gène de la proinsuline et non le plasmide tandis que les bactéries de typeD Ŷ’oŶt pasété transformées ; toutes deux ne sont donc pas résistantes aux antibiotiques testés.
Q5.Les colonies de type A : n° 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10 et 12.
Q6.Les colonies de bactéries transformées correspondent aux n° 2, 5 et 11.
2.Optimisation de la culture de la souche sélectionnée
Q7.
Q8.
Temps de latence
-1 Vitesse spécifique (min )
Q9.
M1 43 min
M1 0,015
M2 23 min
M2 0,019
Le ŵilieu Mϭ est uŶ ďouilloŶ Ŷutƌitif eŵpiƌiƋue de ďase saŶs gluĐose (souƌĐe d’ĠŶeƌgie plus rapidement disponible) pour lequel la croissance bactérienne est longue à se mettre en place (phase de latence longue) et dont la vitesse est faible.
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2
Le milieu M2 est un milieu plus riche apportant tous les éléments nutritifs nécessaires à une croissance optimale.
Q10.Le ŵilieu MϮ est plus favoƌaďle à uŶe ĐƌoissaŶĐe optiŵale Đaƌ il ĐoŶtieŶt eŶ plus d’uŶe souƌĐe azotée et minérale, une sourĐe d’ĠŶeƌgie (gluĐose etphosphate) accélérant ainsi la croissance bactérienne.
3.PurifiĐatioŶ de l’iŶsuliŶe produite par la ďaĐtérie reĐoŵďiŶaŶte.
Q11.Cettechromatographie est ďasĠe suƌ le pƌiŶĐipe d’iŶĐlusioŶ-exclusion.La chromatographie d’edžĐlusioŶutilise comme phase stationnaire un polymère poreuxdont les pores ont des dimensions choisies en rapport avec la taille des espèces à séparer. Les grosses molécules telles Ƌue l’iŶsuliŶe mature, de diamètre supérieur à celui des pores, passent entre les billes de gel et sont exclues et éluées les premières.
Les petites molécules, telles que le peptide C, sont éluées plus tardivement, car elles pénètrent dans les pores. Leur parcours est donc plus long.Les solutés soŶt doŶĐ élués daŶs l’ordre iŶverse des masses molaires.
Q12.MMinsuline mature≈ 5100 Da et MMpeptide C≈ ϯ100 Da
Q13.Le gel Sephadex G25 est le plus approprié car les molécules de masse moléculaire de 1000 à 5ϬϬϬ Đoŵŵe le peptide C seƌoŶt ƌaleŶties taŶdis Ƌue les autƌes plus gƌosses, Đoŵŵe l’iŶsuliŶe mature seront exclues et éluées plus rapidement
4.Dosage de l’iŶsuliŶe huŵaiŶe purifiée
Q14.
Q15.L’aďsoƌďaŶĐe ŵesuƌĠe est pƌopoƌtioŶŶelle à la ĐoŶĐeŶtƌatioŶ du pƌoduit ĐoloƌĠaprès tƌaŶsfoƌŵatioŶ paƌ la peƌodžLJdase du TMB apƌğs fidžatioŶ de l’iŶsuliŶe.
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Q16.Synthèse
Construction du plasmide recombinant
Transformation et sélection des clones de bactéries recombinantes AMP + TET -
Culture sur milieu M2 à 37°C
Production de proinsuline
Insuline mature
Dosage / ELISA
Par traitement enzymatique
Peptide C
Chƌoŵatogƌaphie d’edžĐlusioŶ suƌ gel SĠphadedž GϮ5
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