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Evolution du pH pendant la fermentation alcoolique de moÛts de raisins : modlisation et interprtation mtabolique
Gilles TRYSTAM
Christian LARROCHE
M.
Membre
Membre
Codirecteur de thÈse
N dordre :
THESE
Soutenue le
10 Mars 2008 À 10 heures
Prsident Directeur de thÈse
devant le jury compos de :
Rapporteur
Membre
prsente pour obtenir
M.
M.
Jean-Michel SALMON Pierre STREHAIANO
Spcialit : Gnie des Procds et Environnement
Titre de la thÈse
Cdric BRANDAM
LE TITRE DE DOCTEUR DE LINSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE École doctorale : Mcanique Energtique Gnie Civil et Procds
M. M.
Jacques BLOUIN
Par M. Huberson AKIN
M.M Xuân Mi MEYER
M.
I.
II.
Introduction................................................................................................. 1
Eude bibliographique ................................................................................. 4
II.1. Acidit et pH des moÛts et des vins ........................................................................ 4
II.2. Les principaux constituants des moÛts et des vins .................................................. 8
II.2.1. Les sucres du moÛt et leur utilisation........................................................... 8
II.2.2. Les acides organiques................................................................................... 9
II.2.2.1.
II.2.2.2.
Acides organiques des moÛts .................................................... 10
Acides organiques issus de la fermentation alcoolique. ............ 11
II.2.3. Alcools : thanol......................................................................................... 12
II.2.4. Polyalcools : glycrol ................................................................................. 13
II.3. Les substances azotes du moÛt et leur utilisation par la levure. .......................... 13
II.3.1. Les diffrentes formes dazote ................................................................... 13
II.3.1.1.
II.3.1.2.
II.3.1.3.
Les ions ammonium................................................................... 14
Les acides amins ...................................................................... 15
Les peptides et polypeptides (protines) ................................... 16
II.3.2. Mtabolisme des acides amins ................................................................. 17
II.3.3. Evolution des constituants azots du moÛt au vin...................................... 18
II.3.4. La matiÈre minrale.................................................................................... 18
II.3.4.1.
II.3.4.2.
Les cations ................................................................................. 19
Les anions .................................................................................. 19
II.4. Les transports membranaires................................................................................. 20
II.4.1. Les protines membranaires de transports ................................................. 21
ii. Transport actif secondaire. ............................................................. 25
III.3.2. Le moÛt de raisins ...................................................................................... 36
III.2. Les milieux dactivation ........................................................................................ 34
II.4.2.2.
ii. La diffusion facilite. ..................................................................... 23
II.4.1.1. Les canaux ................................................................................. 21
i. Transport actif primaire.................................................................. 24
II.4.3. Le transport des sucres ............................................................................... 26
II.4.5. Le transport des acides amins................................................................... 29
II.4.5.1.
II.4.6. Transport des peptides et des polypeptides ................................................ 33
Les transports actifs. .................................................................. 24
II.4.4. Le transport des ions ammonium ............................................................... 27
II.4.5.2. Les systÈmes de transporteurs spcifiques ................................ 30
III.1. La souche de levure ............................................................................................... 34
II.4.2.1. Les diffusions. ........................................................................... 23
i. La diffusion simple......................................................................... 23
III.4. Le matriel de fermentation .................................................................................. 37
III.3.1. Les milieux synthtiques ............................................................................ 35
II.4.1.2. Les pompes et les transporteurs ................................................. 22
II.4.2. Les diffrents types de transports ............................................................... 22
III.4.1. Les fermenteurs du laboratoire SPO-INRA de Montpellier....................... 37
III.34MatÉriels et mÉthodes...............................................................................
III.3. Les milieux de fermentation.................................................................................. 35
Le transporteur GAP.................................................................. 29
+ i. Dosage des ions ammonium (NH4 ).............................................. 43
III.5. Techniques analytiques ......................................................................................... 39
IV.1.1. Le sucre ...................................................................................................... 49
IV.ModÈle de calcul du pH............................................................................ 48
IV.1. pH et composs des moÛts de raisins .................................................................... 48
III.5.4. Dosage de lazote ....................................................................................... 42
ii. Dosages enzymatiques au Mascot Plus .......................................... 41
III.5.2. Dosage des sucres totaux par la mthode du DNS ..................................... 40
ii. Dosage de lazote alpha amin....................................................... 43
iii. Dosage des acides amins .............................................................. 43
IV.1.4.2. Les acides amins des moÛts de raisins ................................... 53
IV.1.2. Lalcool ...................................................................................................... 49
IV.1.5. Conclusion.................................................................................................. 57
+ IV.1.4.1. Les ions ammonium (NH4)..................................................... 51
III.5.5. Dosage du CO2dgag............................................................................... 46
- Dosage enzymatique acide malique par kit Mono ractif.................. 41
III.5.3. Dosage des acides organiques, du glycrol et de lalcool .......................... 41
i. Dosage À lHPLC ........................................................................... 41
IV.1.4. Les sources azotes .................................................................................... 51
IV.1.3. Les composs acides : acides organiques................................................... 50
III.5.1. Concentration cellulaire ............................................................................. 39
III.4.2. Les fermenteurs du laboratoire de gnie chimique de Toulouse................ 38
- Dosage colorimtrique acide tartrique par kit mono ractif .............. 42
IV.2. Equations du modÈle du calcul du pH................................................................... 57
IV.2.1. Notion de potentiel dhydrogÈne (pH) ....................................................... 57
IV.2.2. Loi de conservation de la matiÈre .............................................................. 59
IV.2.2.1.
Lammoniac ............................................................................. 60
IV.2.2.2. Les acides organiques .............................................................. 61
IV.2.2.3. les acides amins ...................................................................... 61
IV.2.3. Equations constitutives............................................................................... 62
IV.2.3.1. Masse volumique ..................................................................... 62
IV.2.3.2. Notion de force ionique............................................................ 63
IV.2.3.3.
Evaluation du coefficient dactivit ......................................... 63
i. Loi de Debye-Hückel ..................................................................... 64
ii. Convention de MacInnes................................................................ 65
IV.2.3.4. Constante dilectrique .............................................................. 66
IV.2.3.5. Constantes de dissociation des acides organiques ................... 67
IV.2.4. Equations de contraintes............................................................................. 69
IV.2.4.1. Equations dquilibres chimiques ............................................ 69
i. Acides organiques .......................................................................... 69
ii. Les acides amins ........................................................................... 70
iii. Dissociation de leau ...................................................................... 71
IV.2.4.2. Electroneutralit dune solution ............................................... 71
IV.3. Formulation et rsolution du modÈle .................................................................... 72
IV.3.1. Formulation du modÈle .............................................................................. 72
IV.3.2. Mthode de rsolution et diagramme du modÈle ....................................... 75
V.
IV.4. Validation du modÈle ............................................................................................ 76
IV.4.1. Simulation du pH de milieux synthtiques composs................................ 76
IV.4.2. Ajout de composs À diffrentes concentrations sur moÛt rel .................. 78
IV.4.3. Ethanol : Comparaison pH mesur et simul ............................................. 78
IV.4.4. Acides organiques : Comparaison pH mesur et simul............................ 79
IV.5. Conclusion............................................................................................................. 80
Application du modÈle de calcul du pH.................................................. 81
+ V.1. Fermentation sur moÛt synthtique avec NH4 comme seule source azote........ 81
V.1.1. Rsultats et discussion................................................................................ 82
V.1.2. Comparaison pH exprimental et simul ................................................... 83
V.2. Fermentation sur moÛt synthtique avec des acides amins comme seule
source azote ......................................................................................................... 85
V.2.1. Rsultats de la fermentation et discussions ................................................ 85
V.2.2. HypothÈses sur limpact de lassimilation des acides amins sur lvolution
du pH. ......................................................................................................... 91
V.2.3. Simulation de la cintique du pH exprimental ......................................... 94
+ V.3. Fermentation sur moÛt synthtique contenant du NH4 et des acides
amins : milieu MS300 ......................................................................................... 95
V.3.1. Rsultats de la fermentation et discussions ................................................ 96
V.3.2. Analyse comparative des cintiques sur les trois milieux synthtiques de
fermentation ............................................................................................... 97
V.3.3. Evaluation de la proportion des acides amins en fonction de leur charge.
.................................................................................................................... 99
References bibliographiques ......................................................................... 110
.................................................................................................................. 103
V.4.3. Simulation de la cintique du pH exprimental ....................................... 104
V.4. Cas de la fermentation alcoolique sur moÛt rel ................................................. 100
V.4.1. Rsultats de la fermentation et discussions .............................................. 101
V.3.4. Simulation de la cintique du pH exprimental ......................................... 99
V.4.2. Evaluation de la proportion des acides amins en fonction de leur charge
VI.107Conclusions et perspectives ...................................................................
Annexe ............................................................................................................. 121
LISTE DE FIGURES Figure II.1. Flux diffusif selon la loi de Fick (http://www.sciencebio.com/FacBio/BioCell/Membrane/FBMF5.htm) 23 + +. Figure II.2. Schma dun transports actif primaire : cas de la pompe Na -K On a une sortie + + de 3 Na pour une entre de 2 K . 25 Figure II.3. Schma dun transports actif secondaire : antiport et symport actifs 25 Figure II.4. Simulation du taux spcifique de production de protons (qH+, mmol h-1 par g de biomasse). Source dazote : ion ammonium (Castrillo J.I et coll., 1995). 28 Figure II. 5.Schma de fonctionnement de luniport lectrophortique accumulatif responsable de lentre de lion ammonium chez Saccharomyces cerevisiae (Salmon J.M., 1998). 28 Figure II.6.Schma de fonctionnement du symport lectrophortique accumulatif responsable de lentre dacide amin chez Saccharomyces cerevisiae (Salmon J.M., 1998).  32 Figure III.1.38Les diffrents types de fermenteurs utiliss dans cette tude. Figure III.247. Correction du CO2 dgag par extrapolation linaire Figure. IV.1.Cintique classique du pH lors dune fermentation alcoolique sur du moÛt de raisins blancs par Saccharomyces cerevisiae (pH initial : 3,32 ; Temprature : 20C) 48 Figure IV.2.Evolution du pH en fonction du degr alcoolique du moÛt de raisins blancs. Test ralis À 20C. 50 Figure IV.3.Test dajout dacide succinique dans un moÛt de raisins blancs À diffrents degrs dalcool ralis À 20C. (pH À 0,05). 51 + Figure. IV.4.Courbe de titrage acido-basique de 1L de solution À 1M de NH4: volution des proportions des formes acido-basiques. 52 Figure. IV.5.Evolution des proportions des formes acido-basiques des acides alpha amins. ! ## Figure IV.6.Digramme de calcul du pH de moÛts synthtiques et naturels 76 Figure.V.1. Evolution de lthanol, de la biomasse, du dioxyde de carbone, du pH et de lammonium au cours de la fermentation alcoolique sur milieu MS_NH4. 82 Figure.V.2. Evolution de lacide malique, de lacide citrique, de lacide succinique, de lacide actique et du pH au cours de la fermentation alcoolique sur milieu MS_NH4. 82 Figure. V.3. Comparaison des volutions de pH exprimental et simul. Fermentation sur milieu MS_NH4. 84 Figure.V.4.Evolution de lthanol, de la biomasse, du dioxyde de carbone, du pH et de lammonium au cours de la fermentation alcoolique sur milieu MS_AA. 86 Figure.V.5. Evolution de lacide malique, de lacide citrique, de lacide succinique, de lacide actique et du pH au cours de la fermentation alcoolique sur milieu MS_AA. 86 Figure.V.6.a.Taux davancement de la consommation des acides amins mono acide et mono amine 88 Figure.V.6.b.Taux davancement de la consommation des acides amins di acides et leur amides 88 Figure.V.6.c.Taux davancement de la consommation des acides amins di amins et de la proline 89
Figure.V.6.d.Taux davancement de la consommation des acides amins aromatiques et soufrs 89 Figure. V.7. Comparaison des volutions de pH exprimental et simul. Fermentation sur milieu MS_AA : cas de lhypothÈse 2. 92 Figure. V.8. Comparaison des volutions de pH exprimental et simul. Fermentation sur milieu MS_AA : cas de lhypothÈse 3. 95 Figure.V.9. Evolution de lthanol, de la biomasse, du dioxyde de carbone, de lammonium, de lazote alpha amin et du pH au cours de la fermentation alcoolique sur milieu MS_300.  96 Figure.V.10. Evolution de lacide malique, de lacide citrique, de lacide lactique, de lacide succinique, de lacide actique et du pH au cours de la fermentation alcoolique sur milieu MS_300. 96 Figure V.11.Evolution du pH au cours dune fermentation alcoolique sur diffrentes sources azotes. () acides amins ; () ions ammonium ; (X) acides amins + ions ammonium. DaprÈs M.J. Torija et coll. (2003) Manque 1 courbe. 98 Figure. V.12. Comparaison des volutions de pH exprimental et simul. Fermentation sur milieu MS300. 100 Figure.V.13. Evolution des sucres totaux, de lthanol, de la biomasse, du dioxyde de carbone, de lammonium, de lazote alpha amin et du pH au cours de la fermentation alcoolique sur milieu MR. 101 Figure.V.14. Evolution du glycrol, de lacide malique, de lacide citrique, de lacide succinique, de lacide actique et du pH au cours de la fermentation alcoolique sur milieu MR. 101 Figure. V.15. Comparaison des cintiques du pH exprimental et simul. Fermentation sur milieu MR. 105
LISTE DE TABLEAUX Tableau II.1. Produits secondaires forms parS. cerevisiaeÀ diffrents pH du moÛt. 6 Tableau II.2. Fractions azotes de moÛts de raisins. 14 Tableau II.3. Composition moyenne en acides amins de moÛts Australiens (daprÈs Gockowiak et Henschke) 15 Tableau II.4.16les 20 Acides amins essentiels Tableau II.5.Rcapitulatif des systÈmes de transport des acides amins chez saccharomyces cerevisiae. Le nombre de protons changs par types de transporteurs est aussi indiqu. 31 Tableau III.1.34Composition du milieu Levain Tableau III.2.34Composition du milieu de pr-levain Tableau III.3.35Composition du milieu Levain Tableau III.4.Composition du milieu synthtique de base. 36 Tableau III.5.Composition en matiÈre azote des milieux synthtiques 36 Tableau III.637. Composition du moÛt de raisins blancs fournie par SOPAGLY Tableau III.7.Tampons de citrate de lithium(www.biochrom.uk) utiliss dans le dosage des acides amins au Biochrom 30 46 Tableau IV.1.Evolution du pH en fonction de la concentration en ions ammonium du moÛt de raisins blancs. Test ralis À 20C. (pH prcision : 0,05). 53 Tableau IV.2.Liste des 20 acides amins reprsents dans le code gntique avec leur pK dans une solution aqueuse. (Jukes T.H. et Schmidt L.A. (1934)) 56 Tableau IV.3.ParamÈtres de calcul de coefficients de dissociation dacides organiques. T=20C in water-ethanol solution, ** T=25C in water (Usseglio-Tomasset and Bosia, 1978)  69 Tableau IV.4.72Variables intervenant dans le modÈle de calcul du pH. Tableau IV.5: systÈme dquations À rsoudre. Les fonctions mi(mH+,I) sont consignes dans le tableau IV.4. 75 Tableau IV.6.Comparaison pH exprimentaux et calculs de diffrents milieux synthtiques  77 Tableau IV.7.Comparaison du pH exprimental et simul par le modÈle en fonction de la concentration en thanol 78 Tableau IV.8.Comparaison du pH exprimental et simul par le modÈle en fonction de la concentration en acide succinique À 0 et À 12% dthanol. 79 Tableau V.1.Quantit dazote assimilable apporte par chacun des acides amins dans le milieu MS_AA. 90 Tableau V.2.Proportions des acides amins suivant leur charge dans le milieu MS_AA initial au pH de 3,23 93 Tableau V.3.94Concentration dacides amins en fonctions de leur charge. Tableau V.4. Proportions dacides amins en fonctions de leur charge dans le milieu MS300 ; pH initial gal À 3,42. 99 TableauV.5.Comparaison des proportions dacides amins selon le milieu. 103 Tableau V.6. Proportions dacides amins en fonctions de leur charge dans le milieu MR; pH initial gale À 3,32. 104