(cours-fret [Mode de compatibilit  351])
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PICINPlateforme d’Imagerie Celllluullaaiirreede l’IFR de NeurosciencesEtude des interactions moléculaires par FRETPICINPlateforme d’Imagerie Celllluullaaiirreede l’IFR de NeurosciencesEtude des interactions moléculaires par FRETFRET = Förster Resonant Energy Transfer= transfert d’énergie non radiatif dépendant de la distance entre un donneur à l’état excité et un accceeppteur Mesure du FRET par intensité- par analyse spectrale- par émission Technique du photoblanchiment de l’accepteur Mesure de la durée de vie de fluorescence PICINPlateforme d’Imagerie Celllluullaaiirreede l’IFR de NeurosciencesFRET: Comment ça marche?Technique pour mettre en évidence les interactions entre deux macro-moléculesQuand il y a interaction la distance entre les deuxfluorochromes diminue et il peut y avoir du FRET.Si llaa distanccee entre lleess deux mmoolécules eest tropimportante il ne peut y avoir de transfert, donc pas deFRET. Le donneur transfère son énergie àl’accepteur. L’accepteur émet de la fluorescencesuite à l’excitation du donneur. Le donneur se désexcite préférentiellementDonor Acceptorde manière non radiative c a d sans émission defluorescence fluorescencephotons.PICINPlateforme d’Imagerie Celllluullaaiirreede l’IFR de NeurosciencesLes conditions pour avoir du FRETDonorAcceptoremissionexcitation Chevauchement des spectresd’émission du donneur et d’excitation del’accepteur Dissttaance eennttre le donneur etl’accepteur doit ...

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Langue Français

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edutEdes interactions moléculaires par FRETICIPNPlateforme d’Imagerie Cellulairede l’IFRde Neurosciences
Etude des interactions moléculaires par FRETFRET = Förster Resonant Energy Transfer= transfert d’énergie non radiatif dépendant de la distance entre un donneur à l’état excité et un accepteurMesure du FRET par intensité-par analyse spectrale-par émission Technique du photoblanchiment de l’accepteurMesure de la durée de vie de fluorescence NICIPPlateforme d’Imagerie Cellulairede l’IFRde Neurosciences
ronoDfluorescenceFRET: Comment ça marche?Technique pour mettre en évidence les interactions entre deux macro-moléculesNICIPPlateforme d’Imagerie Cellulairede l’IFRde NeurosciencesQuandilyainteractionladistanceentrelesdeuxfluorochromesdiminueetilpeutyavoirduFRET.Siladistanceentrelesdeuxmoléculesesttropimportanteilnepeutyavoirdetransfert,doncpasde.TERFAcceptorfluorescenceLedonneurtransfèresonénergieàl’accepteur.L’accepteurémetdelafluorescencesuiteàl’excitationdudonneur.Ledonneursedésexcitepréférentiellementdemanièrenonradiativecadsansémissiondephotons.
Les conditions pour avoir du FRETChevauchementdesspectresd’émissiondudonneuretd’excitationdel’accepteurDistanceentreledonneuretl’accepteurdoitêtreinférieureà100ÅOrientationentrelesdipôlesélectroniquesdudonneuretdel’accepteurdoitêtrefavorableronoDemissionAcceptorexcitationNICIPPlateforme d’Imagerie Cellulairede l’IFRde Neurosciences
Efficacité de FRET et distanceNICIPPlateforme d’Imagerie Cellulairede l’IFRde NeurosciencesE= Efficacité de transfert= proportion des molécules donneur qui vont passer de l’état excité à l’état fondamental par FRETR= distance entre le donneur et l’accepteurRo= distance de Förster = distance entre les chromophores pour laquelle il y a 50% d’efficacité de transfertdistancePlus Ro est grand plus la probabilité d’avoir du FRET entre les fluorophores sera importante
Efficacité de FRET et distanceExemple de paires de fluorochromesDonneurFluorescein-yC3Alexa 488Alexa 546Alexa 594PFCPFGAccepteurTetramethylrhodamine5-yCAlexa 568Alexa 594Alexa 647PFYdeRsDRo (Å)55-94352617584974NICIPPlateforme d’Imagerie Cellulairede l’IFRde NeurosciencesLesvaleursRo(enÅ)représenteladistancepourlaquelleona50%d’efficacitédetransfertd’énergieentreledonneuretl’accepteur.
S1SoBref rappel sur la fluorescenceS1KKrrnDonneurTERFKTERFAccepteurLongueur d’onde (nm)vhNICIPPlateforme d’Imagerie Cellulairede l’IFRde NeurosciencesTERFTERFPopulation des molécules-donneur seul-donneur en interaction-accepteur seulCompétition entre les différents processus de désexcitation
Cas du FRET intramoléculaireEx : sonde caméléon, biosenseur pour le Ca2+Si les deux fluorochromes sont proches FRETSi les deux fluorochromes sont éloignés de plus d’une dizaine de nanomètres Absence de FRETNICIPPlateforme d’Imagerie Cellulairede l’IFRde Neurosciences
Cas du FRET intermoléculaireNICIPPlateforme d’Imagerie Cellulairede l’IFRde NeurosciencesSi pas de FRET, ce n’est pas forcément parce qu’on a pas d’interactions de nos molécules d’intérêtSi les deux fluorochromes sont proches FRETSi les deux fluorochromes sont éloignés de plus d’une dizaine de nanomètres Absence de FRET
Précautions pour faire du FRETNICIPPlateforme d’Imagerie Cellulairede l’IFRde NeurosciencesAvoiruneconnaissancedelastructuredesprotéinesd’intérêtetdeleursdomainesdinteractionpourplacerjudicieusementlesfluorochromesFRET(sansperturberlesdomainesd’interaction)Disposerd’outilspermettantdeperturberl’interactionprotéique(ex:mutationsurlesdomainesd’interaction,ouutilisationdeligand…)Disposerd’autresapprochesd’étuded’interactionsprotéiques(co-immunoprécipitaion,microscopieélectronique,BiaCore,,…)
NICIPde l’IFRde NeurosciencesQuels échantillons pour faire du FRET ?Plateforme d’Imagerie CellulaireÉchantillon avec donneur seulÉchantillon avec accepteur seul Échantillon FRET avec donneur + accepteur Échantillon contrôle négatif: donneur + accepteur ayant une colocalisation parfaite mais pas d’interactionÉchantillon contrôle positif: par exemple tandem GFP-mCherry
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