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Universidad de Salamanca Departamento de Microbiología y Genética Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer
CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE
LAS FOSFATASAS Cdc14 HUMANAS EN
LA REGULACIÓN DEL CICLO DE
DIVISIÓN CELULAR
Tesis Doctoral
María Dolores Vázquez Novelle
Salamanca, 2008
Directores: Dra. María P. Sacristán Martín Dr. A. Avelino Bueno Núñez
Universidad de Salamanca
Departamento de Microbiología y Genética
Instituto de Biología Molecular y
Celular del Cáncer
Tesis Doctoral: Caracterización funcional de las fosfatasas Cdc14 humanas en la regulación del ciclo de división celular
Doctorando:María Dolores Vázquez Novelle
Directores: Dr. A. Avelino Bueno Núñez, Catedrático de Microbiología. Dpto. de Microbiología y Genética de la Facultad de Biología de la Universidad de Salamanca Dra. María P. Sacristán Martín, Profesora Contratada-Doctora Permanente de laUniversidad de Salamanca
Fdo.: Mª Dolores Vázquez Fdo.: María P. Sacristán Fdo.: A. Avelino Bueno
SUMARIO
AGRADECIMIENTOS
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN
I.
II.
III.
IV.
V.
VI.
CICLO CELULAR
REGULACIÓN DEL CICLO CELULAR
MITOSIS
REGULACIÓN DE LA ENTRADA EN MITOSIS
REGULACIÓN DE LA SALIDA DE MITOSIS: DESDE ANAFASE HASTA CITOQUINESIS
FOSFATASAS DE LA FAMILIA Cdc14
OBJETIVOS
RESULTADOS
HOMOLOGÍA FUNCIONAL ENTRE LAS FOSFATASAS Cdc14 HUMANAS, hCdc14A Y hCdc14B, Y Flp1 DESchizosaccharomyces pombe
I.
II.
III.
IV.
LAS FOSFATASAS hCdc14A Y hCdc14B COMPLEMENTAN LA + CARENCIA DEL GENflp1ENS. pombe
LA PROTEÍNA hCdc14A ES CAPAZ DE DESFOSFORILAR A Cdc25 DES. pombe
LAS PROTEÍNAS HUMANAS hCdc14A Y hCdc14B INTERACCIONAN in vivoCON Cdc25 DES. pombe
EFECTOS DE LA SOBRE-EXPRESIÓN DE LAS FOSFATASAS hCdc14A O hCdc14B EN LA LEVADURA DE FISIÓNS. pombe
ESTUDIO DE LAS FUNCIONES DESEMPEÑADAS POR hCdc14A EN LA REGULACIÓN DEL CICLO DE DIVISIÓN DE CÉLULAS HUMANAS
I.
LAS FOSFATASAS Cdc25 HUMANAS: POSIBLES SUSTRATOSin vitroDE hCdc14A Y hCdc14B
II.
III.
FUNCIÓN DESEMPEÑADA POR hCdc14A EN LA REGULACIÓN DE LA TRANSICIÓN G2/M EN CÉLULAS HUMANAS
FUNCIÓN DESEMPEÑADA POR hCdc14A EN LA REGULACIÓN DE LA SALIDA DE MITOSIS EN CÉLULAS HUMANAS
DISCUSIÓN
I.
II.
III.
IV.
CONSERVACIÓN EVOLUTIVA DE LAS PROTEÍNAS Cdc14
hCdc14A REGULA LA ENTRADA EN MITOSIS A TRAVÉS DE hCdc25A
FUNCIÓN DESEMPEÑADA POR hCdc14A EN LA REGULACIÓN DE LA SALIDA DE MITOSIS
POSIBLES FUNCIONES DE hCdc14B
CONCLUSIONES
MATERIALES Y MÉTODOS
I.
II.
III.
IV.
V.
VI.
VII.
CULTIVO Y TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS DES. pombe
CULTIVO Y TRANSFECCIÓN DE LÍNEAS CELULARES HUMANAS
TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
CITOMETRÍA DE FLUJO (FACS)
ANÁLISIS DE PROTEÍNAS
PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS FUSIONADAS A GST
INMUNOPRECIPITACIÓN
VIII. ENSAYOSin vitro: ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD QUINASA Y/O FOSFATASA
IX.
X.
INMUNOCITOQUÍMICA
PURIFICACIÓN DE CENTROSOMAS
BIBLIOGRAFÍA
ABREVIATURAS
Agradecimientos
Supongo que todo el mundo se imagina que esta Tesis Doctoral, no sólo es un trabajo científico, sino un período muy importante de mi vida. Todo comenzó hace algunos años en Santiago de Compostela, cuando tomé la decisión de empezar en esto de la
investigación científica (¿recuerdas Miri?), sin saber aún muy bien en qué consistía. A día de hoy no me arrepiento en absoluto de aquella determinación de venir a Salamanca para formar parte del laboratorio de Avelino. Y creo que esto no se debe sólo a mi gusto por
este trabajo, sino también a las experiencias personales que he vivido aquí y, sobre todo,
a las personas que he tenido la suerte de conocer. Por esta razón quiero agradeceros a todos los que habéis compartido conmigo estos años, de una u otra forma, el haber estado ahí y ser como sois. Gracias:
En primer lugar, a Avelino y María por darme la oportunidad de formar parte de este grupo, en el que he aprendido y disfrutado a partes iguales. También a ambos, y en
especial a María, gracias por haber dedicado parte de tu tiempo a enseñarme y por las largas conversaciones sobre Ciencia que hacen que esto sea mucho más que un trabajo.
A los “Buenos” que ya no están en el labo, pero sí en mi vida. A Vero, por tus múltiples consejos y explicaciones, por ser tan buena “maestra”. A Viole, por tu dulzura, por aportarme la tranquilidad que necesito a veces y por regalarme momentos muy especiales. A Juanjín, mi “novio putativo”, gracias por esa capacidad tuya para arrancarme una sonrisa en los momentos bajos, por los bailes, los viajes, los pinchos, etc...,e incluso por las lágrimas compartidas y las escenas de tipo “la madre de la Pantoja” que hemos
pasado juntos, ya sabes que para mí eres muy grande.
A los que sí estáis en el laboratorio. A Arturez por dar “vidilla” (a veces demasiada.., je, je) en esos tiempos de espera, por tu sentido del humor y por ser tan buen ejemplo como científico. A Sandrix y Xonix, porque las dos me habéis cuidado un montón (gracias por esos bizcochos tan buenos MariXonix) y aconsejado siempre que lo he necesitado
dentro y fuera del laboratorio, ya sabéis que me tenéis para lo que queráis y que os adoro.
A Pilar, por ser tan maja y aportar ese punto de ingenuidad que te hace especial y que es
tan necesario a veces. A Helenilla, por esa conexión y las “vidas paralelas”, por las bañeritas y conversaciones trascendentales (referencia cruzada) y por la “vena” filosófica que compartimos, gracias por entenderme tan bien. Laura y Teresa, aunque no haya
coincidido mucho tiempo con vosotras, me parecéis un gran “fichaje”; ah! y muchas gracias por esas gestiones transatlánticas Laura. A Alfonsito, por ser un “bichín-jerbín” tan tierno, porque has sido un gran descubrimiento inesperado, por ser como eres, por
compartir tanto tiempo conmigo en los últimos meses y porque sabes que te quiero mucho.
A los “Morenos-as” y también a los ex-, como Álvaro y Bea, por formar parte de esta aventura. A Carlos, Martín y Pablo por la resolución de múltiples problemas con aparatos
como la “máquina del demonio”.
A todos los que habéis estado conmigo en algunas de mis vivencias salmantinas (e incluso holandesas e italianas) fuera del CIC, a David, Antonio, Inda, Katherine, Sonia, Alicia, Inma y Clarita, por esos momentos de ocio, por las múltiples fiestas, por haberme hecho reír tanto, y también, por esas conversaciones profundas. Muchas gracias a Nuri, por haber sido mi compi de piso durante dos años y por aportarme tu alegría en muchas ocasiones.
A mis amigas de siempre, a Gracia, Lisa, Marta, Sonia, Triski, y también a Miriam y a
Belén “pitiña”, porque estar con todas vosotras me hace sentir como en casa y por vuestra visión del mundo “exterior” (fuera del laboratorio) que me aporta otra perspectiva. Muchas gracias por estar siempre ahí, aunque muchas veces tenga que ser a través del teléfono, y
por tantos momentos inolvidables.
Por último, a mi “pinkie”-familia, a mi madre, a mi padre y a Lucía. Aquí sí que no hay
palabras..., por vuestro apoyo incondicional, porque todo lo bueno que pueda tener os lo debo a vosotros, por confíar en mí siempre y apoyarme en mis decisiones, aunque eso suponga a veces verme con menos frecuencia. Gracias por quererme como soy, dándome
amor y libertad a partes iguales. Os quiero un montón.
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