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PICINPlateforme d’Imagerie Celllluullaaiirreede l’IFR de NeurosciencesEtude des interactions moléculaires par FRETPICINPlateforme d’Imagerie Celllluullaaiirreede l’IFR de NeurosciencesEtude des interactions moléculaires par FRETFRET = Förster Resonant Energy Transfer= transfert d’énergie non radiatif dépendant de la distance entre un donneur à l’état excité et un accceeppteur Mesure du FRET par intensité- par analyse spectrale- par émission Technique du photoblanchiment de l’accepteur Mesure de la durée de vie de fluorescence PICINPlateforme d’Imagerie Celllluullaaiirreede l’IFR de NeurosciencesFRET: Comment ça marche?Technique pour mettre en évidence les interactions entre deux macro-moléculesQuand il y a interaction la distance entre les deuxfluorochromes diminue et il peut y avoir du FRET.Si llaa distanccee entre lleess deux mmoolécules eest tropimportante il ne peut y avoir de transfert, donc pas deFRET. Le donneur transfère son énergie àl’accepteur. L’accepteur émet de la fluorescencesuite à l’excitation du donneur. Le donneur se désexcite préférentiellementDonor Acceptorde manière non radiative c a d sans émission defluorescence fluorescencephotons.PICINPlateforme d’Imagerie Celllluullaaiirreede l’IFR de NeurosciencesLes conditions pour avoir du FRETDonorAcceptoremissionexcitation Chevauchement des spectresd’émission du donneur et d’excitation del’accepteur Dissttaance eennttre le donneur etl’accepteur doit ...

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• Publié par: Jitap
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• Langue: Français

Extrait

edutEdes interactions moléculaires par FRET ICIPN Plateforme d’Imagerie Cellulaire de l’IFRde Neurosciences

Etude des interactions moléculaires par FRET FRET = Förster Resonant Energy Transfer = transfert d’énergie non radiatif dépendant de la distance entre un donneur à l’état excité et un accepteur
Mesure du FRET par intensité -par analyse spectrale -par émission
Technique du photoblanchiment de l’accepteur
Mesure de la durée de vie de fluorescence NICIP Plateforme d’Imagerie Cellulaire de l’IFRde Neurosciences

ronoD fluorescence FRET: Comment ça marche? Technique pour mettre en évidence les interactions entre deux macro-molécules NICIP Plateforme d’Imagerie Cellulaire de l’IFRde Neurosciences
Quandilyainteractionladistanceentrelesdeux fluorochromesdiminueetilpeutyavoirduFRET.
Siladistanceentrelesdeuxmoléculesesttrop importanteilnepeutyavoirdetransfert,doncpasde .TERF Acceptor fluorescence
Ledonneurtransfèresonénergieà l’accepteur.L’accepteurémetdelafluorescence suiteàl’excitationdudonneur.
Ledonneursedésexcitepréférentiellement demanièrenonradiativecadsansémissionde photons.

Les conditions pour avoir du FRET
Chevauchementdesspectres d’émissiondudonneuretd’excitationde l’accepteur
Distanceentreledonneuret l’accepteurdoitêtreinférieureà100Å
Orientationentrelesdipôles électroniquesdudonneuretde l’accepteurdoitêtrefavorable ronoD emission Acceptor excitation NICIP Plateforme d’Imagerie Cellulaire de l’IFRde Neurosciences

Efficacité de FRET et distance NICIP Plateforme d’Imagerie Cellulaire de l’IFRde Neurosciences E= Efficacité de transfert= proportion des molécules donneur qui vont passer de l’état excité à l’état fondamental par FRET R= distance entre le donneur et l’accepteur Ro= distance de Förster = distance entre les chromophores pour laquelle il y a 50% d’efficacité de transfert distance Plus Ro est grand plus la probabilité d’avoir du FRET entre les fluorophores sera importante

Efficacité de FRET et distance Exemple de paires de fluorochromes Donneur Fluorescein -yC3 Alexa 488 Alexa 546 Alexa 594 PFC PFG Accepteur Tetramethylrhodamine 5-yC Alexa 568 Alexa 594 Alexa 647 PFY deRsD Ro (Å) 55-94 35 26 17 58 49 74 NICIP Plateforme d’Imagerie Cellulaire de l’IFRde Neurosciences LesvaleursRo(enÅ)représenteladistancepourlaquelleona50% d’efficacitédetransfertd’énergieentreledonneuretl’accepteur.

’S 1 S o Bref rappel sur la fluorescence S 1 KK rrn Donneur TERF K TERF Accepteur Longueur d’onde (nm) vh NICIP Plateforme d’Imagerie Cellulaire de l’IFRde Neurosciences TERF TERF Population des molécules -donneur seul -donneur en interaction -accepteur seul  Compétition entre les différents processus de désexcitation

Cas du FRET intramoléculaire Ex : sonde caméléon, biosenseur pour le Ca 2+ Si les deux fluorochromes sont proches
FRET Si les deux fluorochromes sont éloignés de plus d’une dizaine de nanomètres
Absence de FRET NICIP Plateforme d’Imagerie Cellulaire de l’IFRde Neurosciences

Cas du FRET intermoléculaire NICIP Plateforme d’Imagerie Cellulaire de l’IFRde Neurosciences Si pas de FRET, ce n’est pas forcément parce qu’on a pas d’interactions de nos molécules d’intérêt Si les deux fluorochromes sont proches
FRET Si les deux fluorochromes sont éloignés de plus d’une dizaine de nanomètres
Absence de FRET

Précautions pour faire du FRET NICIP Plateforme d’Imagerie Cellulaire de l’IFRde Neurosciences Avoiruneconnaissancedelastructuredesprotéinesd’intérêtetde leursdomainesd’interactionpourplacerjudicieusementles fluorochromesFRET(sansperturberlesdomainesd’interaction)  Disposerd’outilspermettantdeperturberl’interactionprotéique (ex:mutationsurlesdomainesd’interaction,ouutilisationdeligand…)  Disposerd’autresapprochesd’étuded’interactionsprotéiques(co- immunoprécipitaion,microscopieélectronique,BiaCore,,…)

NICIP de l’IFRde Neurosciences Quels échantillons pour faire du FRET ? Plateforme d’Imagerie Cellulaire  Échantillon avec donneur seul Échantillon avec accepteur seul Échantillon FRET avec donneur + accepteur  Échantillon contrôle négatif: donneur + accepteur ayant une colocalisation parfaite mais pas d’interaction Échantillon contrôle positif: par exemple tandem GFP-mCherry