présentée et soutenue publiquement le 2 juillet 2004
par
Sophie VIROT
TITRE :
Les petites protéines de stress et leur rôle dans la mort cellulaire. Etude de leur fonction chaperon à travers l’exemple de la mutation R120G de l’ αB-cristalline
Directeur de thèse : Pr. André-Patrick ARRIGO
Jury : M. Patrick ARRIGO Examinateur M. William CURRIE Examinateur, Président M. Michel MORANGE Rapporteur Mme Claire RODRIGUEZ-LAFRASSE Exam M. Patrick VICART
Chaque progrès donne un nouvel espoir, suspendu à la solution d’une nouvelle difficulté.
Claude Lévi-Strauss
Je voudrais remercier ma famille, tout particulièrement mes parents qui m’ont toujours soutenue dans mes choix d’orientation, et qui m’ont donné les moyens de parvenir jusque ici. Merci à Ronique pour sa complicité, à Fred pour nos discussions et merci à Stan pour sa compréhension.
Je remercie Patrick Arrigo pour la liberté d’action et la confiance qu’il m’a accordée pendant ces 5 années dernières années ainsi que pour ses conseils en fin de thèse.
Je remercie Michel Morange et Patrick Vicart qui ont accepté être les rapporteurs de ma thèse et les autres membres du jury William Currie, ...
N° d’ordre : 95 - 2004 Année 2004
THESE
présentée
devant l’UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON 1
pour l’obtention
du DIPLOME DE DOCTORAT
(arrêté du 25 avril 2002)
présentée et soutenue publiquement le 2 juillet 2004
par
Sophie VIROT
TITRE :
Les petites protéines de stress et leur rôle dans la mort cellulaire.
Etude de leur fonction chaperon à travers l’exemple de la mutation
R120G de l’ αB-cristalline
Directeur de thèse : Pr. André-Patrick ARRIGO
Jury : M. Patrick ARRIGO Examinateur
M. William CURRIE Examinateur, Président
M. Michel MORANGE Rapporteur
Mme Claire RODRIGUEZ-LAFRASSE Exam
M. Patrick VICART
Chaque progrès donne un nouvel espoir, suspendu à la solution d’une nouvelle difficulté.
Claude Lévi-Strauss
Je voudrais remercier ma famille, tout
particulièrement mes parents qui m’ont toujours
soutenue dans mes choix d’orientation, et qui
m’ont donné les moyens de parvenir jusque ici.
Merci à Ronique pour sa complicité, à Fred pour
nos discussions et merci à Stan pour sa
compréhension.
Je remercie Patrick Arrigo pour la liberté d’action et la confiance qu’il m’a accordée pendant ces
5 années dernières années ainsi que pour ses conseils en fin de thèse.
Je remercie Michel Morange et Patrick Vicart qui ont accepté être les rapporteurs de ma thèse et
les autres membres du jury William Currie, Claire Rodriguez-Lafrasse pour avoir accepté de juger mon
travail.
Je remercie tout particulièrement ceux de l’unité ou de l’extérieur avec qui j’ai collaboré ou qui
m’ont aidée tout au long de ma thèse par leurs conseils, leur écoute, leur soutien ou leur motivation :
l’équipe « Stress » au complet, Stéphanie G, Jocelyne, Madeleine, Michèle W, Delphine, Cécile J...
Merci à Domi pour toutes nos discussions, pour les « 2D » et pour avoir pris soins de « mes »
clones en fin de thèse. Merci à Carole et Chantal, Domi, Maryline et Flo pour leur bonne humeur.
Merci à Nicole pour toutes nos discussions et son soutien.
Je remercie l’équipe « Melhen » qui m’a régulièrement permis de « squatter » ses incubateurs
cellules et qui m’a généreusement fait don de sa pompe péristaltique (j’ai gagné au moins deux ans de
manips !) Merci aussi à Fred, Filipe et Sylvain pour leur précieux PC quand les mac m’ont laissée
tomber.
Je remercie également la ligue des pays nordiques qui m’a donné l’opportunité de présenter
oralement mes travaux devant des collègues internationaux et m’a permis d’aller travailler une semaine à
Åbo / Turku dans le laboratoire de John Erickson. J’en profite pour remercier Thomas Söderström qui
m’a guidée tout au long de cette semaine finlandaise.
J’adresse un clin d’œil aux « petits » nouveaux : Maryline, Marlène, Jérémy, Gaëtan, Greg....
et bien sur à ma promo : Véro, Seb, Orianne, Mireille, Delphine, Cécile pour tous ces moments
communs de rigolade ou de faux désespoir que nous avons partagés depuis le DEA.
Un grand merci à « ma logeuse » Delphine, qui m’a gentiment hébergée lors de mes retours sur
Lyon en fin de thèse. Tu es la prochaine, bonne chance....
Merci aussi Vincent et Sabine, Fred, Delphine, Cécile et Manu, Cédric
Ce travail n’aurait pu se faire sans le soutien du ministère de la recherche et de la Ligue
Nationale Contre le Cancer qui m’ont financée pendant ces quatre années de thèse ni sans l’Association
de Recherche sur le Cancer et l’Association Française de Myopathie qui ont financé les projets sur
lesquelles j’ai travaillé. Merci à eux et aux généreux donateurs.
Rôle des petites protéines de stress dans la mort cellulaire. Etude de leur fonction
chaperon à travers l’exemple de la mutation R120G de l’αB-cristalline
Plusieurs mécanismes biochimiques nécessitant des modifications de l'état
d'oligomérisation ou de phosphorylation d’Hsp27 ont été proposés pour expliquer son rôle
protecteur lors de stress thermique ou oxydant. Nous avons étudié les modifications
biochimiques d’Hsp27 lors de l’activation de la caspase-3 et du relachage du cytochrome
mitochondrial au cours de l’apoptose induite par différents stimuli. Une corrélation entre le
statut biochimique et l’inhibition de la caspase-3 a été établie de même qu’une interaction
entre Hsp27, Hsp70 et Apaf-1.
L’αB-cristalline exerce également un rôle protecteur lors d’un stress oxydant,
thermique ou apoptotique. La mutation R120G de cette protéine est responsable d’une
myopathie liée à la desmine et provoquerait in vitro la perte de la fonction de type chaperon.
J’ai réalisé et caractérisé des lignées cellulaires HeLa exprimant constitutivement l’αB-
cristalline sauvage ou mutée et comparé leur rôle protecteur au cours de stress thermique,
oxydatif et apoptotique. Les modifications des propriétés biochimiques de la protéine ont été
confirmées dans le modèle HeLa et approfondies. La mutation ne semble pas modifier le
réseau de filaments intermédiaires, mais affecte le cytosquelette d’actine, la mobilité et
l’adhérence cellulaire. La résistance à l’apoptose n’est pas affectée, en revanche, la mutation
ne protège plus des tress thermique et oxydatif. Le taux d’ions intracellulaires impliqué dans
la génération des radicaux libres oxygénés est modifié par l’expression de l’αB-cristalline
sauvage et mutée.
1
Small heat shock protein in cell death. Study of their chaperon-like function
through the R120G αB-crystallin mutation
The Small heat shock proteins Hsp27 and αB-crystallin are synthetized after many
stresses.
Several biochemical mechanisms including the oligomeric and phosphorylated status
have been suggested to explain the protective function of Hsp27. We have analyzed the
biochemical modification of Hsp27 during caspase-3 activation and mitochondrial
cytochrome c release induced by several apoptotic inducers. Caspase-3 activation has been
correlated with the specific biochemical status of Hsp27. An interaction between Hsp27,
Hsp70 and Apaf-1 has been observed.
αB-crystallin also protects against thermal, oxidative and apoptotic stresses. The
R120G mutation of this protein is implicated in a desmin related myopathy and seems to alter
its chaperone-like function in vitro. I have produced and characterized HeLa cell lines stably
expressing wild type or mutant αB-crystallin and analyzed their protective activity during
oxidative, thermal and apoptotic stresses. The mutation appears to have no effect on the
intermediate filament network but alters the actin cytoskeleton, the cellular mobility and
adherence. The resistance against apoptosis but not thermal or oxidative stress is not affected
by the mutation. The intracellular level of iron, known to induce the reactive oxygen species,
is modified when wild type or mutated αB-cristalline are express in HeLa cells.
2
Liste des abréviations
aa : acide aminé
ADN:Acide DésoxyriboNucléique
ADP : Adénosine Di Phosphate
AIF : Apoptosis Inducing Factor
AK : Adénylate Kinase
AMPc : Adénosine Mono Phosphate cyclique
ANT : Adenosine Nucleotide Transpoter
Apaf : Apoptosis protein activating factor
ARNm : Acide RiboNucléique messager
ATP : Adénosine Tri Phosphate
BH : Bcl-2 Homology
BSO : Buthionine SulfOximine
CARD : Caspase Recruitment Domain
CMH : Complexe Majeur d'Histocompatibilité
cryo EM : cryo Electronic Mycroscopy
DD : Death Domain
DED : Death Effector Domain
DISC : Death-Inducing Signaling Complex
DNP : dinitrophenyl
DRM : Desmine Related Myopathy
G : glycine
G6PDH : Glucose 6 Phosphate Deshydrogenase
GFAP : Glial Fibrillary Acidic Protein
GPx : Glutathion Peroxydase
GR:GlutathionRéductase
GSH : Glutathion (forme réduite)
GSSG : Glutathion disuldide (forme oxydée)
H O : Péroxyde d’hydrogène 2 2
HSE : Heat Shock Element
3
HSF : Heat Shock Factor
Hsp : Heat shock protein
IAP : Inhibitor of Apoptosis Protein
IL-1 : Interleukine 1
IRE : Iron Regulatory Element
IRP : Iron Regulatory Protein
kDa : kilo Dalton
MAP kinase : Mitogen-Activated Protein kinase
MAPKAP : Mitogen-Activated Protein Kinase-Activated kinase
MK : MAPKAP Kinase
NF B : Necrosis Factor kappa B K
LPS : Lipo Poly Sacharide
PBS : Phosphate Buffer Salt
pH : potentiel hydrogène
pI:potentielIsoélectrique
PKA : Protein Kinase A
PKC : Protein Kinase C
PTP : Permeability Transition Pore
R : arginine
RLO : Radicaux Libres Oxygénés
S:sérine
SAPK : Stress Activated Protein Kinase
sHsp : small Heat shock protein
SOD : Super Oxyde Dismutase
SVF : Sérum de Veau Foetal
TNF : Tumor Necrosis Factor
UV : Ultra Violet
VDAC : Voltage Dependant Anion Channel
WT : Wild Type
z-VAD-fmk :carbobenzoxy-VAD-fluoromethyl ketone
4
1 STRESS ET MORT CELLULAIRE ..................................................................... 13
1.1 Le choc thermique ................................................................................................................................ 13
1.1.1 Effets de l’hyperthermie sur les composants cellulaires .................................................................... 13
1.1.2 Mécanisme de protection ................................................................................................................... 14
1.2 Le stress oxydant et les radicaux libres oxygénés .............................................................................. 15
1.2.1 La genèse des RLO dans les cellules ................................................................................................. 17
1.2.2 Actions des radicaux libres oxygénés sur les composants cellulaires. ............................................... 18
1.2.3 Mécanismes de lutte contre les RLO ................................................................................................. 20
1.2.3.1 La prévention à plein temps.....................................................................................