Evolution du pH pendant la fermentation alcoolique de moûts de raisins : modélisation et interprétation métabolique

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2008

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Huberson Akin

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01 mars 2008

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Poids de l'ouvrage

1 Mo

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8 N° d'ordre : THESE présentée pour obtenir LE TITRE DE DOCTEUR DE L'INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE École doctorale : Mécanique Energétique Génie Civil et Procédés Spécialité : Génie des Procédés et Environnement Par M. Huberson AKIN Titre de la thèse Evolution du pH pendant la fermentation alcoolique de moûts de raisins : modélisation et interprétation métabolique Soutenue le 10 Mars 2008 à 10 heures devant le jury composé de : M. Jean-Michel SALMON Président M. Pierre STREHAIANO Directeur de thèse M.M Xuân Mi MEYER Codirecteur de thèse M. Christian LARROCHE Rapporteur M. Cédric BRANDAM Membre M. Gilles TRYSTAM Membre M. Jacques BLOUIN Membre génie des procédés acide aminé moût protéines membranaires de transports transports membranaires moûts de raisins transports actifs evolution des constituants azotés du moût au vin dosage de l'azote alpha aminé

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Evolution du pH pendant la fermentation alcoolique de moÛts de raisins : modlisation et interprtation mtabolique

Gilles TRYSTAM

Christian LARROCHE

Membre

Codirecteur de thÈse

N dordre :

THESE

Soutenue le

10 Mars 2008 À 10 heures

Prsident Directeur de thÈse

devant le jury compos de :

Rapporteur

Membre

prsente pour obtenir

Jean-Michel SALMON Pierre STREHAIANO

Spcialit : Gnie des Procds et Environnement

Titre de la thÈse

Cdric BRANDAM

LE TITRE DE DOCTEUR DE LINSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE École doctorale : Mcanique Energtique Gnie Civil et Procds

M. M.

Jacques BLOUIN

Par M. Huberson AKIN

M.M Xuân Mi MEYER

II.

Introduction................................................................................................. 1

Eude bibliographique ................................................................................. 4

II.1. Acidit et pH des moÛts et des vins ........................................................................ 4

II.2. Les principaux constituants des moÛts et des vins .................................................. 8

II.2.1. Les sucres du moÛt et leur utilisation........................................................... 8

II.2.2. Les acides organiques................................................................................... 9

II.2.2.1.

II.2.2.2.

Acides organiques des moÛts .................................................... 10

Acides organiques issus de la fermentation alcoolique. ............ 11

II.2.3. Alcools : thanol......................................................................................... 12

II.2.4. Polyalcools : glycrol ................................................................................. 13

II.3. Les substances azotes du moÛt et leur utilisation par la levure. .......................... 13

II.3.1. Les diffrentes formes dazote ................................................................... 13

II.3.1.1.

II.3.1.2.

II.3.1.3.

Les ions ammonium................................................................... 14

Les acides amins ...................................................................... 15

Les peptides et polypeptides (protines) ................................... 16

II.3.2. Mtabolisme des acides amins ................................................................. 17

II.3.3. Evolution des constituants azots du moÛt au vin...................................... 18

II.3.4. La matiÈre minrale.................................................................................... 18

II.3.4.1.

II.3.4.2.

Les cations ................................................................................. 19

Les anions .................................................................................. 19

II.4. Les transports membranaires................................................................................. 20

II.4.1. Les protines membranaires de transports ................................................. 21

ii. Transport actif secondaire. ............................................................. 25

III.3.2. Le moÛt de raisins ...................................................................................... 36

III.2. Les milieux dactivation ........................................................................................ 34

II.4.2.2.

ii. La diffusion facilite. ..................................................................... 23

II.4.1.1. Les canaux ................................................................................. 21

i. Transport actif primaire.................................................................. 24

II.4.3. Le transport des sucres ............................................................................... 26

II.4.5. Le transport des acides amins................................................................... 29

II.4.5.1.

II.4.6. Transport des peptides et des polypeptides ................................................ 33

Les transports actifs. .................................................................. 24

II.4.4. Le transport des ions ammonium ............................................................... 27

II.4.5.2. Les systÈmes de transporteurs spcifiques ................................ 30

III.1. La souche de levure ............................................................................................... 34

II.4.2.1. Les diffusions. ........................................................................... 23

i. La diffusion simple......................................................................... 23

III.4. Le matriel de fermentation .................................................................................. 37

III.3.1. Les milieux synthtiques ............................................................................ 35

II.4.1.2. Les pompes et les transporteurs ................................................. 22

II.4.2. Les diffrents types de transports ............................................................... 22

III.4.1. Les fermenteurs du laboratoire SPO-INRA de Montpellier....................... 37

III.34MatÉriels et mÉthodes...............................................................................

III.3. Les milieux de fermentation.................................................................................. 35

Le transporteur GAP.................................................................. 29

+ i. Dosage des ions ammonium (NH4 ).............................................. 43

III.5. Techniques analytiques ......................................................................................... 39

IV.1.1. Le sucre ...................................................................................................... 49

IV.ModÈle de calcul du pH............................................................................ 48

IV.1. pH et composs des moÛts de raisins .................................................................... 48

III.5.4. Dosage de lazote ....................................................................................... 42

ii. Dosages enzymatiques au Mascot Plus .......................................... 41

III.5.2. Dosage des sucres totaux par la mthode du DNS ..................................... 40

ii. Dosage de lazote alpha amin....................................................... 43

iii. Dosage des acides amins .............................................................. 43

IV.1.4.2. Les acides amins des moÛts de raisins ................................... 53

IV.1.2. Lalcool ...................................................................................................... 49

IV.1.5. Conclusion.................................................................................................. 57

+ IV.1.4.1. Les ions ammonium (NH4)..................................................... 51

III.5.5. Dosage du CO2dgag............................................................................... 46

- Dosage enzymatique acide malique par kit Mono ractif.................. 41

III.5.3. Dosage des acides organiques, du glycrol et de lalcool .......................... 41

i. Dosage À lHPLC ........................................................................... 41

IV.1.4. Les sources azotes .................................................................................... 51

IV.1.3. Les composs acides : acides organiques................................................... 50

III.5.1. Concentration cellulaire ............................................................................. 39

III.4.2. Les fermenteurs du laboratoire de gnie chimique de Toulouse................ 38

- Dosage colorimtrique acide tartrique par kit mono ractif .............. 42

IV.2. Equations du modÈle du calcul du pH................................................................... 57

IV.2.1. Notion de potentiel dhydrogÈne (pH) ....................................................... 57

IV.2.2. Loi de conservation de la matiÈre .............................................................. 59

IV.2.2.1.

Lammoniac ............................................................................. 60

IV.2.2.2. Les acides organiques .............................................................. 61

IV.2.2.3. les acides amins ...................................................................... 61

IV.2.3. Equations constitutives............................................................................... 62

IV.2.3.1. Masse volumique ..................................................................... 62

IV.2.3.2. Notion de force ionique............................................................ 63

IV.2.3.3.

Evaluation du coefficient dactivit ......................................... 63

i. Loi de Debye-Hückel ..................................................................... 64

ii. Convention de MacInnes................................................................ 65

IV.2.3.4. Constante dilectrique .............................................................. 66

IV.2.3.5. Constantes de dissociation des acides organiques ................... 67

IV.2.4. Equations de contraintes............................................................................. 69

IV.2.4.1. Equations dquilibres chimiques ............................................ 69

i. Acides organiques .......................................................................... 69

ii. Les acides amins ........................................................................... 70

iii. Dissociation de leau ...................................................................... 71

IV.2.4.2. Electroneutralit dune solution ............................................... 71

IV.3. Formulation et rsolution du modÈle .................................................................... 72

IV.3.1. Formulation du modÈle .............................................................................. 72

IV.3.2. Mthode de rsolution et diagramme du modÈle ....................................... 75

IV.4. Validation du modÈle ............................................................................................ 76

IV.4.1. Simulation du pH de milieux synthtiques composs................................ 76

IV.4.2. Ajout de composs À diffrentes concentrations sur moÛt rel .................. 78

IV.4.3. Ethanol : Comparaison pH mesur et simul ............................................. 78

IV.4.4. Acides organiques : Comparaison pH mesur et simul............................ 79

IV.5. Conclusion............................................................................................................. 80

Application du modÈle de calcul du pH.................................................. 81

+ V.1. Fermentation sur moÛt synthtique avec NH4 comme seule source azote........ 81

V.1.1. Rsultats et discussion................................................................................ 82

V.1.2. Comparaison pH exprimental et simul ................................................... 83

V.2. Fermentation sur moÛt synthtique avec des acides amins comme seule

source azote ......................................................................................................... 85

V.2.1. Rsultats de la fermentation et discussions ................................................ 85

V.2.2. HypothÈses sur limpact de lassimilation des acides amins sur lvolution

du pH. ......................................................................................................... 91

V.2.3. Simulation de la cintique du pH exprimental ......................................... 94

+ V.3. Fermentation sur moÛt synthtique contenant du NH4 et des acides

amins : milieu MS300 ......................................................................................... 95

V.3.1. Rsultats de la fermentation et discussions ................................................ 96

V.3.2. Analyse comparative des cintiques sur les trois milieux synthtiques de

fermentation ............................................................................................... 97

V.3.3. Evaluation de la proportion des acides amins en fonction de leur charge.

.................................................................................................................... 99

References bibliographiques ......................................................................... 110

.................................................................................................................. 103

V.4.3. Simulation de la cintique du pH exprimental ....................................... 104

V.4. Cas de la fermentation alcoolique sur moÛt rel ................................................. 100

V.4.1. Rsultats de la fermentation et discussions .............................................. 101

V.3.4. Simulation de la cintique du pH exprimental ......................................... 99

V.4.2. Evaluation de la proportion des acides amins en fonction de leur charge

VI.107Conclusions et perspectives ...................................................................

Annexe ............................................................................................................. 121

LISTE DE FIGURES Figure II.1. Flux diffusif selon la loi de Fick (http://www.sciencebio.com/FacBio/BioCell/Membrane/FBMF5.htm) 23 + +. Figure II.2. Schma dun transports actif primaire : cas de la pompe Na -K On a une sortie + + de 3 Na pour une entre de 2 K . 25 Figure II.3. Schma dun transports actif secondaire : antiport et symport actifs 25 Figure II.4. Simulation du taux spcifique de production de protons (qH+, mmol h-1 par g de biomasse). Source dazote : ion ammonium (Castrillo J.I et coll., 1995). 28 Figure II. 5.Schma de fonctionnement de luniport lectrophortique accumulatif responsable de lentre de lion ammonium chez Saccharomyces cerevisiae (Salmon J.M., 1998). 28 Figure II.6.Schma de fonctionnement du symport lectrophortique accumulatif responsable de lentre dacide amin chez Saccharomyces cerevisiae (Salmon J.M., 1998). 32 Figure III.1.38Les diffrents types de fermenteurs utiliss dans cette tude. Figure III.247. Correction du CO2 dgag par extrapolation linaire Figure. IV.1.Cintique classique du pH lors dune fermentation alcoolique sur du moÛt de raisins blancs par Saccharomyces cerevisiae (pH initial : 3,32 ; Temprature : 20C) 48 Figure IV.2.Evolution du pH en fonction du degr alcoolique du moÛt de raisins blancs. Test ralis À 20C. 50 Figure IV.3.Test dajout dacide succinique dans un moÛt de raisins blancs À diffrents degrs dalcool ralis À 20C. (pH À 0,05). 51 + Figure. IV.4.Courbe de titrage acido-basique de 1L de solution À 1M de NH4: volution des proportions des formes acido-basiques. 52 Figure. IV.5.Evolution des proportions des formes acido-basiques des acides alpha amins. ! ## Figure IV.6.Digramme de calcul du pH de moÛts synthtiques et naturels 76 Figure.V.1. Evolution de lthanol, de la biomasse, du dioxyde de carbone, du pH et de lammonium au cours de la fermentation alcoolique sur milieu MS_NH4. 82 Figure.V.2. Evolution de lacide malique, de lacide citrique, de lacide succinique, de lacide actique et du pH au cours de la fermentation alcoolique sur milieu MS_NH4. 82 Figure. V.3. Comparaison des volutions de pH exprimental et simul. Fermentation sur milieu MS_NH4. 84 Figure.V.4.Evolution de lthanol, de la biomasse, du dioxyde de carbone, du pH et de lammonium au cours de la fermentation alcoolique sur milieu MS_AA. 86 Figure.V.5. Evolution de lacide malique, de lacide citrique, de lacide succinique, de lacide actique et du pH au cours de la fermentation alcoolique sur milieu MS_AA. 86 Figure.V.6.a.Taux davancement de la consommation des acides amins mono acide et mono amine 88 Figure.V.6.b.Taux davancement de la consommation des acides amins di acides et leur amides 88 Figure.V.6.c.Taux davancement de la consommation des acides amins di amins et de la proline 89

Figure.V.6.d.Taux davancement de la consommation des acides amins aromatiques et soufrs 89 Figure. V.7. Comparaison des volutions de pH exprimental et simul. Fermentation sur milieu MS_AA : cas de lhypothÈse 2. 92 Figure. V.8. Comparaison des volutions de pH exprimental et simul. Fermentation sur milieu MS_AA : cas de lhypothÈse 3. 95 Figure.V.9. Evolution de lthanol, de la biomasse, du dioxyde de carbone, de lammonium, de lazote alpha amin et du pH au cours de la fermentation alcoolique sur milieu MS_300. 96 Figure.V.10. Evolution de lacide malique, de lacide citrique, de lacide lactique, de lacide succinique, de lacide actique et du pH au cours de la fermentation alcoolique sur milieu MS_300. 96 Figure V.11.Evolution du pH au cours dune fermentation alcoolique sur diffrentes sources azotes. () acides amins ; () ions ammonium ; (X) acides amins + ions ammonium. DaprÈs M.J. Torija et coll. (2003) Manque 1 courbe. 98 Figure. V.12. Comparaison des volutions de pH exprimental et simul. Fermentation sur milieu MS300. 100 Figure.V.13. Evolution des sucres totaux, de lthanol, de la biomasse, du dioxyde de carbone, de lammonium, de lazote alpha amin et du pH au cours de la fermentation alcoolique sur milieu MR. 101 Figure.V.14. Evolution du glycrol, de lacide malique, de lacide citrique, de lacide succinique, de lacide actique et du pH au cours de la fermentation alcoolique sur milieu MR. 101 Figure. V.15. Comparaison des cintiques du pH exprimental et simul. Fermentation sur milieu MR. 105

LISTE DE TABLEAUX Tableau II.1. Produits secondaires forms parS. cerevisiaeÀ diffrents pH du moÛt. 6 Tableau II.2. Fractions azotes de moÛts de raisins. 14 Tableau II.3. Composition moyenne en acides amins de moÛts Australiens (daprÈs Gockowiak et Henschke) 15 Tableau II.4.16les 20 Acides amins essentiels Tableau II.5.Rcapitulatif des systÈmes de transport des acides amins chez saccharomyces cerevisiae. Le nombre de protons changs par types de transporteurs est aussi indiqu. 31 Tableau III.1.34Composition du milieu Levain Tableau III.2.34Composition du milieu de pr-levain Tableau III.3.35Composition du milieu Levain Tableau III.4.Composition du milieu synthtique de base. 36 Tableau III.5.Composition en matiÈre azote des milieux synthtiques 36 Tableau III.637. Composition du moÛt de raisins blancs fournie par SOPAGLY Tableau III.7.Tampons de citrate de lithium(www.biochrom.uk) utiliss dans le dosage des acides amins au Biochrom 30 46 Tableau IV.1.Evolution du pH en fonction de la concentration en ions ammonium du moÛt de raisins blancs. Test ralis À 20C. (pH prcision : 0,05). 53 Tableau IV.2.Liste des 20 acides amins reprsents dans le code gntique avec leur pK dans une solution aqueuse. (Jukes T.H. et Schmidt L.A. (1934)) 56 Tableau IV.3.ParamÈtres de calcul de coefficients de dissociation dacides organiques. T=20C in water-ethanol solution, ** T=25C in water (Usseglio-Tomasset and Bosia, 1978) 69 Tableau IV.4.72Variables intervenant dans le modÈle de calcul du pH. Tableau IV.5: systÈme dquations À rsoudre. Les fonctions mi(mH+,I) sont consignes dans le tableau IV.4. 75 Tableau IV.6.Comparaison pH exprimentaux et calculs de diffrents milieux synthtiques 77 Tableau IV.7.Comparaison du pH exprimental et simul par le modÈle en fonction de la concentration en thanol 78 Tableau IV.8.Comparaison du pH exprimental et simul par le modÈle en fonction de la concentration en acide succinique À 0 et À 12% dthanol. 79 Tableau V.1.Quantit dazote assimilable apporte par chacun des acides amins dans le milieu MS_AA. 90 Tableau V.2.Proportions des acides amins suivant leur charge dans le milieu MS_AA initial au pH de 3,23 93 Tableau V.3.94Concentration dacides amins en fonctions de leur charge. Tableau V.4. Proportions dacides amins en fonctions de leur charge dans le milieu MS300 ; pH initial gal À 3,42. 99 TableauV.5.Comparaison des proportions dacides amins selon le milieu. 103 Tableau V.6. Proportions dacides amins en fonctions de leur charge dans le milieu MR; pH initial gale À 3,32. 104

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