tutorial Apotome 2009

Imagerie

Description

Tutorial ApotomeAllumage du système ……………………………...P1Présentation du matériel ………………………..…….P2Commandes du Statif …………………………...…P3Faire une image plein champs en fluorescence eten transmission avec la caméra Noir/Blanc…….....P4Faire une image plein champs en transmissionAvec la caméra couleur …………………………...…P7Faire une image avec le module Apotome………....P10Faire un stack Z …………………………………...……P12Faire un time lapse …......……….……...………P14Multi-positions ………...……………………...…...….P15Faire une mosaïque ………………………...……P17Faire une image en DIC …………………...…………P19Visualisation des données…………...…...…………..P20Sauvegarde des données…………………...………...P21Extinction du système...…………P24Allumage du systèmeAllumez l’alimentation de la lampe de fluorescence.Elle doit toujours être allumée en premier !Allumez la prise multipleAllumez le PC, loggez-vous et lancez le logiciel « Axiovision ».1Présentation du matérielMicroscope inversé Zeiss Axiovert 200 motorisé + système ApoTome ZeissUne caméra Noir/Blanc Axiocam MRm (taille pixel 6.45*6.45 µm) Une caméra couleur Axiocam HRc (taille pixel 6.45*6.45 µm) Platine motorisée en XYLampe à vapeur de mercure à alignement automatique pour la fluorescence.Possibilité de DIC en transmissionFiltres :Filtre n° excitation dichroïque émission fluo49 G 365 FT 395 BP 445/50 DAPI47 BP 436/25 FT 455 BP 480/40 CFP38 BP 470/40 FT 495 BP 525/50 GFP46 BP 500/25 FT 515 BP 535/30 YFP43 BP 550/25 FT 570 BP 605/70 CY350 BP 640/30 FT 660 BP ...

Informations

• Publié par: Pheym
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Extrait

Tutorial Apotome

Allumage du système ……………………………...P1

Présentation du matériel ………………………..…….P2

Commandes du Statif …………………………...…P3

Faire une image plein champs en fluorescence et en transmission avec la caméra Noir/Blanc…….....P4

Faire une image plein champs en transmission Avec la caméra couleur …………………………...…P7

Faire une image avec le module Apotome………....P10

Faire un stack Z …………………………………...……P12

Faire un time lapse …......……….……...………P14

Multi-positions ………...……………………...…...….P15

Faire une mosaïque ………………………...……P17

Faire une image en DIC …………………...…………P19

Visualisation des données…………...…...…………..P20

Sauvegarde des données…………………...………...P21

Extinction du système …………………...…………P24

Allumage du système

Allumez l’alimentation de la lampe de fluorescence. Elle doit toujours être allumée en premier !

Allumez la prise multiple

Allumez le PC, loggez-vous et lancez le logiciel « Axiovision ».

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Présentation du matériel

Microscope inversé Zeiss Axiovert 200 motorisé + système ApoTome Zeiss Une caméra Noir/Blanc Axiocam MRm (taille pixel 6.45*6.45 µm) Une caméra couleur Axiocam HRc (taille pixel 6.45*6.45 µm) Platine motorisée en XY Lampe à vapeur de mercure à alignement automatique pour la fluorescence. Possibilité de DIC en transmission Filtres : Filtre n° excitation dichroïque émission 49 G 365 FT 395 BP 445/50 47 BP 436/25 FT 455 BP 480/40 38 BP 470/40 FT 495 BP 525/50 46 BP 500/25 FT 515 BP 535/30 43 BP 550/25 FT 570 BP 605/70 50 BP 640/30 FT 660 BP 690/50

fluo DAPI CFP GFP YFP CY3 CY5

Objectifs : Objectif Correction NA WD Correction Milieu immersion (mm) lamelle

5x

10x

20x

25x 40x 40x

63x

Plan-Neofluar 0.15 4.8 0.17

Achroplan 0.25 4.4 0.17

A-Plan 0.3 2.4 0 - 2

Plan-Apo 0.8 0.57 0 - 017 N 4 e 0 o x fl  u P a la r n L - D 0.62.90–1.5 Plan-Apo 1.3 0.21 0.17

Plan-Apo 1.4 0.19 0.17

2

Sec

Sec

Sec

Eau, glycérol, oil Sec Oil

Oil

DIC

Non

II

Non

II II III

III

Commandes du Statif

Coté gauche 1 Placer / retirer l’optovar 1,6X 2 Passage oculaire / caméra 3 Sans fonction

Coté droit 1 Monter / descendre la tourelle d’objectifs 2 Allumage / extinction de la lampe à fluorescence 3 Allumage / extinction de la lampe en transmission 4 Changement d’objectif 5 Changement de filtre

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3

1

3

4

5

1

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Faire une image plein champs en fluorescence et en transmission avec la caméra Noir/Blanc

A) Acqusition 1- choisir la caméra N/B (AxioCamMR)

2- Dans “Workarea“ choisir Multidimensional Acquisition

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3- Ouvrir l’onglet “C“ 4- Onglet correspondant au nombre de couleurs à imager. Clic droit pour désactiver/activer une couleur lors de l’acquisition.

5- Cliquer sur les boutons “Duplicate / Remove“ jusqu’à obtenir le nombre d’onglets voulu en fonction du nombre de couleur à imager.

6- Dans “Settings“ choisir le nom et la couleur dans laquelle s’affichera l’image (Blanc pour la transmission) C’est une simple fonction de display qui ne conditionne en rien l’acquisition! 7- Dans “Hardware Settings“ During acquisition : choisir le type d’illumination Le filtre pour la fluo – trans pour la transmission 8- After acquisition : choisir l’action après l’acquisition (Lights off, …).

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Régler le temps d’exposition de 2 manières : 9- Choisir le mode fixe et entrer le temps d’exposition en ms ou 10- Ouvrir a fenêtre de réglage automatique

11- Choisir le % moyen de la dynamique utilisée pour représenter les niveaux de gris des pixels. Cliquer sur “measure“ pour obtenir le temps d’exposition correspondant.

12- Sauver / Charger votre configuration

13- Lancerl’acquisition avec "start"

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Important: Si vous utilisez la lumière transmise et la fluorescence

14- Pour permettre à lampe halogène de s’allumer entièrement avant l’acquisition ouvrir “extented parameters“ 15- Choisir “user interaction“ et ajouter 2 sec avant acquisition

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B) Réglage de la caméra Noir/Blanc

Ces réglages influent sur le mode “Live” mais pas le mode “measure” du Multidimensional Acquisition

1 Cliquez sur MR pour régler la caméra N/B 1

2- Rend le fond de l’image homogène (indispensable en mode mosaïque) À faire à chaque changement d’objectif et de caméra.

En fluorescence faire la mise au point sur l’échantillon puis faire le shadding sur une lame Fluorescente homogène de même couleur.

3- Établir un noir de référence pour la fluorescence

Placer la pièce dans le noir avant de faire la référence

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Faire une image plein champs en transmission Avec la caméra couleur

A) Acqusition 1- choisir la caméra couleur (AxioCamHR)

2- Dans Workarea“ choisir “ Multidimensional Acquisition

3- Ouvrir l’onglet “C“

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4- Dans “Settings“ choisir le nom et la couleur dans laquelle s’affichera l’image (Blanc pour la transmission) C’est une simple fonction de display qui ne conditionne en rien l’acquisition!

5 et 6 laissez les cases vides et allumez / éteignez la lampe manuellement.

7- Important : pour des acquisition plus rapide mettre le temps d’attente avant l’acquisition à 0 sec ouvrir “extented parameters“ 8- Choisir “user interaction“ et mettre 0 sec avant l’acquisition

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Régler le temps d’exposition de 2 manières :

9- Choisir le mode fixe et entrer le temps d’exposition en ms ou 10- Ouvrir a fenêtre de réglage automatique

11- Choisir le % moyen de la dynamique utilisée pour représenter les niveaux de gris des pixels. Cliquer sur “measure“ pour obtenir le temps d’exposition correspondant.

12- Sauvez / Chargez votre configuration

13- Lancerl’acquisition avec "start"

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B) Réglage de la caméra couleur

Ces réglages influent sur le mode “Live” mais pas le mode “measure” du Multidimensional Acquisition

1 Cliquez sur HR pour régler la caméra couleur

2- Résolution de la caméra (par défaut HR 1388 x 1040 standard color)

1

3- Rend le fond de l’image homogène (indispensable en mode mosaïque) À faire à chaque changement d’objectif et de caméra.

En transmission faire la mise au point sur l’échantillon puis faire le shadding en dehors de la lame.

4- Définir la balance des blancs

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La teinte de la lumière blanche dépend de l’intensité de la 3 lampe halogène. Il faut donc définir un blanc de référence à chaque changement d’intensité. La balance des blancs se règle également dans Live

Attention! : Il faut d’abord lancer “measure” dans 4 Multidimensional Acquisition puis régler la balalnce des blancs

5- Règle automatiquement le blanc de référence sur les couleurs de l’image. À faire sur un fond blanc homogène sans l’objet à imager.

6- Défini la couleur du pixel choisi comme blanc de référence 6 5 7- Changer manuellement la dynamique de couleur de l’image

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Faire une image avec le module Apotome

L’utilisation du module Apotome n’est possible qu’avec les objectifs 63X, 40X et 25X et sans optovar (optovar à 1).

Insérer le module Apotome

A) Configurer l’Apotome

1- En mode live choisir Grid Visible pour avoir les images en temps réel 2- En mode Acquisition choisir Optical Sectioning pour obtenir les images confocal 3- Une seule grille disponible (VH)

4- Filter : A utiliser si des lignes reste présentes sur les images acquises. N’hésiter pas à demandez conseil aux ingénieurs de la plate-forme.

5- Averaging : permet de moyenner les images pour diminuer le bruit. Il est souvent nécessaire d’appliquer un average de 2 minimum. Attention tout de même au temps d’acquisition.

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6- Status : Calibrated (fond vert): tout va bien Not calibrated (fond rouge) : l’apotome n’est pas calibré pour le filtre ou l’objectif en place. Demandez à un ingénieur de la plate-forme Not selected (tout est grisé) : l’apotome n’est pas poussé.

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